PLoS ONE: Tumor Associated makrofager Protect Colon Cancer Cells fra TRAIL-induceret apoptose gennem IL-1β- Afhængig Stabilisering af Snail i Tumor Cells

Abstrakt

Baggrund

Vi rapporterede for nylig, at kolon tumor celler stimulere makrofager til at frigive IL-1β, hvilket igen inaktiverer GSK3p og forbedrer Wnt signalering i colon cancerceller, hvilket genererer en selvforstærkende loop, der fremmer væksten af ​​tumorceller.

vigtigste resultater

Her beskriver vi, at makrofager beskytte HCT116 og HKE-3 tyktarmscancerceller fra TRAIL-induceret apoptose. Inaktivering af IL-1β ved at neutralisere IL-1β-antistof, eller inaktivering af IL-1β i makrofager hæmmede deres evne til at modvirke TRAIL-induceret apoptose. Følgelig IL-1β var tilstrækkelig til at inhibere TRAIL-induceret apoptose. TRAIL-induceret kollaps af den mitokondriske membranpotentiale (Δψ) og aktivering af caspaser blev forhindret af makrofager eller ved rekombinant IL-1β. Farmakologisk hæmning af IL-1β frigørelse fra makrofager ved vitamin D

3, en potent kemoforebyggende middel for tarmkræft, restaureret evne TRAIL at inducere apoptose af tumorceller dyrket med makrofager. Makrofager og IL-1β inhiberede ikke TRAIL-induceret apoptose i HCT116 celler, der udtrykker dnIκB, dnAKT eller dnTCF4, bekræfter, at de er imod TRAIL-induceret celledød gennem induktion af Wnt-signalering i tumorceller. Vi viste, at makrofager og IL-1β stabiliseret Snail i tumorceller i en NF-KB /Wnt afhængig måde, og at sneglen deficiente tumorceller blev ikke beskyttet mod TRAIL-induceret apoptose af makrofager eller med IL-1β, hvilket viser en afgørende rolle Snail i modstanden af ​​tumorceller til spor

betydning

Vi har identificeret en positiv spiral mellem tumorceller og makrofager, der udbreder væksten og fremmer overlevelsen af ​​kolon kræftceller:. tumorceller stimulerer makrofager til at udskille IL-1β, hvilket igen fremmer Wnt signalering og stabiliserer Snail i tumorceller, der giver resistens til TRAIL. D-vitamin

3 stopper denne forstærkende loop ved at gribe ind med udgivelsen af ​​IL-1β fra makrofager. Følgelig vitamin D

3 sensibiliserer tumorcellerne TRAIL-induceret apoptose, hvilket tyder på, at den terapeutiske effektivitet af TRAIL kunne forøges ved denne lettilgængelige kemoforebyggende middel

Henvisning:. Kaler P, Galea V, Augenlicht L , Klampfer L (2010) Tumor Associated makrofager Protect Colon Cancer Cells fra TRAIL-induceret apoptose gennem IL-1β- Afhængig stabilisering af Snail i tumorceller. PLoS ONE 5 (7): e11700. doi: 10,1371 /journal.pone.0011700

Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 13. april, 2010; Accepteret: 27. juni, 2010; Udgivet: Juli 22, 2010

Copyright: © 2010 Kaler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CA 111.361 (til LK), U54 CA 100.926 (til LA) og P30-13330 fra National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inflammation bidrager til tumorprogression ved at etablere betingelser, der understøtter tumorcellevækst og overlevelse og øge deres metastatiske potentiale. Faktisk har kronisk inflammation blevet vist at prædisponere for udvikling af en lang række tumorer, en slående eksempel er inflammatorisk tarmsygdom, som er forbundet med forhøjet risiko for tyktarmskræft [1]. Desuden fremgår det, at tyktarmskræft, der ikke udvikler som en komplikation af inflammatorisk tarmsygdom også er motiveret af inflammation, fordi det er blevet vist, at regelmæssig anvendelse af NSAID’er sænker dødeligheden af ​​sporadisk tyktarmskræft og resulterer i regression af adenomer i FAP-patienter , der arver en mutation i APC-genet [2]. Opløselige faktorer der udbreder betændelse kan fremstilles ved tumorcellerne selv eller oftere, ved hjælp af celler rekrutteret til tumoren mikromiljøet såsom tumorassocierede makrofager (TAM’er). Koordineret signalering mellem tumorceller og ikke-maligne celler i tumormikromiljøet er påkrævet for progression af tumorer, og signalveje, der regulerer krydstale mellem colon tumorceller og stroma, såsom NF-KB og STAT3, er dukket op som vigtige mål for kemoforebyggende og kemoterapeutiske midler [3], [4]. Ligeledes TNFa antagonister er i fase I /II kliniske forsøg og har vist sig at være veltolereret i patienter med solide tumorer [5], [6].

