PLoS ONE: CCL21 /CCR7 Forhindrer Apoptose via ERK Pathway i Human Ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Tidligere vi bekræftet, at CC kemokinreceptor 7 (CCR7) fremmer celledeling via den ekstracellulære signal -regulated kinase (ERK) pathway, men dens rolle i apoptose af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier forbliver ukendt. A549 og H460 celler af NSCLC blev anvendt til at undersøge virkningen af ​​CCL21 /CCR7 på apoptose under anvendelse af flowcytometri. Resultaterne viste, at aktivering af CCR7 ved sin specifik ligand, eksogen kemokinligand 21 (CCL21), var forbundet med et betydeligt fald i procent af apoptose. Western blot og real-time PCR-assays viste, at aktivering af CCR7 signifikant forårsaget opregulering af anti-apoptotiske bcl-2 og nedregulering af pro-apoptotisk bax og caspase-3, men ikke p53, på både protein og mRNA-niveauer. CCR7 lille interfererende RNA betydeligt svækket disse effekter af eksogen CCL21. Desuden, PD98059, en selektiv inhibitor af MEK som afbryder aktiveringen af ​​downstream ERK, betydeligt afskaffet disse virkninger af CCL21 /CCR7. Co-immunpræcipitationseksperimenter yderligere bekræftet, at der var et samspil mellem p-ERK og bcl-2, Bax, eller caspase-3, især i nærvær af CCL21. Disse resultater antyder kraftigt, at CCL21 /CCR7 forhindrer apoptose ved at opregulere ekspression af bcl-2 og ved nedregulering af ekspressionen af ​​Bax og caspase-3 potentielt via ERK-vejen i A549 og H460 celler af NSCLC

Henvisning.: xu Y, Liu L, Qiu X, Liu Z, Li H, Li Z, et al. (2012) CCL21 /CCR7 Forhindrer Apoptose via ERK Pathway i Human ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 7 (3): e33262. doi: 10,1371 /journal.pone.0033262

Redaktør: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary, Harvard Medical School, USA

Modtaget: November 3, 2011; Accepteret: 6 februar 2012; Udgivet: 16 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kemokiner, en familie af lavmolekylær pro -inflammatory cytokiner, er blevet beskrevet som vigtige mediatorer ikke kun i cellulær trafficking, organudvikling, vævsombygning, og tumormetastase [1] – [3], men i andre biologiske begivenheder, såsom angiogenese, lymfopoiese, proliferationer, og apoptose [ ,,,0],4], [5]. Deres biologiske aktiviteter medieres af interaktion med kemokinreceptoren familien af ​​G-protein-koblede receptorer (GPCR’er) (dvs. C, CC, CXC og CX3C receptorer) [6]. C-C kemokinreceptor 7 (CCR7), en af ​​CC kemokinreceptorer, udtrykkes på alle naive T-celler, nogle memory T-celler, B-celler og modne dendritiske celler [7]. CCR7 interageret med dets ligander, kemokinligand 19 (CCL19) og kemokinligand 21 (CCL21) [8], spiller vigtige roller i lymfocyttrafik og homing til lymfeknuder under immune og inflammatoriske reaktioner [9] – [11].

Vores tidligere undersøgelse viser, at CCR7 i høj grad udtrykkes i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler, og at CCL21 /CCR7 fremmer proliferation af A549 og H460-celler af NSCLC via ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) pathway [ ,,,0],12], [13]. ERK, en mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK) familiemedlem, er relateret til celleproliferation, differentiering, cellecyklusregulering, celleoverlevelse, og apoptose [14] – [17]. Men rollen som CCR7 i apoptose af humane NSCLC celler ikke er klarlagt,.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge effekten og reguleringsmekanisme af CCL21 /CCR7 interaktion på apoptose af A549 og H460 menneskelig NSCLC celler. Vi demonstrerede her, at CCL21 /CCR7 forhindrer celle apoptose ved at opregulere ekspressionen af ​​anti-apoptotiske bcl-2 og ved nedregulering af ekspressionen af ​​pro-apoptotisk bax og caspase-3, men ikke p53, som er potentielt medieres via ERK-vejen i NSCLC celler. Denne undersøgelse forudsat roman bevis for mekanismerne i overlevelse CCR7-medieret kræftceller, og det kan være nyttigt for at udforske target behandling af NSCLC.

