Abstrakt
Menneskelig Gravhund homolog 1 (
DACH1
) er en vigtig del af den retinal Bestemmelse Gene Network. Tab af DACH1 ekspression blev fundet i bryst-, prostata-, lunge-, endometrie, colorectal og hepatocellulært carcinom. At udforske udtrykket, regulering og funktion af
DACH1
i human kræft i spiserøret, 11 esophageal cancer cellelinjer, 10 tilfælde af normal esophageal slimhinde, 51 tilfælde af forskellige kvaliteter af dysplasi og 104 tilfælde af primær esophageal skællede kræft var anvendes. Methylering specifik PCR, immunohistokemi, western blot, flowcytometri, små interfererende RNA’er, kolonidannelse teknikker og xenograft musemodel blev anvendt. Vi fandt, at
DACH1
udtryk blev reguleret af promotor-regionen hypermethylering i esophageal cancer cellelinjer. 18,8% (6 af 32) af grad 1, 42,1% (8 af 19) af grad 2 og grad 3 dysplasi (ED2,3), og 61,5% (64 af 104) af kræft i spiserøret blev methylerede, men ingen methylering blev fundet i 10 tilfælde af normal esophageal mucosa. Den methylering blev øget i progression tendens i løbet af esophageal carcinogenese (
P
0,01).
DACH1
methylering blev forbundet med dårlig differentiering (
P
0,05) og sent tumor stadie (
P
0,05). Restaurering af
DACH1
udtryk hæmmede cellevækst og aktiveret TGF-β-signalering i KYSE150 og KYSE510 celler.
DACH1
undertrykt menneske kræft i spiserøret celle tumorvækst i xenograft mus. Afslutningsvis
DACH1
ofte methyleres i human kræft i spiserøret og methylering af
er DACH1
involveret i den tidlige fase af esophageal carcinogenese. DACH1 udtryk er reguleret af promotor-regionen hypermethylering.
DACH1
undertrykker esophageal kræft vækst ved at aktivere TGF-β-signalering
Henvisning:. Wu L, Herman JG, Brock MV, Wu K, Mao G, Yan W, et al. (2014) Silencing
DACH1
Fremmer Esophageal Cancer Vækst ved at hæmme TGF-β-signalering. PLoS ONE 9 (4): e95509. doi: 10,1371 /journal.pone.0095509
Redaktør: Dajun Deng, Peking University Cancer Hospital og Institut, Kina
Modtaget: Februar 17, 2014 Accepteret: 26 marts 2014; Udgivet: 17 April, 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra: National Basic Research Program (973 Program nr 2012CB934002, 2010CB912802), National High-tech R National High-tech R National Key videnskabeligt instrument særlige program i Kina: https://www.most.gov.cn/index.htm; National Science Foundation of China: https://www.nsfc.gov.cn/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:. JGH er en konsulent til MDxHealth, men dette ændrer ikke forfatternes overholdelse til PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.
Introduktion
kræft i spiserøret er den femte mest malign sygdom og har været rangeret som den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i Kina. [1] esophageal planocellulært karcinom (ESCC) er den fremherskende histologiske type kræft i spiserøret, og tegner sig for ca. 90% af esophageal kræfttilfælde i den nordlige og centrale Kina. [2] På trods af udviklingen af multimodale terapier, 5 års samlet overlevelse forbliver under 20%. [3] De mekanismer esophageal carcinogenese fortsat uklare. Flere genetiske og epigenetiske ændringer blev betragtet som vigtige faktorer for at udvikle kræft i spiserøret [4] – [6]
Gravhund homolog 1 (
DACH1
), en vigtig komponent i den retinal Bestemmelse Gene Network. , er bredt udtrykt i epitelceller. Reduktion af DACH1 udtryk var forbundet med dårlig prognose i bryst-, prostata-, lunge-, endometrie, colorectal og hepatisk cancer. [7] – [13] udtryk for DACH1 blev reguleret af promotor-regionen hypermethylering i endometrie, colorectal og hepatocellulær cancer. [11] – [13]
DACH1
undertrykt humant hepatocellulært carcinom ved at aktivere TGF-β-signalering. [13] Mens epigenetiske ændringer og funktionen af
DACH1
i human ESCC fortsat uklare. I denne undersøgelse, vi først og fremmest analyseret epigenetiske ændringer og mekanismen for DACH1 på esophageal carcinogenese.
