PLoS ONE: A Novel murin model af inflammatorisk tarmsygdom og Inflammation-Associeret tyktarmskræft med colitis ulcerosa-Like Features

Abstrakt

Mutationer, der kan øge risikoen for inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er blevet identificeret i en række af gener i både mennesker og mus, men de faktorer, der styrer, hvordan disse mutationer bidrager til IBD patogenese og resultere i fænotypisk præsentation som colitis ulcerosa (UC) eller Crohns sygdom (CD), er ikke godt forstået. I denne undersøgelse mus defekte i både TNF og IL-10 (T /I mus) sig at spontant udvikle alvorlig colitis snart efter fravænning, uden behov for exogene udløsere. Colitis i T /I mus havde klinisk og histologisk funktioner ligner humant UC, herunder en markant forøget risiko for at udvikle inflammationsassocieret tyktarmskræft. Vigtigere, blev udviklingen af ​​spontan colitis hos disse mus forhindres ved antibiotisk behandling. Overensstemmelse med den kendte rolle Th17-drevet inflammation som reaktion på bakterier, T /I mus havde forhøjede serumTh17-type cytokiner, når de udviklede spontan colitis og efter systemisk bakteriel udfordring via NSAID-induceret nedbrydning af den mucosale barriere. Skønt TNF-produktion er blevet almindeligt anset for at være være patogene i IBD, indikerer disse data, at evnen til at producere normale niveauer af TNF faktisk beskytter mod den spontane udvikling af colitis som reaktion på intestinal kolonisering af bakterier. T /I mus model vil være nyttig for at udvikle nye rationelt baserede terapier til at forebygge og /eller behandle IBD og inflammation-associeret tyktarmskræft og kan yderligere give vigtig indsigt i patogenesen af ​​UC i mennesker.

Henvisning : Hale LP, Greer PK (2012) A Novel murin model af inflammatorisk tarmsygdom og Inflammation-associeret tyktarmskræft med colitis ulcerosa-lignende funktioner. PLoS ONE 7 (7): e41797. doi: 10,1371 /journal.pone.0041797

Redaktør: Markus M. Heimesaat, Charité, Campus Benjamin Franklin, Tyskland

Modtaget: 15. maj 2012; Accepteret: 25 Juni 2012; Publiceret: 27 juli, 2012 |

Copyright: © Hale, Greer. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Duke University Patologisk Institut samt ved National Institutes of Health giver R21-DK75522 og R01-CA115480. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humant inflammatorisk tarmsygdom (IBD) manifesterer typisk som enten colitis ulcerosa (UC) eller Crohns sygdom (CD). Patienter med UC eller CD begge lider episodisk blodig diarré og mavesmerter, men de adskiller sig i brutto- og histologisk fordeling af deres tarmbetændelse. Inflammationen i UC involverer altid endetarmen og kan også strække sig proximalt på en kontinuerlig måde at involvere sigmoid, colon descendens, eller hele tyktarmen ( “pancolitis”). Histologisk krypt bylder og sår er almindelige i UC, med inflammation typisk begrænset til slimhinden. I modsætning hertil kan CD involvere nogen del af mave-tarmkanalen, selvom de mest almindelige sygdomsbilleder involverer terminal ileum alene, colon alene, eller begge terminale ileum og colon. Inflammatoriske læsioner i CD strækker sig dybt ind i tarmvæggen ( “transmural”), kan omfatte ikke-caseating granulomer, og er karakteristisk adskilt af uengagerede væv ( “skip læsioner”). Komplikationer af transmural involvering i CD inkluderer perforeringer, dannelse af store bylder, og unormale forbindelser (fistler) mellem tilstødende tarm løkker eller legemsoverfladen. Salg