Vi har for nylig fastslået, at makrofager fremmer Wnt signalering i tyktarmskræft celler og dermed forbedre deres spredning, og viste, at makrofager udøver deres protumorigenic aktivitet primært gennem frigivelse af IL-1β [7], [8]. Her viser vi, at makrofag-afledte faktorer, ud over at understøtte væksten af ​​tumorceller, også fremme deres overlevelse efter behandling med TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL), en potent initiator af den ydre vej af apoptose.

TRAIL initierer apoptose ved binding til to dødsreceptorer, DR4 og DR5, mens binding til afledningsindretningen receptorer, som mangler dødsdomænet, såsom DcR1, DcR2 og osteoprotegerin, hæmmer dets pro-apoptotiske aktivitet [9]. Binding af TRAIL til døden fremkaldende receptorer DR4 /DR5 resultater i rekrutteringen af ​​Fas associeret død domæne (FADD) til receptorerne, som initierer binding af procaspase-8 og procaspase-9, og dannelsen af ​​døden overtalelse signalering kompleks (DISC) [9]. I type I celler, caspase-8-aktivering er tilstrækkelig til at aktivere effektor-caspaser 3, 6 og 7, mens der i type II-celler, den apoptotiske kaskade kræver integration af det mitokondrielle pathway medieret af caspase-8-induceret spaltning af Bid.

Tumor celler er betydeligt mere følsomme over for TRAIL-induceret apoptose end normale celler, oprettelse TRAIL og DR4 eller DR5 agonistiske antistoffer som attraktive anti-cancer medicin. Faktisk, i skarp kontrast til andre medlemmer af TNF-familien, behandling af mus og primater med rekombinant TRAIL inducerede signifikant regression af tumorer uden systemisk toksicitet [10], [11]. For nylig er kombination af TRAIL med alle trans-retinylacetat (RAC) vist sig at inducere apoptose selektivt i adenomatøs polypose (APC) deficient epitelcelle uden at skade normale cellsαα og behandling af Apc

Min

mus med TRAIL og RAC induceret apoptose i polypper i tarmen og langvarig dyr overlevelse [12].

der er dog betydelige forskelle i TRAIL følsomhed blandt humane cancerceller. Resistens mod TRAIL har vist sig at udvikle sig i celler med mutant DR5 [13] eller i mismatch reparation deficiente tumorer med Bax mutationer [14]. I modsætning hertil c-Myc fremmer reaktionen på TRAIL ved at hæmme ekspression af FLIP, en inhibitor af TRAIL signalering [15], og ved at modvirke TRAIL-induceret opregulering af MCL-1 og cIAP2, to proteiner med iboende evne til at inhibere apoptose [ ,,,0],16]. Desuden har stromale celler og opløselige faktorer i tumormikromiljøet vist sig at have en betydelig indvirkning på følsomheden af ​​tumorceller over for terapeutiske midler [17], [18].

TRAIL deficiente mus udviser forøget modtagelighed at kræftfremkaldende induceret tumorigenese og har øget metastatisk potentiale [19], [20], viser, at TRAIL udøver tumorsuppressoraktivitet, og foreslår en vigtig rolle af endogen TRAIL i tumor overvågning. Faktisk viste forfatterne, at TRAIL er, i det mindste delvis, er ansvarlig for NK-cellemedieret, IFNy afhængig, mekanisme af tumor elimination.

I denne undersøgelse viste vi, at TRAIL inducerede apoptose af coloncancerceller inhiberes af makrofag afledt IL-1β, og viste, at makrofager og rekombinant IL-1β modvirke TRAIL-induceret apoptose gennem aktivering af Wnt signalering og stabilisering af Snail i tumorceller. Endelig præsenterer vi data, der indikerer, at “normalisering” af tumor mikromiljø ved vitamin D

3, en potent kemoforebyggende middel, genskaber følsomheden af ​​tyktarmskræft celler til TRAIL, tyder på, at den terapeutiske effektivitet TRAIL kan forbedres betydeligt af agenter at hæmme krydstale mellem tumorceller og tumor mikromiljø.