Materialer og metoder
Etik Statement
Studieprotokollerne blev godkendt af den etiske Udvalg af den kinesiske PLA General Hospital (Permit nummer: 20.090.701-015), og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra deltagerne. Alle procedurer af animalsk forskning blev godkendt af Det Dyreetiske udvalg af den kinesiske PLA General Hospital (Permit nummer: 2013-X8-40) og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne i 1975 Helsinki-deklarationen og var i overensstemmelse med god kliniske retningslinjer og lokale lovkrav.
Primær humant væv Prøver og cellelinier
I alt af 104 tilfælde af primær esophageal planocellulært karcinom blev indsamlet som frisk frosset væv fra kinesisk PLA General Hospital. Alle prøver blev klassificeret af TNM fase, herunder trin I (N = 5), trin II (N = 66), stadium III (N = 32), og trin IV (N = 1). Halvtreds én tilfælde af esophageal dysplasi blev indsamlet som paraffinindlejrede prøver, herunder 32 tilfælde af grad 1 dysplasi (ED1), 11 tilfælde af grad 2 dysplasi (ED2) og 8 tilfælde af grad 3 dysplasi (ED3). Ti tilfælde af normal esophageal mucosa (NE) blev indsamlet ved biopsi under endoskopi fra kinesisk PLA General Hospital. Blandt 104 cancerpatienter prøver, 30 tilfælde af paraffinblokke var tilgængelige med matchede tilstødende væv. Elleve humane ESCC cellelinjer (KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE150, KYSE180, KYSE410, KYSE450, KYSE510, TE1, TE3 og TE8) blev inkluderet i denne undersøgelse. Alle ESCC cellelinjer blev beskrevet tidligere [14] – [17], og opretholdt i RPMI-1640 (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Den Etiske Komité for den kinesiske PLA General Hospital godkendt denne undersøgelse (Permit Nummer: 20.090.701-015)., Og skriftligt informeret samtykke blev opnået før indsamling af vævsprøve og cellelinjer
5-Aza-2′ deoxycytidin behandling, RNA Isolation og Semi-kvantitative Reverse Transcription-PCR
ESCC cellelinjer blev delt til lav densitet (30% sammenløb) 12 timer før behandling. Celler blev behandlet med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-AZA) (Sigma-Aldrich) ved en koncentration på 2 uM i vækstmediet, som blev udvekslet hver 24 timer i i alt 96 h behandling. Ved afslutningen af behandlingsforløbet blev celler opsamlet og totalt RNA blev isoleret ved Trizol-reagens (Invitrogen). Semi-kvantitativ revers transkription-PCR (RT-PCR) blev udført som beskrevet tidligere [12].
bisulfit Ændring, Methylering specifik PCR og bisulfit Sequencing
Genomisk DNA fra ESCC cellelinjer og primære ESCC væv blev fremstillet ved proteinase-K-metoden. Methylering specifikke PCR (MSP) og bisulfit sekventering (BSSQ) blev udført som tidligere beskrevet. [18], [19] MSP-primere og BSSQ primere [12] blev konstrueret efter genomiske sekvenser i nærheden af transkriptionsstartstedet i CpG ø
DACH1
gen (GenBank NM_080759.4) promotorregionen og syntetiseret (BGI ) for at detektere ikke-methylerede (U) og methylerede (M) alleler.
Immunhistokemi (IHC)
Immunohistokemisk farvning for DACH1 blev udført på 4 um tykke serielle snit afledt af formelle dehyde-fikserede paraffin blokke ved antistof mod DACH1 (1:500 fortynding Proteintech) som beskrevet tidligere. [12] farvning intensitet og omfanget af de farvede område blev gradueret i henhold til den tyske semikvantitativ pointsystem, som også tidligere [12].