Mutationer, der kan øge risikoen for IBD er blevet identificeret i en række gener, i både mennesker og mus. Nogle af disse mutationer ses i humane familier med både UC og CD, men de faktorer, der styrer, om UC eller CD forekommer i en given patient er ikke bestemt. Disse oplysninger er af afgørende betydning klinisk, eftersom disse sygdomme har en anden prognose og reagerer forskelligt på tilgængelige behandlinger. For eksempel blev homozygot mutation i receptoren for IL-10 for nylig vist sig at være en årsag til tidlig debut, alvorlig CD hos mennesker [1]. Men genom-dækkende forening og andre undersøgelser har også identificeret, polymorfier i den humane IL-10-genet, som giver en øget risiko for at udvikle UC [2], [3]. Den immunregulerende cytokin IL-10 er vigtigt for generering og funktion af T regulerende celler, der har vist sig at beskytte mod IBD udvikling i murine modeller [4], [5]. IL-10 blev også for nylig vist sig at falde IL-1β produktion af dendritiske celler, således nedregulering af Th17 inflammation, der har været impliceret i IBD patogenese [6].

Selvom mus med deletion af genet der koder IL-10 blev oprindeligt rapporteret til udvikler spontant colitis [7], har vi fundet, at

IL10

– /- mus på C57BL /6 baggrund er resistente over for udviklingen af ​​spontan colitis, når det opbevares fri for patogener som

Helicobacter

[8], [9]. Men disse

, IL10

– /- mus let udvikle moderat til svær IBD når udløst af begivenheder, der kompromitterer deres slimhinde barriere, såsom infektion med Helicobacter arter [8], [10] eller udsættelse for ikke steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) [11], [12]. IBD i

IL10

– /- mus er karakteriseret ved transmural inflammation og springe læsioner og er typisk mest alvorlige i coecum og den proksimale tyktarm. Vi har også lejlighedsvis observeret granulomer, entero-entero eller entero-kutane fistler, og abdominal bylder i

IL10

– /- mus med langvarig tarmsygdom (L. P. Hale, upublicerede observationer).

IL10

– /-. Mus synes således at give en IBD model, der ligner det, der ses hos mennesker med CD

cytokin TNF er en vigtig regulator af inflammation. Ud over sine direkte virkninger inducerer TNF mange genprodukter involveret i den inflammatoriske pathway, vævsreparation og immunresponser, herunder IL-1, IL-6, og prostaglandiner. I overensstemmelse med dets rolle i reguleringen af ​​inflammation, er TNF-neutraliserende monoklonale antistoffer, såsom infliximab vist signifikant reducere inflammatorisk aktivitet i behandlingsresistente CD hos mennesker, der kan forbedre lukning af fistler, og at være en effektiv vedligeholdelsesbehandling hos patienter med enten luminale eller fistulizing CD [13] – [16]. Effekten af ​​infliximab er også blevet vist hos mennesker med UC [17]. Den kliniske succes for disse specifikke anti-TNF terapeutiske midler har ført TNF skal betragtes som en vigtig regulator af inflammation i IBD. Imidlertid har den manglende effekt af andre anti-TNF narkotika såsom den opløselige TNF-receptor etanercept [18] og TNF-syntese inhibitor LMP-420 [19] i human eller murine IBD rejst spørgsmål om, hvorvidt anti-TNF-behandling i IBD arbejde via neutralisering af TNF eller via en anden mekanisme (f.eks immunosuppression frembragt af cytotoksicitet til TNF-udtrykkende celler). For yderligere at tage fat på betydningen af ​​TNF i patogenesen af ​​IBD, vi skabt

IL10

– /- mus, der var også globalt mangelfuld i TNF og vurderet deres følsomhed over for colits, betændelse-associeret tyktarmskræft, og systemiske reaktioner på enteriske bakterier.

Materialer og metoder

Animal Studies

ynglende par af C57BL /6 mus mangelfuld i IL-10 (stamme name =

B6. 129P2-IL10

tm1Cgn /J

; bestand # 002.251) og TNF (stamme name =

B6.129S6-TNF

tm1Gkl /J

; bestand # 005.540) blev opnået fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og krydsede at generere

TNF

+/- IL10

– /-

(T-het /i) og

TNF

– /- IL10

– /-

dobbelt knockout (T /i) mus, var IBD-modtagelige, med heterozygote eller fuldstændig mangel på TNF-produktion i alle celletyper. Avl Ordningen anvendes typisk genereret T-het /I og T /I mus som samme kuld, der ville blive udsat for den samme maternale mikrobiota ved fødslen. Når det er muligt, co-opstaldet samme køn kuldsøskende af forskellig genotyper blev bruges, når aldersmatchede sammenligninger. Men studerede hver genotype gruppe var sammensat af flere kuld og de data blev ikke matchet til søskende.