Materialer og metoder

cellelinjer og co-kultur eksperimenter

HCT116 og HKE-3 kolorektal karcinom cellelinjer , som kun adskiller sig ved tilstedeværelsen af ​​den mutante K-Ras allel [21] og SW480-celler blev dyrket i MEM, mens 293T-celler blev dyrket i DMEM. Den humane monocytiske cellelinje, THP1, blev dyrket i RPMI. Normale humane monocytter, 90% CD14 og CD11c positive og mindre end 1% anti T celle receptor positiv, blev indkøbt fra

Astarte Biologics

(Redmond, WA). Tumorceller og monocytter /makrofager blev co-dyrkes adskilt af transwell indsatse af en polycarbonat-membran med 0,4 uM porestørrelse, som udelukker direkte celle-celle kontakt, men tillader udveksling af opløselige faktorer (Corning Incorporated, Lowell, MA).

i klonogene assay, HCT116 og HKE-3-celler blev podet ved en densitet på 200 celler per brønd i en plade med seks alene eller sammen med THP1 makrofager eller perifere blodmonocytter i 7 dage. Tumorceller blev dyrket med THP1 monocytter direkte (1600 pr brønd af en 6 brønd plade), som THP1 celler ikke vedhæfte og danner kolonier. Det optimale forhold mellem tumorceller og makrofager blev etableret tidligere [7], [8]. Kolonier blev fikseret og farvet med 6% glutaraldehyd og 0,5% krystalviolet og talt ved anvendelse Total Lab 1.1 software (Nonlinear Dynamics, Durham, NC, USA).

Apoptose assay

Celler blev behandlet med rekombinant TRAIL (50 ng /ml, som vi bestemt var den optimale koncentration) alene eller i nærvær af makrofager, IL-1β (5 ng /ml) eller TNFa (10 ng /ml) i 7 timer. Cellerne blev resuspenderet i hypotonisk puffer (0,1% Triton X-100, 0,1% natriumcitrat) og farvet med propidiumiodid (50 ug /ml) i 4 timer ved 4 ° C som beskrevet [22]. Prøver blev analyseret ved flowcytometri og cellecyklusfordeling og omfanget af apoptose (celler med et subG1 DNA-indhold) blev analyseret af

Modfit

software. Mitochondriemembranpotential blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af det fluorescerende farvestof JC-1 (

Invitrogen

). Celler blev farvet med 1 uM JC1 i 1 time ved 37 ° C, vasket med PBS og analyseret ved fluorescens i FL2-kanalen. Cellerne blev behandlet med TRAIL i ~ 7 timer og blev indsamlet til vurdering baseret på morfologiske kriterier. Men som PI-farvning kan undervurdere mængden af ​​apoptose [23], bekræftede vi den apoptotiske karakter celler ved biokemisk analyse af cellelysater. Statistisk analyse blev udført under anvendelse uparret Students t-test, med værdier 0,05 betragtet som statistisk signifikant

transient transfektion og reportergenassay

HCT116 og HKE-3-celler blev transient transficeret med TOP. FLASH eller TOP-FOP luciferase reporter plasmider under anvendelse af calciumphosphatmetoden. Transfektionseffektiviteten blev normaliseret ved co-transfektion med pTK-Renilla og luciferaseaktivitet blev bestemt ifølge leverandørens protokol (Dual Luciferase reporter assay Promega, Madison, WI). Dominant negativ kBa blev udtrykt fra et plasmid, der koder for kBa med seriner 32 og 36 muteret til alanin, som giver resistens mod stimulus induceret nedbrydning [24]. Plasmider udtrykker konstitutivt aktiv AKT, blev (HA-mdelta (4-129) PH-AKT), og dominant negativ AKT (HA-AKT-K179M) leveret af Richard Roth [25], [26]. dnTCF4 blev beskrevet tidligere [27].