Plasmid Byggeri og transfektion
Den beskrevne
DACH1
ekspressionsvektor var en gave fra Dr. Cvekl.
DACH1
ekspressionsvektor og Smad-bindende elementer (SBE) -4 Luc reporter plasmid blev beskrevet tidligere. [20]
DACH1
blev også subklonet i pLenti6-GFP-vektor. Shuttle vektorkonstruktioner og ViraPower Packaging Mix cotransficeredes 293FT celler for at opnå lentivirus ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen). Lentivirus blev derefter tilsat til KYSE510 og KYSE150 celler, og sceened af Blasticidin (5 ug /ml, Invitrogen) til generering
DACH1
stabilt udtrykt celler. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) blev anvendt til plasmid transfektion. Alle konstruktioner blev bekræftet ved sekventering.
Cell Levedygtighed Assay
DACH1
stabilt udtrykt celler og uudtalt kontrol podedes på plader med 96 brønde (3 x 10
3 celler /brønd), og cellelevedygtigheden blev målt dagligt i 96 timer under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratorie) ifølge producentens anvisninger. Resultaterne blev plottet som middel ± SD. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og gentages tre gange.
Colony Formation Assay
DACH1
stabilt udtrykte celler og uudtalt kontrol (5 × 10
2 celler /brønd) blev udpladet i 2 ml komplet vækstmedium. Mediet og reagenser blev ændret én gang på 72 timer. Efter 2 uger inkubation blev cellerne fikseret med 75% ethanol i 30 minutter og farvet med 0,2% krystalviolet (Beyotime) i 20 minutter og optælling. For hvert eksperiment blev kolonidannelse assayet udført tre gange.
flowcytometrianalyse
I cellecyklusanalyse blev cellecyklussen Detection Kit (KeyGen Biotech) anvendt ifølge producentens anvisninger. Hver prøve blev analyseret ved flowcytometri med et FACScan flowcytometer (Becton-Dickinson) under anvendelse af en 488 nm laser. Histogrammer blev analyseret for cellecyklus rum ved hjælp ModFit version 2.0 (Verity Software House). For apoptose analyse blev Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (KeyGen Biotech) udført i overensstemmelse med producentens anvisninger.
DACH1 Knock ned af siRNA
Fire udvalgte små interfererende RNA (siRNA) målretning
DACH1
og RNAi Negativ kontrol Duplex blev anvendt i denne undersøgelse, og sekvenserne blev beskrevet tidligere. [12] RNAi oligonukleotid eller RNAi Negativ kontrol Duplex (GenePharma) blev transficeret i KYSE140 celler under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.
Dual-luciferase Reporter Assay
KYSE510 og KYSE150 celler (3 x 10
3) podedes på plader med 96 brønde, inkuberet i 24 timer og transficeres med en passende kombination af reporteren, ekspressionsplasmider og styrevektor, herunder SBE4-luc reporter plasmid (20 ng /brønd ), pRL-TK kontrol vektor (2 ng /brønd) som en intern kontrol reporter, og stigende mængder af
DACH1
exprssion plasmid. Celler blev serum-udsultet i 36 timer og derefter stimuleret med eller uden TGF-β1 (Peprotech) i 12 timer før luciferase assay. Relative luciferaseaktiviteter blev målt med Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) ifølge producentens instruktioner. For hvert eksperiment blev luciferase reporter assay udføres tre gange.
proteinpræparat og Western blot-analyse
Protein isolation og western blot blev udført som tidligere beskrevet. [12] Primære antistoffer var som følgende: DACH1 (Proteintech); c-myc, p21, phospho-Smad3, cyclinD1 (Cell signalering Technology); CDK4 (Affinity); phospho-Smad2 (Millipore); cyclinE1, CDK2, Smad2 og Smad3 (Bioworld Technology); p-actin (Beyotime). Pletterne blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens (Pierce Bioscience).