Mus blev huset i polycarbonat mikro-isolator bure i individuelt ventilerede stativer under specifikke patogenfrie barriere betingelser, med adgang til mad og vand

ad libitum

. Sentinel mus udsat gentagne gange til beskidte strøelse fra mus, der anvendes i denne undersøgelse var negative for parasitter ved mikroskopisk eksamen, negativ for

Citrobacter rodentium

af fækal kultur, negativ for infektion med

Helicobacter

arter ved PCR af afføring, og negativ ved serologi for et panel af 22 murine protozoal, bakterie-, og virale patogener, herunder murine parvovirus, murine hepatitis virus og murine norovirus.

i studier af spontan colitis, kohorter af mus blev aflivet til histologisk scoring af kolon inflammation på forudbestemte tidspunkter, eller hvis de nåede de humane endepunkter af rektal prolaps, tab af 15% kropsvægt, eller tegn på smerte og lidelse, herunder dårlig grooming, nedsat aktivitet, og bøjet kropsholdning. Nogle grupper af mus blev udsat for 200 ppm piroxicam i pulveriseret LabDiet 5001 chow (Land O’Lakes-Purina, Richmond, IN) i 7 dage, en behandling tidligere vist at udløse indtræden af ​​colitis hos

IL10

– /- mus [11], [12]. Baseret på målte fødeindtag dosis af piroxicam i gennemsnit 48 mg /kg /dag i disse eksperimenter. Musene blev derefter sat tilbage på chow uden piroxicam og observeret i yderligere 16 dage før eutanasi til histologisk scoring af colon inflammation.

I studier af forebyggelse colitis, antibiotisk terapi blev påbegyndt på tidspunktet for fravænning anvendelse af kommercielt tilgængelige gnaverfoder, der indeholdt 3 mg amoxicillin, 0,5 mg clarithromycin, 1 mg metronidazol, og 20 ug omeprazol pr 5 g wafer (Bio-Serv, Frenchtown, NJ). Kontrolgrupper fik identiske vafler, der manglede antibiotika.

Tissue Analysis

Efter eutanasi blev fordøjelseskanalen opdelt i 5 segmenter repræsenterer coecum og proksimale, midten, distale og terminal kolon /endetarm. Væv blev fikseret i Carnoys opløsning i 2-4 timer eller i 10% neutral bufret formalin i 18 timer, hvorefter forarbejdet til paraffinblokke. Sværhedsgraden af ​​colon inflammation og forekomst af kolon neoplasi set i hæmatoxylin og eosin-farvede sektioner blev scoret af en bord-certificeret patolog blindet til forsøgsgruppen. Histologiske scoringer blev beregnet som beskrevet [12], [20], under anvendelse af en skala fra 0-75, der tager hensyn mucosale ændringer i de 5 forskellige tarm-segmenter, herunder hyperplasi og sårdannelse, graden af ​​inflammation, og% af hver tarm segment berøres af disse ændringer. Ved anvendelse af denne skala, en score 12 indikerer tilstedeværelsen af ​​colitis, 13-24 indikerer mild colitis, og 26 indikerer moderat til svær colitis. Dyr med histologiske scoringer, der falder ind i moderat til svær interval har typisk enten spredt alvorlige inflammatoriske læsioner eller omfattende sygdom, der involverer slimhinden. Sektioner blev også scoret for non-invasive eller invasive neoplasi [21]. Mave intraepitelialneoplasi (synonyme med atypisk hyperplasi, microadenoma, carcinom

in situ

) og adenom blev anset for at være ikke-invasive læsioner. En diagnose af invasiv carcinoma kræves tilstedeværelsen af ​​en desmoplastiske respons (dannelse af en rigelig kollagen- stroma) at differentiere invasion fra mucosal herniation eller pseudoinvasion. Regioner i neoplasi, der var adskilt af områder af normal slimhinde blev scoret som separate læsioner