Makrofager blev transficeret med 20 nM ikke-specifik siRNA (NSP) eller siRNA’er specifikt for VDR, IL-1β eller STAT1 (Dharmacon, Lafayette, CO) under anvendelse af Lipofectamin LTX (Invitrogen , Carlsbad, CA). Effektiviteten af ​​silencing blev overvåget ved immunoblotting (for STAT1 og VDR), eller ved ELISA (for IL-1β), som rapporteret [7], [8].

Immunofluorescens

I den subcellulær påvisning af β-catenin ved immunofluorescens blev celler fikseret i 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Cellerne blev inkuberet med anti-β-catenin antistof (1:100) i 1 time ved 37 ° C og med sekundært anti-kanin-antistof konjugeret til FITC i 45 minutter ved 37 ° C. Billeder blev erhvervet med SPOT CCD-kamera og analyseret ved SPOT software.

Western Blot

Western blots blev udført ved hjælp af standardprocedurer. Membraner blev blokeret med 5% mælk i TBS indeholdende 0,1% Tween 20 og inkuberet med antistoffer specifikke for caspase 8 (Abcam), caspase 9, PARP, snail (Cell Signaling Technology), pGSK3β (Millipore, Billerica, MA), total p catenin (BD Biosciences, San Jose, CA), og β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved kemiluminescens (Amersham ECLTM western blotting påvisning kit, Piscataway, NJ).

Resultater Salg

makrofager og IL-1β beskytte coloncancerceller fra TRAIL-induceret apoptose

Vi påviste, at makrofager inducerer adskillige prosurvival signaleringsveje i colon cancerceller, herunder NF-KB, AKT og Wnt signalering [7], [8], hvilket tyder på, at tilstedeværelsen af ​​makrofager kunne påvirke respons af tumorceller til terapeutiske midler. HCT116 colon cancerceller er stærkt modtagelige for TRAIL-induceret apoptose [16]. Følgelig TRAIL inhiberede signifikant klonogene vækst af HCT116 og HKE-3-celler (fig. 1A og B), cellelinier, som kun adskiller sig ved tilstedeværelsen af ​​de mutante KRAS [21]. Der var ikke reproducerbar forskel mellem reaktionsevne HCT116 og HKE-3 celler til TRAIL (fig. 1 og 2), hvilket viser, at tilstedeværelsen af ​​mutant Kras ikke regulerer reaktionsevne celler til TRAIL. For at bestemme om makrofager ændre følsomheden af ​​tumorceller til TRAIL behandlede vi HCT116 og HKE-3-celler med TRAIL i fravær eller i nærvær af THP1 makrofager. Bemærkelsesværdigt, tilstedeværelsen af ​​THP1 makrofager eller behandling med IL-1β, en cytokin produceret i cokulturer af tumorceller og makrofager [7], genoprettede klonogene vækst fra TRAIL-behandlede colon cancerceller (fig. 1).

a og B: HCT116 og HKE-3-celler blev podet ved en densitet på 200 celler pr brønd i en plade med seks i fravær eller nærvær af makrofager (1600 /brønd) eller IL-1β, og blev behandlet med TRAIL for 4 timer. Resultaterne vist i B Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af to uafhængige forsøg hver udført i dobbeltbestemmelse.

Makrofager inhiberede ikke ekspressionen af ​​DR4 eller DR5, eller modulerer niveauet af lokkefugle receptorer DcR1 eller DcR2 i HCT116 /HKE-3 celler (Figur S1), hvilket tyder på, at de ikke modulere lydhørhed over for sti gennem regulering af TRAIL-receptorer.

Næste vi viste, at makrofager og IL-1β hæmmede TRAIL-induceret apoptose af HCT116 og Hke- 3-celler (fig. 2A). THP1 makrofager og IL-1β udelukket TRAIL-induceret kollaps af den mitokondriske membranpotentiale (MMP) (fig. 2B) og forhindrede TRAIL-induceret aktivering af caspase-8 og caspase-9 (fig. 2C). Den humane monocytiske cellelinje THP-1 blev afledt fra det perifere blod fra en patient med akut monocytisk leukæmi og THP1-celler har egenskaberne af humane monocytafledte makrofager [28]. Disse celler har adskillige karakteristika tumorassocierede makrofager (TAM’er), herunder nedsat aktivering af NF-KB, manglende nitrogenoxid produktion som respons på LPS /IFNy (ikke vist) og høj konstitutiv STAT1 signalering [7], [8]. Men for at bekræfte, at de opnåede under anvendelse THP1 celler resultaterne er biologisk relevante, vi viste at normale perifere blodmonocytter, forstadier af tumorassocierede makrofager, beskyttet et panel for tyktarmskræft cellelinier fra TRAIL-induceret apoptose (fig. 2D). Ligesom THP1 makrofager, normale perifere blodmonocytter genoprettede MMP og forhindrede aktivering af caspase 8 og spaltning af PARP i TRAIL-behandlede tumorceller (data ikke vist, fig S2), hvilket er i overensstemmelse med evnen hos colon cancerceller til at inducere IL- 1β frigørelse fra perifere blodmonocytter [7]