In vivo
Tumorigenicitet
DACH1
stabilt udtrykt KYSE510 celler og uudtalt kontrol (4 × 10
6 celler i 0,2 ml phosphatbufret saltvand) blev injiceret subkutant i den dorsale flanke af 5 uger gammel kvinde BABL /c nøgne mus henholdsvis; hver gruppe omfattede 5 mus. Tumorstørrelsen blev målt hver 5 dage i 4 uger siden 5 dage efter implantation, og tumorvolumen blev bestemt med den følgende formel: tumorvolumen (mm
3) = [længde (mm)] x [bredde (mm) ]
2/2. Alle procedurer blev godkendt af Animal Ethics Committee for den kinesiske PLA General Hospital (Permit nummer: 2013-X8-40). blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.
Statistisk analyse
Data indsamlet fra flere uafhængige forsøg blev præsenteret som middelværdien ± SEM, og analyseret ved hjælp af Students
t
test. DACH1 ekspressionsniveau mellem kræft i spiserøret og matchede tilstødende vævsprøver blev sammenlignet under anvendelse af Wilcoxon-test. Spearman rang korrelationskoefficient blev beregnet for evalueringen af korrelationen mellem ekspression og methylering af DACH1. Forholdet mellem clinicopathologic karakteristika og DACH1 methylering status blev analyseret ved anvendelse chi-square test. En
s
værdi på mindre end 0,05 blev betragtet statistisk signifikans. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 15.0 software.
Resultater
DACH1 Expression er nede Reguleret af Arrangøren Region Hypermethylering i ESCC cellelinier
DACH1 ekspression blev reguleret af promotor-regionen hypermethylering i human colorectal og hepatocellulært carcinom. [12], [13] For at undersøge reguleringen af
DACH1
i ESCC, udtrykket og status methylering af
DACH1
blev påvist ved RT-PCR og MSP i esophageal cancer cellelinjer. Som vist i figur 1A, blev Tab af DACH1 ekspression fundet i KYSE150, KYSE510, TE1 og TE3 celler, blev reduceret DACH1 ekspression forekom i TE8 celler, og påvistes ekspression af DACH1 i KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 og KYSE410 celler . MSP resultater er vist i figur 1B.
DACH1
var helt methyleret i KYSE150, KYSE510, TE1 og TE3 celler, delvist i TE8, og umethyleret i KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 og KYSE410 celler. MSP resultater blev yderligere valideret af bisulfit sekventering (BSSQ) i KYSE150, KYSE510, TE8 og KYSE140 celler (Fig. 1C). Ovenfor resultater viser, at promotor-regionen hypermethylering er korreleret med tab /reduktion af
DACH1
udtryk. Re-udtryk /stigende udtryk for
DACH1
blev induceret med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-AZA) i
DACH1
methylerede kræft i spiserøret cellelinjer (KYSE150, KYSE510, TE8, fig. 1A). Disse data antyder, at
DACH1
ekspression reguleres af promotorregion methylering i ESCC cellelinier.
(A)
DACH1
ekspressionsniveau detekteret ved RT-PCR i esophageal cancer celle linjer. (B) Methylering status i promotorregion; IVD:
in vitro
denatureret DNA, der anvendes som methylering kontrol; NL: normal blod lymfocyt DNA, der anvendes som unmethylation kontrol; U: methylerede alleler; M: methylerede alleler. (C) BSSQ af
DACH1
promoter region (-426 bp til -140 bp) i KYSE150, KYSE510, TE8 og KYSE140 celler; pil med to hoveder: MSP PCR-produkt, der spænder over 130 bp. Udfyldte cirkler: methylerede CpG sites; åbne cirkler:. umethylerede CpG sites
DACH1 er Ofte methyleres i Human Esophageal Cancer
For yderligere at undersøge status methylering af
DACH1
under human ESCC udvikling, 10 tilfælde af normal esophageal slimhinde, blev 51 tilfælde af forskellige kvaliteter af dysplasi og 104 tilfælde af primær ESCC opdaget af MSP. Som vist i figur 2A og 2B, 18,8% (6 ud af 32) af esophageal grad 1 dysplasi (ED1), 42,1% (8 af 19) af klasse 2 og 3 dysplasi (ED2,3), og 61,5% (64 af 104) af invasiv kræft i spiserøret (EF) var methyleret, men ingen af de 10 tilfælde af normal esophageal mucosa blev methyleret. Hyppigheden af
DACH1
methylering blev øget i progression tendens i løbet af esophageal carcinogenese (
P
0,01).