Cytokin Svar på Bakterier og deres produkter

For at vurdere systemiske cytokin respons på bakterielle produkter, voksne mus ( 8 wks) blev injiceret intraperitonealt med 100 ug lipopolysaccharid (LPS) fra

E. coli

O55: B5 i 1 ml saltvand. Dyr blev aflivet 90 min senere for at opnå serum til cytokinanalyse. Alternativt blev mus placeret på foder indeholdende 200 ppm piroxicam, og serum blev opnået 42 timer senere. Cytokinerne stede i serum blev kvantificeret ved sammenligning med standarder af kendte koncentrationer under anvendelse af enten enzymimmunassays (Mouse TNFa DuoSet DY410; R 2 SD over baggrund; dette varierede fra 1 til 10 pg /ml for de testede analytter. Målinger under denne grænse blev tildelt en værdi på nul. Ifølge producentens litteratur, de anvendte reagenser havde ubetydelig krydsreaktivitet med andre analytter.

Statistisk analyse

Statistisk sammenligning af histologiske scoringer og cytokin niveauer for de genotyper undersøgte blev udført ved hjælp af ANOVA, derefter en post-test for multiple sammenligninger ved hjælp GraphPad Prism-software version 5.03. Cytokinet data blev log-transformeret inden statistisk analyse. En Dunnetts post-test blev anvendt, da hver gruppe blev sammenlignet med den vilde kontroltype. En Tukey post-test blev anvendt, når eksperimentelle grupper blev sammenlignet med hinanden. Kategoriske data blev sammenlignet via chi-squared analyse (Fishers eksakte test). Overlevelsesrater blev beregnet ved hjælp af Kaplan-Meier-test med

s

-værdier beregnes ved hjælp af log rank test (MediCalc Software, Version 12.2.1, Mariakerke, Belgien). En p-værdi ≤0.05 blev anset for at udgøre en signifikant forskel mellem grupperne.

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev godkendt (protokol nummer A151-09-05) af Institutional Animal Care og brug Udvalg af Duke University, en institution godkendt af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC), International. Selvom colitis har potentiale til at producere smerte og angst, var analgetika ikke ansat i disse undersøgelser, da ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAID) kan forværre colitis og opioider påvirker tarmens motilitet og funktion. Lidelse blev minimeret ved at give eutanasi for mus, der mødte humane endepunkter, som angivet ovenfor.

Resultater

Effekt af TNF Mangel på ynglesucces og vækst af

IL10

– /- Mus

TNF

– /-

: IL10

– /- (T /i) unge voksne hanner og hunner var frugtbare med normale kuldstørrelse, men hvalpene ofte udstillet høj tidlig dødelighed og /eller mistrivsel. Avl liv T /I dæmninger var typisk begrænset til 1-2 kuld og nogle aldrig blev gravid overhovedet. Graviditeter sjældent forekom med T /I dæmninger eller handyr ældre end 5 måneder. Disse ynglende problemer var relateret til kombinationen af ​​IL-10 og TNF-mangel, da lignende problemer var ualmindeligt, når enkelt knockout

IL10

– /- eller

TNF

– /- mus blev ligeledes fastholdt under Helicobacter-fri forhold i samme anlæg. Vi rutinemæssigt opformeret den linje ved hjælp af T-Het /I dæmninger og T /I tyre.

Når født til et sundt dæmning, T-het /I og T /I hvalpe var samme vægt i de første 3 uger af liv og deres vægt var lig dem observeret i alder-matchede vildtype C57BL /6,

IL10

– /-, eller

TNF

– /- unger rejst i det samme anlæg (figur 1). Men vægten af ​​T /I mus begyndte at halte bagefter de af WT, T-het /I,

IL10

– /-, og

TNF

– /- mus hurtigt efter fravænning (figur 1 og data ikke vist). Dette førte os til at hypotesen, at T /I mus kan være modtagelige for at udvikle colitis spontant, i mangel af specifikke udløsning forpligtet til at fremkalde colitis i