A:. HCT116 (gennemsnit af 5 uafhængige forsøg) og HKE-3-celler (gennemsnit af 4 uafhængige forsøg) blev behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær af makrofager eller IL-1β (5 ng /ml) som angivet, og omfanget af apoptose blev bestemt efter 7 timer. B: Den mitokondrielle membranpotentiale (MMP) blev bestemt ved JC1-farvning 5 timer efter behandling. C: Aktivering af caspase 8 og caspase-9 blev bestemt i tyktarmskræft celler behandlet med TRAIL (50 ng /ml) under forhold som angivet. D: trail følsomme cancercellelinier blev behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær af humane perifere blodmonocytter (Mo) og omfanget af apoptose blev bestemt 7 timer efter behandling. De viste data repræsenterer gennemsnittet af 2 eller 3 uafhængige forsøg.

Perifere blodmonocytter inhiberede TRAIL-induceret apoptose også i 293T-celler (fig. 2D), hvilket viser, makrofag-afledte faktorer er generelle og kraftige inhibitorer TRAIL-induceret celledød.

Makrofager beskytte mod TRAIL-induceret apoptose gennem IL-1β

Vi viste, at IL-1β er tilstrækkelig til at inhibere TRAIL-induceret apoptose (fig. 2). At fastslå, om IL-1β er påkrævet for makrofag-medieret beskyttelse af tumorceller fra TRAIL-induceret apoptose, vi først tavshed IL-1β i THP1 makrofager. Disse forsøg viste, at IL-1-deficiente makrofager ikke beskytter tumorceller fra TRAIL-induceret apoptose (fig. 3A og 3B). I overensstemmelse med disse data, neutralisering af IL-1β ved hjælp af IL-1β-specifikt antistof, eller inaktivering af STAT1, en transkriptionsfaktor, vi viste kræves for frigivelse af IL-1β fra makrofager [7] inhiberede også anti-apoptotiske aktivitet af makrofager (fig. 3A og 3B). Som forventet neutraliserende IL-1β-antistof inhiberede prosurvival aktivitet af IL-1β, hvilket viser specificiteten af ​​antistof. Beviste disse data, at tumorassocierede makrofager beskytte tumorceller mod TRAIL-induceret apoptose i en IL-1β afhængig måde

A og B:. HCT116-celler blev dyrket med THP1 makrofager med tavshed IL-1β eller STAT1 ekspression og blev behandlet med TRAIL som angivet. IL-1β blev neutraliseret af anti-IL-1β-specifikt antistof. Billeder blev taget (A) og blev bestemt mængden af ​​apoptose (B) efter 7 timer. Data vist i B repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. C og D: Undersøgelser foretaget af Gyorffy

et al

([29], C) og ved Khambata-Ford

et al

([30], D) blev undersøgt gennem Oncomine og viser, at celle linjer (C) og primære tyktarmskræft (D) med højere niveauer af IL-1βdisplay over for terapeutiske midler, såsom vinblastin, doxorubicin og cetuximab (CTX).

for at afgøre, om evnen af ​​IL -1β at interferere med terapi-induceret apoptose er begrænset til TRAIL, vi undersøgte Oncomine (www.oncomine.org), som er en samling af humane tumor microarray studier. Analysen af ​​30 cellelinier ved Gyorffy

et al

[29] viste, at høj ekspression af IL-1β i tumorceller linjer tæt korreleret til resistensen af ​​cellerne til vinblastin og doxorubicin (fig. 3C). Analysen af ​​70 metastatiske colontumorer [30] viste, at colontumorer, som skjuler mutante KRAS har højere niveauer af IL-1β end tumorer med WT KRAS (fig. 3D, venstre panel). Hvorvidt IL-1β produceres af stromaceller eller tumorceller selv heller ikke kan udledes, men en analyse af denne database viste, at højere niveauer af IL-1β i tumorer korrelerer med resistens over for cetuximab [30] (fig. 3D, højre panel). Sammenfattende etableret disse data, at de niveauer af IL-1β er forhøjet i en undergruppe af humane colon-tumorer, og at IL-1β modulerer responset af tumorceller til en række terapeutiske midler både

in vitro

in vivo

.