DACH1
methylering blev forbundet med dårlig differentiering (
P
0,05) og sent tumor stadie (
P
0,05) signifikant. Ingen association blev fundet mellem
DACH1
methylering og alder, køn, metastase eller tumorstørrelse (
P
0,05, tabel 1). Ovenfor resultater viser, at
DACH1
methylering er en tidlig begivenhed af esophageal carcinogenese og methylering af
er DACH1
akkumuleret under progression af kræft i spiserøret. Ekspressionen af DACH1 blev vurderet ved immunohistokemi (IHC) i 30 tilfælde af matchede esophageal cancer og tilstødende vævsprøver. Udtrykket blev reduceret væsentligt i prøver kræft (
P
. 0,01, figur 2C og 2D). Det tyder på, at
DACH1
er en mulig tumor suppressor i kræft i spiserøret. For at se, om DACH1 ekspression blev reguleret af DNA methylering i human primær cancer, blev sammenslutningen af DACH1 udtryk og promoter region hypermethylering analyseret. Reduceret udtryk blev fundet i 19 tilfælde af kræft væv og 15 sager blev methylerede (fig. 2E). Reduktion af DACH1 udtryk var forbundet med promoter region hypermethylering signifikant (
P
0,01). Disse resultater antyder, DACH1 ekspression reguleres af promotorregion hypermethylering i human primær ESCC.
(A) repræsentant MSP resultater af
DACH1
methylering status i normale esophageal mucosa (NE), esophageal dysplasi ( ED) og kræft i spiserøret (EF). (B)
DACH1
methylering frekvens i NE, ED1, ED2 og ED3, og EF. Hyppigheden af methylerede
DACH1
blev plottet i henhold til histologisk kvalitet og analyseret ved hjælp af chi-square test. **,
P
0,01. (C) Repræsentant IHC resultater for DACH1 udtryk i primær kræft i spiserøret (til venstre) og tilstødende væv (til højre); øvre fase, X200; nedre fase, X400. (D) DACH1 udtryk niveau i 30 tilfælde matchede primær kræft og tilstødende vævsprøver; box plot: repræsenterer DACH1 udtryk niveau; vandret linie: repræsenterer den mediane plan; de øverste og nederste linje af felter repræsenterer 75% og 25% ekspressionsniveau, henholdsvis; lodrette streger repræsenterer forskellige ekspressionsniveau. **,
P
0,01 versus tilstødende vævsprøver ved hjælp Wilcoxon-test. (E) Foreningen af
DACH1
methylering og tab /reduceret ekspression i 30 tilfælde ESCC. **,
P
. 0,01, Spearman rang korrelationskoefficient
Restaurering af DACH1 Expression Undertrykker Esophageal Cancer Growth både
in vitro
in vivo
for at se effekten af
DACH1
på ESCC celleproliferation, KYSE510 og KYSE150 celler med stabilt udtrykker
DACH1
eller tom vektor blev oprettet ved lentivirus transduktion. Cellernes levedygtighed og kolonidannelse blev analyseret i
DACH1
stabilt udtrykte celler og uudtalt kontrol. Re-ekspressionen af
DACH1
hæmmet celledeling (
P
0,01, figur 3A.) Og kolonidannelse (
P
0,05, figur 3B.) I disse cellelinier. Funktionen af
DACH1
på kræft i spiserøret er også undersøgt i xenograft mus model (fig. 3C). Tumoren størrelse var mindre i
DACH1
udtrykt KYSE510 celler end i kontrol (104.23 ± 21,38 mm
3 vs 494.65 ± 81,98 mm
3,
P
0,01, Fig . 3D), og tumor vægt var mindre i
DACH1
udtrykt KYSE510 celler end i kontrolgruppen (78 ± 28 mg vs 182 ± 37 mg,
P
. 0,01, fig 3E ). Ekspressionen af DACH1 blev valideret ved IHC i xenograft (fig. 3F). Disse resultater tyder på, at
DACH1
undertrykker esophageal kræft vækst både
in vitro
in vivo
.
