PLoS ONE: miR-200b Forhindrer prostatakræft EMT, Vækst og Metastasis

Abstrakt

miRNA regulere genekspression ved post-transkriptionel niveau og finjustere de vigtigste biologiske processer, herunder kræft progression. Her demonstrerer vi inddragelse af miR-200b i metastatisk spredning af prostatakræft. Vi identificerede miR-200b som en downstream mål for androgen receptor og knyttet sit udtryk til nedsat tumorigenicitet og metastatisk kapacitet i prostata kræftceller. Overekspression af MIR-200b i PC-3-celler inhiberede signifikant deres proliferation og dannelse af subkutane tumorer. Desuden er der i en ortotopisk model, MIR-200b blokeret spontan metastase og angiogenese ved PC-3-celler. Dette faldt metastatisk potentiale var sandsynligvis på grund af tilbageførsel af epitel-til-mesenchymal overgang, som fremgik af øget pan-epitel markør E-cadherin og specifikke markører for prostata epitel, cytokeratiner 8 og 18. I modsætning hertil mesenkymale markører, fibronektin og vimentin, sås signifikant nedreguleret af mIR-200b. Vores resultater tyder på en vigtig rolle for miR-200b i prostatakræft progression og angiver dens potentielle nytteværdi for prostatakræft terapi

Citation:. Williams LV, Veliceasa D, Vinokour E, Volpert OV (2013) miR-200 mia inhiberer Prostata Cancer EMT, vækst og metastase. PLoS ONE 8 (12): e83991. doi: 10,1371 /journal.pone.0083991

Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, USA

Modtaget: 23. september 2013; Accepteret: 11. november 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Williams et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Herman L . Kretschmer Fund via Northwestern University Urologi Department (OV), Spore i prostatakræft Pilot Award P50 CA090386 (OV), Diversificering videregående uddannelse Fakultet i Illinois Fellowship Grant (LVW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MicroRNA (miRNA) er korte, (21-22 nukleotider) ikke-kodende RNA, der binder til mRNA og undertrykke genekspression ved mRNA nedbrydning /destabilisering eller gennem forringet oversættelse [1]. MicroRNA først transskriberet som 100 bp primære miRNA hårnål strukturer, som efterfølgende spaltes af drosha i pre-miRNA og eksporteres fra kernen til cytoplasmaet til videre forarbejdning [2], [3]. Spaltning af præ-miRNA ved Dicer proteiner giver 22 bp dobbeltstrengede molekyler, hvoraf en streng er selektivt læsset på Argonaute proteiner, som letter miRNA binding til 3’UTR målsekvenser på mRNA. MiRNA spiller afgørende roller i flere udviklings- og patologiske processer, herunder kræft i bryst, hud, lunge, og livmoderhalsen [4] – [9].

miRNA HSA-miR-200b tilhører en familie, der omfatter miR-200a, miR-200C, miR-141, og miR-429. Dysregulering af mir-200b er blevet tilskrevet en afgørende rolle i epitelial til mesenkymale overgang (EMT) og metastase i kræftformer som bryst-, mave-, og bugspytkirtelcarcinomer [10] – [12]. Humant miR-200b deltager i en dobbelt spiral med de to transkriptionelle regulatorer af E-Cadherin, ZEB1 og ZEB2 [13]. I normale epitelceller, er MIR-200b udtrykt i høje niveauer; ved at målrette 3’UTR regioner af pro-metastatisk transkriptionelle faktorer ZEB1 og ZEB2 det blokerer udtryk og standser EMT [10]. I modsætning hertil mesenkymale celler, hvor ZEB1 /ZEB2 udtryk er usædvanlig høj, de undertrykker miRNA af miR-200 familie ved at blokere deres promotor-aktivitet [13]. Flere undersøgelser vurderer miR-200b funktion i EMT, selv om der er nogle forsøg på at løse sin rolle i den primære tumorvækst.

Her viser vi, at miR-200b besidder en lignende aktivitet i prostatakræft. Søger at identificere miRNA at bidrage til nedsat aggressivitet og tumorigenese i prostatacancer, udførte vi miRNA profilering af cellelinier med inducerbar ekspression af androgenreceptor tidligere udviklet i vores laboratorium. Vi fandt, at MIR-200b blev signifikant opreguleret i de dårligt tumorgene PC3 AR-positive celler, og at overekspression af MIR-200b førte til nedsat tumorvækst. Dette faldt tumorigenese skyldtes sandsynligvis nedsat proliferation. På den anden side, miR-200b kraftigt opreguleret epitelcellen markør E-cadherin i PCA-celler, mens de mesenchymale markører Fibronectin og vimentin var samtidig faldet. Efter aftale med de udførte i andre tumortyper analyser blev ZEB1, en transkriptionel regulator af E-Cadherin også faldet på miR-200b overekspression. Desuden miR-200b reducerede den invasive potentiale PCA celler

in vitro

og nedsat metastaser. Vores resultater viser, at miR-200b nedsætter tumorvækst og vender EMT i prostatakræft.