Farmakologisk hæmning af IL-1β stimulering af D-vitamin

3 hæmmer prosurvival aktivitet af makrofager

Vi viste for nylig, at krydstale mellem tumor celler og makrofager afbrydes af vitamin D

3, en vigtig kemoforebyggende agent for kolorektal cancer. Vitamin D

3 inhiberede evnen hos tumorceller for at stimulere IL-1β-frigivelse fra makrofager [7] og efterfølgende vitamin D

3 behandlede makrofager inducerede ikke Wnt-signalering i tumorceller [7]. Disse data antydede, at vitamin D

3 også regulere TRAIL induceret apoptose. HCT116-celler blev dyrket alene eller i nærvær af makrofager, og blev behandlet med TRAIL i fravær eller tilstedeværelse af vitamin D

3. Vitamin D

3 påvirkede ikke TRAIL-induceret apoptose i HCT116 eller HKE-3-celler (data ikke vist), hvilket stemmer overens med den manglende respons af disse celler til vitamin D

3 [31]. vi påviste imidlertid, at evnen af ​​makrofager til at beskytte coloncancerceller fra TRAIL-induceret apoptose blev inhiberet af vitamin D

3 (fig. 4A). Tilsætningen af ​​exogent IL-1β forhindrede evne vitamin D

3 at regulere TRAIL induceret apoptose, hvilket bekræfter, at vitamin D

3 gendannet følsomheden af ​​tumorceller over for TRAIL ved at hæmme frigivelsen af ​​IL-1β fra makrofager, og ikke ved at påvirke signalering af IL-1β. Silencing af VDR af VDR specifik siRNA i makrofager påvirkede ikke deres evne til at inhibere TRAIL-induceret apoptose i tumorceller, men vitamin D mislykkedes

3 at genoprette TRAIL induceret apoptose af tumorceller samdyrket med VDR deficiente makrofager (fig. 4A) . Disse data viste, at vitamin D

3 påvirker krydstale mellem tumorceller og makrofager ved at målrette makrofager og ikke tumorcellerne, og at der derfor kræver det et udtryk for VDR på makrofager, i overensstemmelse med vores offentliggjorte data [7].

A: mængden af ​​apoptose blev bestemt i HCT116 celler behandlet med TRAIL under angivne betingelser. Fejlbjælker blev afledt fra 2 uafhængige eksperimenter. B: Effekten af ​​vitamin D

3 på TRAIL-induceret aktivering af caspaser og spaltningen af ​​PARP og β-catenin blev bestemt ved immunoblotting

Biokemisk analyse bekræftede, at mens makrofager hæmmede trail. induceret aktivering af caspase 8 og caspase-9 og spaltning af PARP og β-catenin, behandling med vitamin D

3 fremmet TRAIL-medieret aktivering af den apoptotiske kaskade i tumorceller, som blev dyrket i nærvær af WT, men ikke VDR deficiente makrofager (fig. 4B). Som vitamin D

3 virker som en inhibitor af IL1-β frigivelse, blev dens aktivitet forhindres ved exogen IL1β og var afhængig af ekspressionen af ​​VDR på makrofager (fig. 4A, fig. 4B) og ikke på tumorceller (data ikke vist).

D-vitamin

3 også restaureret følsomhed over for TRAIL i tyktarmen kræftceller, der blev dyrket i tilstedeværelse af perifert blod monocytter. Det forbedrede aktivering af caspase 8 og efterfølgende spaltning af PARP og β-catenin i HCT116 at erhvervet resistens over for TRAIL grund af tilstedeværelsen af ​​perifere blodmonocytter (figur S2).

Disse data antyder, at den terapeutiske effektivitet af TRAIL blive kraftigt forbedret ved D-vitamin

3 i kræft, der er infiltreret af makrofager.