IL10

– /-. Mus

gennemsnit ± SEM legemsvægte er vist for vildtype- og T /i hanmus mellem 2 og 9 wks gamle. Antallet af kuld og mus repræsenterede er 8 kuld og 2-24 mus /punkt for vildtype (WT) og 14 kuld og 3-12 mus /punkt for T /I mus. Tilsvarende data blev også opnået for følgende stammer, der ikke adskiller sig fra vild type værdier på nogen af ​​de 8 tidspunkter testet:

IL10

– /- (IL10 KO), 5 kuld, 3-21 mus /point;

TNF

– /- (TNF KO), 5 kuld, 7-13 mus /point; T-het /I, 14 kuld, 2-6 mus /point. De SEMs for WT mus varierede fra 0,2 til 0,6 g og således er skjult af markørerne valgt. * Angiver en signifikant forskel mellem WT og T /I mus; p-værdier lå fra 0,0001 til 0,03. Lignende tendenser blev set i hunmus (ikke vist)

TNF Mangelsymptomer disponerer til udvikling af spontan Colitis

WT og

TNF

-. /- mus til huse i det samme dyr facilitet som T-het /i og T /i mus viste ingen tegn på spontan colitis (tabel 1). Selv om nogle

IL10

– /- kontrol undersøgt på 8-12 wks gamle mus havde histologiske scorer konsistente med mild colitis, har den gennemsnitlige histologiske score i denne kohorte ikke væsentligt fra, hvad der blev observeret i WT mus (tabel 1). Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere rapporter, at

IL10

– /- mus på C57BL /6 baggrund er resistente over for udviklingen af ​​spontan colitis når den holdes under rene Helicobacter-fri betingelser [8], [ ,,,0],9]. Vi fandt imidlertid, at T /I mus spontant udviklede colitis under disse samme rene betingelser (figur 2A). Forekomsten og sværhedsgraden af ​​spontan colitis i T /I mus steg med alderen. Minimal til ingen colon inflammation var til stede på 3 wks alderen, men colitis var tydelig i nogle mus ved 5 ugers alderen. Samlet set colitis blev scoret som moderat til svær i 81% af T /I undersøgt i alderen mellem 3 og 35 wks (n = 63) mus. Endvidere er ingen T /I mus modtog uden (13%) eller mild colitis (6%) var mindre end 20 wks gamle (figur 2A; tabel 1).

kolon histologisk score er vist som en funktion af alder for T /i (panel A) og T-het /i (panel B) mus. Hver prik repræsenterer en enkelt mus undersøgt. Stiplede linjer deler mus i grupper uden colitis (histologisk score ≤12), mild colitis (histologiske score mellem 13 og 24), og moderat til svær colitis (histologisk score ≥25). Procentdelen af ​​mus i hver af disse belastningsgraderne er vist til højre i hver figur. Markant færre T-het /I mus havde moderat til svær colitis sammenlignet med T /I mus. (P = 0,0004; relativ risiko 0,39, 95% konfidensinterval 0,22-0,68)

Nogle mus, der var heterozygote for TNF-mangel (T-het /i mus) også udviklet colitis hurtigt efter fravænning, men var betydeligt mindre tilbøjelige til at gøre det i forhold til T /i mus (relativ risiko 0,39, 95% konfidensinterval 0,22-0,68; p = 0,0004) (figur 2B). Samlet, colitis blev scoret som moderat til alvorlig hos kun 51% af T-het /I mus undersøgt (n = 78). I markant kontrast til T /I mus, hvor 100% af musene 30 wks gamle havde moderat til svær colitis (n = 17), kun 38% af T-het /I mus undersøgt på 30 wks gamle (n = 13) havde moderat til svær colitis (figur 2B). Selvom de gennemsnitlige histologiske scorer for T-het /I mus var lavere end T /I mus for aldersgrupper på 8-12 wks og 26 + wks (tabel 1), denne forskel skyldtes primært faldet% af T-het /I mus med colitis undersøgt på disse aldre snarere end nogen genotype-relateret forskel i colitis sværhedsgrad

i sig selv

(figur 2).