Resultater

CCL21 /CCR7 forhindrer apoptose af A549 og H460 celler. I vores tidligere undersøgelse, vi identificeret et højere CCR7 udtryk niveau A549 og H460 humane NSCLC cellelinjer, og dets aktivering fremmer celledeling [12], [13]. For at bestemme om aktivering af CCR7 påvirker også apoptose af A549 og H460 celler, blev CCR7 aktivering og inhibering induceret med eksogent CCL21 og med CCR7 lille interfererende RNA (siRNA), henholdsvis [13]. Annexin V-farvning-assay blev udført under anvendelse af flowcytometri for at bestemme virkningen af ​​CCL21 /CCR7 på apoptose af A549 og H460-celler. Som vist i figur 1, at andelen af ​​præ-apoptotiske celler i CCL21 gruppe væsentligt reduceret, sammenlignet med de andre (alle

P

0,01), mens der ikke var nogen signifikante forskelle mellem de andre (alle

P

. 0,05), implicerer, at aktiveringen af ​​CCR7 kan hæmme apoptose af A549 og H460 celler mens effekten af ​​CCL21 kan afskaffes ved hæmning af CCR7

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer efter transfektion med CCR7 siRNA (siCCR7). Efter behandling blev apoptose estimeret ved anvendelse Annexin V-farvning som beskrevet i Methods. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. ** P 0,01, sammenlignet med kontrolceller

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer efter transfektion med CCR7 siRNA (siCCR7. ). Efter behandling ekspressionen af ​​bcl-2, Bax, caspase-3 og p53 på både protein (a) og mRNA (b) blev estimeret ved anvendelse af western blot (a) og real-time PCR (b) som beskrevet i Fremgangsmåder. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 eller ** p. 0,01, sammenlignet med kontrolceller

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer efter eksponering til PD98059, en selektiv inhibitor af MEK som afbryder aktivering af downstream ERK, i 1 time. Efter behandling blev apoptose vurderes ved anvendelse af Annexin V-farvning. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05, sammenlignet med kontrolceller

A549 (A) og H460 (B) celler blev behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer efter udsættelse for PD98059, en selektiv inhibitor. MEK som afbryder aktivering af downstream ERK, i 1 time. Efter behandling blev ekspressionsniveauerne af disse komponenter estimeres ved anvendelse western blot. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 eller ** p. 0,01 sammenlignet med kontrol celler

A549 (A) og H460 (B) celler i fravær eller tilstedeværelse af CCL21 (100 ng /ml) i 24 h blev underkastet immunpræcipitation med antistoffer mod bcl-2 eller IgG, efterfulgt af western blotting for bax og caspase-3 (a). Gensidig immunfældning med antistoffer mod bax eller IgG blev analyseret ved Western blotting for bcl-2 og caspase-3 (b). Gensidig immunfældning med antistoffer mod caspase-3 eller IgG blev analyseret ved Western blotting for bcl-2 og Bax (c).

inhibering af apoptose er involveret i regulering af anti-apoptotiske bcl-2 og pro-apoptotisk bax og caspase-3, men ikke p53 i A549 og H460 celler. Det er blevet fastslået, at apoptose i celler er hovedsageligt involveret i ekspressionen af ​​bcl-2, Bax, caspase-3 eller p53 [4], [18] – [20]. For at bestemme mulig mekanisme, ved hvilken aktivering af CCR7 inhiberede apoptose af A549 og H460 celler, blev western blot og real-time PCR assays. Som vist i figur 2, blev ekspressionen på både protein og mRNA-niveauer af anti-apoptotiske bcl-2 og af pro-apoptotisk bax og caspase-3 henholdsvis opreguleres og nedreguleres i CCL21 gruppe, sammenlignet med de andre (alle

P

0,01), mens der ikke var nogen signifikante forskelle mellem de andre (alle

P

0,05). Interessant nok har ekspressionen af ​​pro-apoptotisk p53 ikke er blevet ændret (

P

0,05. N-fold værdier for genekspression skifte op til 0,5 og under 2 blev taget som ikke er væsentlige i overensstemmelse med værdierne opnået fra negative kontroldyr gener [47], [48].