Wnt signalering er nødvendig for prosurvival aktivitet af makrofager

Vi viste for nylig, at makrofager og IL-1β fremkalde Wnt signalering i tyktarmen kræftceller gennem aktivering af NF-KB-afhængige AKT signalering [8], veje, der har vist sig at beskytte tumorceller fra apoptose. For at bestemme om makrofager og IL-1β inhiberer TRAIL-induceret apoptose gennem aktivering af disse pro-overlevelse signalveje, vi udtrykt i HCT116 celler dnIκB (en inhibitor af NF-KB-signalering), dnAKT (en hæmmer af AKT-signalering) og dnTCF4 ( en inhibitor af Wnt signalering). Hæmning af NF-KB eller AKT påvirkede ikke TRAIL-induceret apoptose. Celler, der var transficeret med dnTCF4 reproducerbart viste en moderat reduceret mængde TRAIL-induceret apoptose (forskelle var ikke statistisk signifikant), som kan være i overensstemmelse med kravene i den Wnt-vejen til optimal TRAIL-induceret apoptose [32] (fig. 5A) . det kritiske punkt var imidlertid, at i modsætning til celler transficeret med et tomt plasmid, havde makrofager og IL-1β ikke beskytte celler med nedsat NF-KB, AKT eller Wnt signalering fra TRAIL-induceret apoptose (fig. 5A). Vi bekræftede, at makrofager og IL-1β ikke modvirke TRAIL-induceret aktivering af caspase-8 og caspase-9 og efterfølgende spaltning af PARP i celler, som udtrykker enten dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 (fig. 5B). Af særlig interesse, makrofager og IL-1β forhindrede TRAIL-induceret spaltning af β-catenin, men kun i celler med intakt NF-KB /AKT /Wnt signalering (Fig 5B.)

A og B:. HCT116 udtrykker dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 blev behandlet med TRAIL under angivne betingelser, og mængden af ​​apoptose blev bestemt ved propidiumiodid-farvning. A: Data repræsenterer gennemsnittet af 5 uafhængige forsøg. B: Omfanget af caspaseaktivering og spaltningen af ​​PARP og β-catenin blev bestemt i cellelysater ved immunoblotting. C:. Lokaliseringen af ​​β-catenin blev bestemt ved immunofluorescens i HCT116-celler behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær af IL-1β eller TNFa

Spaltning af β-catenin blev medieret af caspaser, som vi kunne forhindre dets behandling af zVAD, en pan-caspaseinhibitor (figur S3). Spaltet β-catenin er blevet vist at udvise nedsat transkriptionel aktivitet [33]. Vi viste, at TRAIL inhiberer TCF4 /β-catenin transkriptionel aktivitet, og at makrofager og IL-1β delvist kan genoprette β-catenin transkriptionel aktivitet i TRAIL-behandlede celler (fig S3).

Svarende til offentliggjorte rapporter [34] fandt vi, at, på trods af at HCT116 celler bærer en mutant β-catenin allel, de fleste af β-catenin er lokaliseret til membranerne i HCT116-celler. I overensstemmelse med spaltningen af ​​β-catenin med TRAIL, blev membranøs lokalisering af β-catenin alvorlig forringelse i TRAIL behandlede celler (fig. 5C). Både IL-1β og TNFa genoprettede membranøs lokalisering af β-catenin i HCT116 celler i TRAIL-behandlede celler (fig. 5C), i overensstemmelse med deres prosurvival aktivitet.

Sammen demonstrerede disse data, at tumorassocierede makrofager (TAM’er) beskytte tumorceller fra TRAIL-induceret apoptose gennem deres evne til at stabilisere β-catenin og fremme Wnt signalering i colon cancerceller.