(A) Vækst kurver repræsenterer CCK-8 assay resultater for
DACH1
udtrykte celler og uudtalte cells.Points, gennemsnit af fire uafhængige forsøg; barer, SEM. **,
P
0,01, Students
t
test. (B) Repræsentative resultater af kolonidannelse i
DACH1
udtrykt og uudtalt KYSE510 og KYSE150 cellelinjer. Kolonner, mener fire uafhængige eksperimenter; barer, SEM. *,
P
0,05 versus kontrol ved hjælp af Students
t
test. (C) Repræsentanter resultater af xenotransplantattumorer i nøgne mus til
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE510 celler. (D) Vækst kurver repræsenterer tumorstørrelse i
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE510 celler xenograft mus i forskellige tid. Punkter, middelværdi af 5 mus; . Barer, SEM *,
P
0,01, Students
t
test. (E) Repræsentative resultater af tumor vægt i
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE510 celler xenograft mus i forskellige tid. Kolonner, betyde af 5 mus; barer, SEM. *,
P
0,01, Students
t
test. (F)-repræsentant DACH1 ekspression resultater opdaget af IHC for
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE510 celler xenograft. DACH1 udtryk blev fundet i
DACH1
udtrykt KYSE510 celle xenograft. (højre). Forstørrelse: øvre fase, X200; lavere fase, X400.
Restaurering af DACH1 Expression Øget G
1 fase og Reducerede S Fase Celler
Effekten af
DACH1
på celle cyklus var analyseret ved flowcytometri i KYSE510 og KYSE150 cellelinier. Som vist i figur 4A, Forholdet mellem G1-fasen cellen var 51,05 ± 2,28% og 38,56 ± 1,64% i
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE510 cellelinjer (
P
0,05). Forholdet mellem S-fasen var 25,72 ± 0,99% og 37,09 ± 1,49% i
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE510 cellelinjer (
P
0,05). Forholdet mellem G1 fasen celle var 65,46 ± 2,84% og 44,41 ± 2,87% i
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE150 cellelinjer (
P
0,05). Forholdet mellem S-fasen var 12,34 ± 0,10% og 32,06 ± 1,32% i
DACH1
udtrykt og uudtrykte KYSE150 cellelinjer (
P
0,01). Disse resultater tyder på, at
DACH1
øger G1 fasen og reducerede S-fase celler i kræft i spiserøret
(A) Flowcytometri resultater viser:. Celle fase distribution i DACH1 uudtalt og udtrykte KYSE510 og KYSE150 celler . Kolonner, gennemsnit af tre uafhængige forsøg; barer, SEM. *,
P
0,05; **,
P
0,01, Students
t
test. (B) Western blot resultater viser: udtryk for G1 /S check point relaterede gener i DACH1 uudtalt og udtrykte KYSE510 og KYSE150 celler, blev β-Actin anvendt som en belastning kontrol
Øget udtryk for CDK2. , CDK 4, cyclinD1 og cyclinE1 repræsenterer normalt fremme cellecyklus fra G1 fasen til S-fasen. Som vist i figur 4B, ekspressionen af CDK2, CDK 4 blev cyclinD1 og cyclinE1 reduceret tilsyneladende i
DACH1
udtrykt KYSE510 og KYSE150 celler sammenlignet med ikke-udtrykte celler. Det tyder på, at
DACH1
undertrykker celledeling ved at hæmme G
1 /S checkpoint i kræft i spiserøret. Virkningen af
DACH1
på celle apoptose blev også analyseret ved flowcytometri i KYSE510 og KYSE150 cellelinier, men ingen apoptose ændring blev fundet før og efter restaurering af
DACH1
ekspression i disse to cellelinjer (data ikke vist).