histologiske scorer for T-het /i og T /i mus beskrevet ovenfor inkluderet mus, der krævede eutanasi for colitis-relaterede humane endepunkter, foruden mus, som blev prospektivt aflivet for vævs høst på forhånd specificerede tidspunkter. Kaplan-Meier analyse viste, at T /I mus var signifikant mere tilbøjelige til at dø eller kræve eutanasi af humane grunde end T-het /I mus (hazard ratio = 2,28; 95% konfidensinterval: 1,35-3,85; p = 0,0032; log rank test) (figur 3). Taget sammen med data om colitis sværhedsgrad (fx histologiske scoringer), disse data viser tydeligt, at TNF ikke er nødvendig for udvikling af klinisk signifikant alvorlig colitis i

IL10

– /- mus. Tværtimod manglende evne til at producere tilstrækkelig TNF er en stærk risikofaktor for den spontane udvikling af alvorlig og potentielt dødelig IBD i en indstilling af IL-10-mangel.

Sandsynligheden for overlevelse som en funktion af tid er vist for T-het /i vs. T /i mus. Censurerede data for mus aflivet før opnå humane endpoints er markeret med en lille lodret streg. Antallet af mus i fare er tilvejebragt under grafen. T /I mus var signifikant mere tilbøjelige til at dø eller kræve eutanasi af humane grunde end T-het /I mus (p = 0,0032; log rank test).

respons T /I Mus til intestinal barrierenedbrydning Via NSAID Eksponering

NSAID’er, såsom piroxicam forbedre apoptose af tyktarmsepitelet, hvilket fører til fejl i den mucosale barriere, der tillader bakterier i det intestinale lumen til at kontakte og potentielt aktivere immunceller placeret i lamina propria [12 ]. At bestemme, hvordan defekter i TNF-produktion påvirkes responser til mucosale barriere forstyrrelser, T-het /I og T /I mus blev udsat for 200 ppm af NSAID’et piroxicam i deres kost i 7 dage; piroxicam blev afbrudt, og blev observeret mus i yderligere 16 dage før aflivning til vurdering af colitis sværhedsgrad. Selv om nogle T-Het /I mus forekom modstandsdygtige over for udvikling af colitis spontant (figur 2B), piroxicam-eksponerede T-het /I mus ensartet udviklet colitis (middelværdi histologisk score = 38 ± 3; n = 14). 86% af T-het /I mus overlevede til den planlagte undersøgelse endpoint 16 dage efter seponering af piroxicam. Alvoren og histologiske mønster af kolon inflammation observeret i piroxicam-eksponerede T-het /I mus svarede til det observeret i T-het /I mus, der udviklede colitis spontant og ikke adskiller sig fra, hvad der blev observeret i T /I mus eksponeret på lignende til piroxicam (middelværdi histologisk score = 45 ± 3; n = 5; p = 0,11). Selv sværhedsgraden af ​​enhver spontan colitis i disse T /I mus kunne ikke vurderes før piroxicam eksponering, deres colitis sværhedsgraden post-piroxicam svarede til, hvad der blev observeret i T /I mus, der udviklede spontan colitis i fravær af piroxicam eksponering ( sammenligne med tabel 1). Men kun 17% (1 af 6) af piroxicam-eksponerede T /I mus overlevede indtil den planlagte undersøgelse endepunkt 16 dage efter afbrydelse af piroxicam (p = 0,007; Fishers eksakte test).