makrofager, TNFa og IL-1β stabilisere Snail i en NF-KB og AKT /WNT afhængig måde

Selvom makrofager og IL-1 beskyttet tumorceller fra TRAIL-induceret apoptose, de ikke regulere niveauerne af BCL-2 familiemedlemmer i tumorceller, såsom Bcl-x eller Mcl1 eller ændre ekspressionen af ​​cIAPs, som har vist sig at modulere responset af celler til TRAIL-induceret apoptose [16] (data ikke vist). viste dog, at niveauerne af sneglen protein blev forøget i HCT116-celler behandlet med IL-1β eller i HCT116 celler dyrket i nærvær af makrofager (fig. 6A). TNFa, en anden makrofag-afledt faktor, der kan inducere Wnt signalering i tumorceller [7], [35], forhøjede også niveauerne af sneglen i tumorceller (fig. 6A). Vi viste, at makrofager, IL-1β og TNF ophøjet Snail gennem NF-KB, AKT og Wnt signalering, da de undlod at øge niveauet af Snail i celler, der udtrykker dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 (fig. 6A). Niveauerne af sneglen mRNA i HCT116 eller HKE-3-celler blev ikke forøget med makrofager (ikke vist), hvilket antyder at makrofag-afledte faktorer stabilisere Snail protein i tumorceller. Induktionen af ​​c-jun af IL-1β og TNFa krævede også NF-KB, er i overensstemmelse med publicerede data (Fig. 6A). Vi viste, at TNFa og IL-1β heller ikke inducere c-jun i celler, der udtrykker dnTCF4, hvilket bekræfter betydningen af ​​Wnt signalering for den biologiske aktivitet af disse cytokiner og for interaktionen af ​​tumorceller med makrofager.

A : Makrofager, IL-1β og TNFa stabilisere Snail i et NF-KB /AKT /Wnt afhængig måde. HCT116-celler blev transficeret med dnIκB, dnAKT eller dnTCF4 og blev behandlet med IL-1β eller TNFa, eller dyrket med THP1 makrofager som angivet. Niveauerne af Sneglen og c-jun blev bestemt ved immunblotting. B: Niveauerne af Sneglen og pGSK3β blev bestemt ved immunblotting i HKE-3-celler, der blev behandlet med IL-1β, TNFa eller blev co-dyrket med makrofager i fravær eller nærvær af LY 294002 i 24 timer. C: HCT116 og HKE-3-celler blev behandlet med TRAIL i fravær eller nærvær af IL-1β og LY294002, som angivet. Eksperimentet blev udført tre gange.

GSK3p er en stor kinase, der phosphorylerer Sneglen og inducerer dens nedbrydning [36], [37]. Fordi vi rapporterede, at makrofager og IL-1β inaktivere GSK3p i tumorceller [7], [8], vi næste undersøgt, om makrofager /IL-1β stabilisere snail gennem inhibering af GSK3p. HCT116 og HKE-3-celler blev behandlet med LY294002, en PI3K-inhibitor – og dermed aktivator af GSK3p (phoshorylation af GSK3p på serin 9 inhiberer dets aktivitet). Som vist i fig. 6B, behandling af celler med LY294002 faktisk udelukket makrofager /IL-1p /TNFa-medieret inaktivering af GSK3p, og fuldstændig forhindret stabiliseringen af ​​Snail af makrofager, TNFa og IL-1β. Dette resultat viser, at inhibering af GSK3p regulerer stabiliteten af ​​sneglen i HCT116-celler og stærkt antyder, at makrofager, TNFa og IL-1β stabilisere snail gennem deres evne til at inhibere GSK3p. Faktisk farmakologisk inhibering af GSK3p af LiCl eller af GSK3p specifik inhibitor, AR-A014418, var tilstrækkelig til at stabilisere Snail i tumorceller (fig S4).

Endelig behandling af celler med LY29004 forhindres fuldstændigt evnen hos IL -1β at beskytte coloncancerceller fra TRAIL-induceret apoptose (fig. 6C), hvilket indebærer, at makrofager og IL-1β beskytte mod TRAIL apoptose gennem GSK3p afhængig stabilisering af snegl.

makrofager og IL-1β beskytte mod TRAIL-induceret apoptose ved stabilisering af Snail

snail er blevet vist at interagere med β-catenin og fremme ekspressionen af ​​Wnt målgener [38]. I overensstemmelse med disse data, fandt vi, at overekspression af Snail fremmer TOP-FLASH-driven aktivitet i både HCT116 og HKE-3-celler (fig. 7A). For at afgøre, om stabilisering af Snail af makrofager /IL-1β bidrager til deres evne til at køre Wnt signalering, vi tavshed snail i tumorceller (fig. 7B), og undersøgte evnen hos makrofager og IL-1β til at inducere Wnt signalering i snail mangelfuld HCT116 og HKE-3 celler.