Restaurering af DACH1 Expression Aktiverer TGF-β signalering i ESCC
Vores tidligere undersøgelse viste, at
DACH1
udført anti-spredning effekt ved at aktivere TGF β signalering og inhibere c-myc ekspression i humane hepatocellulære carcinoma cellelinier. [13] For at bestemme, om TGF-β-signalering reguleres af
DACH1
i ESCC blev dual-luciferase reporter assay ansat til at undersøge SBE4 luciferaseaktiviteten i KYSE510 og KYSE150 cellelinjer. Som vist i figur 5A, blev SBE4 promotoraktivitet steget mere end 3 gange i KYSE510 og 2,6 fold i KYSE150 celler efter restaurering af
DACH1
ekspression, og aktiviteten blev forøget på en dosis-afhængig måde ved restaurering af
DACH1
udtryk kombineret med TGF-β1 behandling. For yderligere at forstå mekanismen af
DACH1
på TGF-β-signalering, niveauet af phosphoryleret Smad2 (p-Smad2) og phosphoryleret Smad3 (p-Smad3), og dens downstream mål, blev p21 og c-myc evalueret i
DACH1
uudtrykte og udtrykte KYSE510 og KYSE150 cellelinjer. Niveauet af p-Smad2 blev ikke ændret før og efter re-udtryk for
DACH1
, mens niveauet af p-Smad3 blev forøget efter fornyet udtryk for
DACH1
. Niveauet af p-Smad2 og p-Smad3 blev forøget efter tilsætning TGF-β1. p-Smad3 blev forøget tilsyneladende, når det tilsættes TGF-β1 til
DACH1
re-udtrykte KYSE510 og KYSE150 celler. Ekspressionen af nedstrøms gener var forskellige. p21 blev opreguleret og c-myc blev nedreguleret efter re-udtryk for
DACH1
(fig. 5B). Det antyder, at TGF-β-signalering aktiveres af
DACH1
og TGF-β1 forstærker denne effekt. For yderligere at validere effekten af
DACH1
på TGF-β-signalering, blev siRNA knockdown anvendte teknik. Niveauet af p-Smad2 ikke ændre sig efter vælte
DACH1
i
DACH1
udtrykt KYSE140 celler, men niveauet af p-Smad3 blev reduceret, når vælte
DACH1
. Både p-Smad2 og p-Smad3 blev forøget efter tilsætning TGF-β1. p-Smad3 blev øget lidt ved at tilføje TGF-β1 til siRNA transficerede KYSE140 celler sammenlignet med kun vælte
DACH1
. Reduceret p21 og øget c-myc-ekspression blev fundet efter at vælte
DACH1
i KYSE140 celler (fig. 5C og 5D). Ovenfor resultater antyder endvidere, at TGF-β-signalering aktiveres af
DACH1
i human kræft i spiserøret.
(A) Smad-bindende elementer (SBE) -4 Luc reporter aktiviteter i KYSE510 og KYSE150 celler . Kolonner, gennemsnit af tre uafhængige forsøg; barer, SEM. (B) Ekspressionsniveauet af TGF-β signalering nedstrøms gener i
DACH1
udtrykte celler og uudtalte celler, β-Actin blev anvendt som en loading kontrol. (C) Effektiviteten af siRNA’er målretning på
DACH1
i KYSE140 celler. (D) Udtrykket niveau af TGF-β signalering nedstrøms gener i
DACH1
-siRNA KYSE140 celler og kontrolgruppe, β-Actin blev brugt som en belastning kontrol.