Histologi af Colitis i T /i mus ligner at set i human UC

terminalen tyktarm /endetarm blev betændt i 100% af T /i mus (n = 40) undersøgt histologisk ved ≥15 ugers alderen. Inflammation typisk var kontinuerlig, der begynder ved endetarmen og typisk skred proximalt på en lineær måde at involvere de fleste eller alle af tyktarmen. I sjældne tilfælde, T /I mus havde inflammation begrænset til terminalen colon /rectum (n = 1, ved 5 wks) eller til den distale colon plus rectum (n = 2, ved 5 wks). Lamina propria af rektum og mere proximale inflammeret væv af T /I mus var pakket med inflammatoriske celler, herunder et stort antal neutrofiler. Crypt bylder og sårdannelse var almindelige, men inflammation generelt ikke strække sig forbi muscularis slimhinden og ind i submucosa (figur 4A). Mønstret og sværhedsgraden af ​​inflammation, der blev observeret i T-het /I mus med spontan (ikke vist) eller piroxicam-udløst colitis (figur 4B) var identisk med de observerede i T /I mus (figur 4A). I modsætning hertil, når udløst i mus deficiente i IL-10 alene, colon inflammation var karakteristisk transmural (figur 4C), med områder af betændelse vidt adskilte af ikke-betændte områder ( “skip læsioner”). En sammenligning af placeringen og omfanget af betændelse i

IL10

– /- vs. T /I mus er præsenteret i figur 5. Colitis i

IL10

– /- mus var typisk mest omfattende i den proksimale colon, efterfulgt af coecum og rektum; medianen berørte areal i hvert segment var ≤30%. I modsætning hertil mange T /I-mus havde størst muligt omfang score, med inflammatoriske forandringer præsentere i 60% af arealet undersøges i hvert colon segment. T /I mus havde således en væsentlig større grad af sygdom i 4 af de 5 colon regioner undersøgte forhold til

IL10

– /- mus (figur 5). Baseret på disse funktioner, histologi colitis i TNF-deficiente T /I mus (og TNF-haplo-utilstrækkelige T-het /I mus) lignede det, der typisk ses i human UC, mens colitis hos mus enkeltvis mangelfuld i IL 10 mere lignede den, der ses i human CD.

A. Spontan colitis i T /I mus (rektum vist) er kendetegnet ved epithel-hyperplasi og infiltration af lamina propria med inflammatoriske celler, herunder store antal neutrofiler. Crypt bylder er almindelige (pil). Inflammation involverer typisk kun slimhinden, med lidt at ingen inflammation til stede i submucosa (Sub M). B. Piroxicam-udløst colitis (vist) og spontan colitis (ikke vist) i T-het /I mus har en lignende histologisk apprearance til colitis i T /I mus (rectum vist; pil angiver krypt absces). C. I modsætning hertil (vist rectum) colitis i

IL10

– /- mus er typisk transmural som angivet ved pilespidser, med inflammation til stede i submucosa og /eller muscularis propria (MP). D, E. Colon kræftformer, der udvikler sig i T /I mus (og T-het /I mus, ikke vist) er typisk mucinøse adenokarcinomer, der kan vise omfattende lokal invasion. Den i D tumor er fra proximal colon; tumoren i E er fra endetarmen. M angiver mucin søer. Blæk på tumor (pilespidser) indikerer invasion helt igennem tarmvæggen (pilene i E point til serøse overflade). F. T /I (og T-het /I, ikke vist) mus med colitis ofte udstillet pladecellekræft metaplasi i endetarmen, som kunne give anledning til karcinomer med både kirtel og sqamous funktioner (pile). G. Højere forstørrelse af mucinøs adenocarcinom i en T /I mus. H, I. T /I mus, der fik placebo fødevarer spontant udviklede svær colitis ved 8 wks gamle (I), hvorimod T /I mus, der fik matchede fødevarer, der indeholder antibiotika viste ingen tegn på inflammation på dette tidspunkt (H). Pil angiver en krypt abcess, vist ved større forstørrelse i J. Scale bar = 100 um i A – C, F – J og 1 mm i D og E.

% af colon område, der udstillede inflammatoriske forandringer i hvert segment af tyktarmen (en vurdering kræves for beregning af histologiske scoringer [12]) er vist for en kohorte af

IL10

– /- mus med colitis udløst af udsættelse for piroxicam (n = 14) og en alder-matchede kohorte af 11-12 wk T /i mus med spontan colitis (n = 14). Den stiplede linje angiver medianen berørte areal i hvert kolon segment. De p-værdier viste repræsenterer sammenligning af sygdommens udbredelse (involverer 0-60% vs. 60% af segmentet område). I de 2 genotyper anvendelse af Fishers eksakte test

inflammationsassocierede Colonic neoplasi i T /i og T-het /i Mus

Colon inflammation er blevet vist at prædisponere for udvikling af inflammation-associerede neoplasi i både mennesker og i musemodeller for IBD, herunder

IL10

– /- mus [8] – [10], [22] – [27]. Vi fandt det samme at være sandt i T /I og T-het /I mus med colitis. 93% af T /I mus (n = 40) undersøgt på 15 wks alderen havde moderat til svær colitis. Neoplastiske læsioner blev observeret i koloner på 63% denne kohorte, med et gennemsnit på 2 neoplastiske læsioner /mus (range 0-4). De fleste af disse læsioner var invasive mucinøse adenokarcinomer karakteriseret ved relativt kedelig udseende søjleformede epitelceller og omfattende produktion af mucin danner “mucin søer” (figur 4D, E, G). Progression til lokalt fremskreden sygdom, hvor tumor invaderet gennem væggen af ​​colon (figur 4D-G) var almindeligt i mus ældre end 25 wks, men ingen lymfeknude eller andre metastaser blev observeret. Omfattende squamous metaplasi var ofte til stede i rektum fra disse mus og nogle carcinomer med skællede komponent blev observeret, især i rectum (figur 4F). Kun 65% af T-Het /I blev undersøgt på ≥15 wks gamle mus havde moderat til svær colitis (n = 52). Forekomsten af ​​neoplasi i denne kohorte var 54%, med en middelværdi på 2 neoplastiske læsioner /mus (range 0-6; n = 36). Alle mus med neoplasi havde histologiske scoringer ≥40. Således ligner mennesker med UC [22] – [24]., T /I og T-het /I mus har en øget risiko for at udvikle tyktarmskræft i fastsættelsen af ​​betændelse

Antibiotika Forhindre Udvikling af spontan colitis i T /i Mus

IBD øjeblikket hypotese at resultere fra en patogen immunrespons mod colitis-inducerende (colitogenic) mikrobiota i en modtagelig vært. For at teste den hypotese, at colitis i T /I mus resulterer fra patogene immunresponser til stigninger i colitogenic bakterier, der naturligt forekommer på tidspunktet for fravænning [28], T /I mus blev vænnet til at forbruge kost med eller uden 4 lægemiddelcocktail af amoxicillin, clarithromycin, metronidazol, og omeprazol indtil 8 wks gamle. Selv om dette 4 lægemiddelcocktail oprindeligt blev udviklet til udryddelse af Helicobacter-infektioner i mus, har vi vist, at det også undertrykker eller udrydder colitogenic bakterier og er således også i stand til at forebygge udviklingen af ​​colitis hos helicobacter-free

IL10

– /- mus, der udsættes for piroxicam [8]. T /I mus, som modtog mad uden antibiotika udviste ensartet svær colitis når undersøgt ved 8 ugers alderen (gennemsnit histologisk score ± SEM = 49 ± 4, n = 8; Figur 4I, J). I modsætning hertil T /I mus, der modtog dette 4 stof antibiotisk cocktail i deres mad fra tidspunktet for fravænning havde ingen tegn på colon inflammation på 8 wks gamle (betyde histologisk score ± SEM = 2 ± 1, n = 5; Fig 4H ).

Systemiske Responses af T /i mus til bakteriel Challenge

ovennævnte undersøgelser endeligt viser, at spontan udvikling af colitis i T /i mus er drevet af colitogenic bakterier. Cytokinet TNF er typisk en større bestanddel af antibakterielle svarene og er blevet antaget at være kritiske for IBD patogenese, eftersom behandling med visse anti-TNF lægemidler har været yderst effektive til behandling af IBD i mennesker. Men vores undersøgelser viser, at evnen til at producere TNF ikke er nødvendig for udviklingen af ​​IBD i

IL10

– /- mus. Til at begynde at forstå, hvordan TNF og IL-10 kan påvirke reaktioner på mikrobiel eksponering, vi bestemt hvordan mus med varierende kombinationer af vildtype og null alleler for

TNF

IL10

reagerede systemisk til <