Diskussion
udtryk for DACH1 blev reduceret i bryst-, prostata-, lunge-, endometrie, colorectal og hepatocellulært carcinom, men det blev øget i æggestokkræft. [7] – [13], [21] DACH1 ekspression blev reguleret af promotor-regionen hypermethylering i endometrie, colorectal og hepatocellulært carcinom. [11] – [13] I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at DACH1 ekspression blev reduceret, og ekspressionen af DACH1 blev reguleret af promotorregion hypermethylering i human esophageal cancer. Vi havde rapporteret, at mange tumorsuppressorer var methyleres med en progression tendens under esophageal carcinogenese. [15], [16], [22], [23] I denne undersøgelse analyserede vi status methylering af
DACH1
i normal esophageal slimhinde, forskellige kvaliteter af dysplasi og invasiv cancer.
DACH1
blev ofte methyleret i kræft i spiserøret og frekvensen blev øget med udviklingen af esophageal carcinogenese fra normal esophageal slimhinde til invasiv cancer. Det tyder på, at
DACH1
er en kræft i spiserøret tidlig påvisning markør. Foreningen af dårlig differentiering og sent tumor scenen med
DACH1
methylering tyder på, at
DACH1
methylering kan tjene som kræft i spiserøret prognostiske markør.
DACH1
blev betragtes som en tumorsuppressor eller et oncogen i forskellige slags cancer. [7] – [13], [21] I vores undersøgelse,
DACH1
viste sig at undertrykke esophageal kræft vækst både
in vitro
in vivo
. TGF-β-superfamilien er et sæt af multifunktionelle cytokiner, som regulerer cellevækst, differentiering, apoptose, migration og angiogenese. [24] – [27] I normale epitelceller, TGF-β-signalering involverer i transkriptionel aktivering af cyclinafhængige kinaseinhibitor p21Cip1, og undertrykkelse af vækstfremmende transkriptionsfaktor c-Myc. Samvirkende, disse gen-responser medierer cellecyklusstandsning ved G1-fasen. [28] – [30] TGF-β-signalering spiller en kritisk men paradoks rolle i forskellige cancere [31] – [33]. I brystkræft, TGF-β-signalering undertrykker cellevækst i den tidlige fase og fremme kræft invasion i sent stadium. [34] tidligere undersøgelse i brystcancer viste, at DACH1 hæmmede TGF-β signalering gennem binding Smad4. [20] Mens der i leverkræft, fandt vi DACH1 aktiveret TGF-β-signalering ved at øge p-Smad3. Det forstærkede undertrykkelse af c-Myc-ekspression og celleproliferation. [13].
Til støtte for tidligere rapport, at DACH1 induceret p21 protein overflod og antagoniserede Myc-induceret onkogen fænotype i brystkræft, [35] fandt vi her, at ektopisk udtryk for DACH1 alene i esophageal kræftceller øget p21 og nedsat c-Myc proteinniveauet (fig. 5B). Desuden DACH1 synergieffekt med TGF-β kan forbedre induktion af p21 og undertrykkelse af c-Myc; tilsvarende, banker ned DACH1 undertrykt TGF-β-signalering i KYSE140 celler. TGF-β-signalering kan krydstale med mange andre veje. p53 og smads fysisk interageret og synergisk coregulated TGF-β målgener såsom p21 og p15. [36] Nylige undersøgelser viste, at DACH1 forbundet med p53 og øget p53-funktion til at inducere apoptose og inhibere tumorvækst. Yderligere undersøgelse viste, at DACH1 delt belægning på -15% p53-bundne gener chip sekventering. [7], [9] Som DACH1 aktiveret TGF-β-signalering (fig. 5A) og induceret phosphorylering af Smad2 /3 (fig. 5B), en mulig forklaring er aktiveringen og stabilisering af Smad2 /3-protein kompleks ved DACH1 ligesom p53 . Men skal bevises., Detalje mekanisme
Som konklusion,
DACH1
ofte methyleres i human kræft i spiserøret og methylering af
DACH1
er involveret i den tidlige fase af esophageal carcinogenese. DACH1 udtryk er reguleret af promotor-regionen hypermethylering.
DACH1
undertrykker esophageal kræft vækst ved at aktivere TGF-β-signalering.
Tak
Tak Dr. Cvekl for at give DACH1 ekspressionsvektorer.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.