Metoder

Dyrevelfærd Assurances

Alle undersøgelser med forsøgsdyr (mus) blev godkendt af Northwestern University Animal Care og brug Udvalg og udføres i overensstemmelse med de retningslinjer, der er vedtaget og foreslået af National Institutes of Health (Animal forsikring nummer A3283-01, udløbsdato 2014/05/31).

cellelinier og behandling betingelser

PC3-celler transficeret med inducerbar vildtype androgen receptor (AR) eller kontrol plasmid blev etableret tidligere [14]. Celler blev holdt i RPMI-medium suppleret med 10% Tetracycline-free kalvefosterserum (FBS), 2% penicillin /streptomycin, 50 ug /ml Zeocin og 1 ug /ml Blasticidin. For AR ekspression blev PC3-AR celler behandlet i 5 dage med 1 ug /ml doxycyclin og 1 nM methyltrienolone (R1881) i phenolrødt frit RPMI medium suppleret med 10% trækulstrippet FBS, 2% penicillin /streptomycin, 50 ug /ml Zeocin og 1 ug /ml Blasticidin. De parentale PC3 celler blev opretholdt i RPMI med 10% FBS og 2% penicillin /streptomycin. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2, i en befugtet inkubator.

immunblotting

Celler blev udpladet ved en densitet på 100.000 celler pr 10 cm skål. Cellerne blev opsamlet ved at skrabe i phosphatbufret saltvand (PBS) og centrifugeret ved 2.500 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten blev lyseret i RIPA-buffer (Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 1X protease /phosphatase inhibitor-opløsning (Thermo Scientific, Waltham, MA) og centrifugeret ved 12.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Koncentrationen af ​​supernatanten blev bestemt tre gange ved proteinassay (DC Protein Assay, Biorad, Hercules, CA). Lysaterne blev elektroforesebehandlet på 4% -20% Tris HCL polyacrylamidgeler (Biorad, Hercules, CA). Protein lysat blev overført natten over på PVDF-membraner (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA). Hver membran blev skyllet i 1X Tris-bufret saltvand med 0,1% Tween 20 (TBS-T), blokeret med 5% fedtfri mælk i TBS-T og probet med antistoffer som angivet i tabel S3.

RNA Ekstraktion

til miRNA detektion, blev total RNA isoleret med miRNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA). For mRNA-ekstraktion, tumorer var snap-frosset i flydende nitrogen og overføres til RNA stabilisering opløsning (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). Tumorerne blev holdt ved -80 ° C, og RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA koncentration og renhed blev målt med NanoVue Plus spektrofotometer (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).

Real Time RT-PCR

RNA blev revers transkriberet med miScript II RT Kit (Qiagen , Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Det resulterende cDNA blev anvendt til realtids-PCR-analyse under anvendelse miScript SYBR Green PCR-kittet (Qiagen, Valencia, CA). For enkelte miRNA kvantificering anvendte vi miScript Primer Assays (Qiagen, Valencia, CA). For polymerasekædereaktion (PCR) analyse blev fremadrettede og reverse primere udformet og købt hos Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) og reaktioner udført ved anvendelse af SYBR Green super mix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD). Reaktionerne blev udført i et termisk iCycler (Biorad, Hercules, CA). Hver prøve blev testet tredobbelt.

miRNA array analyse

PC3-AR-celler blev behandlet med doxycyclin (Dox) og R1881 (som beskrevet ovenfor) til ekspression og aktivering af Androgen receptor (AR) , henholdsvis. RNA blev ekstraheret som beskrevet ovenfor og 5 pg af hver prøve blev sendt til LC Sciences (Houston, TX) hvor array analyse. Prøver blev mærket med Cy

3 eller Cy

5 og intensiteten forholdet mellem hver blev anvendt til at bestemme de ændringer i miRNA ekspressionsniveauet. En 20-nucleotid RNA kontrol sekvens komplementær til flere kontrolpunkter prober spottet på hver chip blev inkluderet i hver prøve som en intern kontrol. Mikroarrayene blev udført in triplo for humane, muse- og rotte-sekvenserne. Den potentielt mål frekvenser til at vælge miRNA blev defineret ved hjælp af Sanger miRBase 11.0. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af t-test for p 0,10, p 0,05 og p. 0,01

miR-200b Overekspression

Shuttle vektor kodning forløber sekvens HSA-miR-200b (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) og kontrol vektor (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) fra System Biosciences (SBI, Mountain View, CA) blev opformeret i Luria Broth 50 pg /ml ampicillin natten over ved 30 ° C i en orbitalryster. Endotoxinfrit plasmid-DNA blev isoleret ved anvendelse Endo-Free Maxi Prep kit (Qiagen, Valencia, CA). Lentivirale partikler blev fremstillet for hvert plasmid i HEK293T celler under anvendelse af pMD2.G kuvert og psPAX2 2

nd generation emballage plasmider (AddGene, Cambridge, MA). Titeren blev bestemt ved flowcytometri af inficerede celler som tidligere [15] beskrevne. For transfektion blev PC3-celler udsået i 6-brønds plader ved 10

5 celler /brønd. Den følgende dag blev mediet erstattet med 1 ml 1X DMEM indeholdende den passende MOI på lentivirale partikler til MIR-200b og tom vektor kontrol. Efter 6 timers inkubering blev cellerne fodret med RPMI med 10% FBS og 2% penicillin /streptomycin og inkuberet i yderligere 48 timer. Transducerede celler udtrykker høje niveauer af RFP markør blev isoleret og flowcytometri kombineret med cellesortering og opretholdt i RPMI med 10% FBS, penicillin /streptomycin og 1 ug /ml puromycin for yderligere udvælgelse.

tumordannelse assays

(1) Subkutan inokulation.

Parental PC3-celler, blev PC3-celler transduceret med kontrol lentivirus og mIR-200 mia celler dyrket som beskrevet ovenfor, høstet og resuspenderet ved 2 x 10

7 celler /ml i serumfrit RPMI. Et hundrede pi cellesuspension (2 × 10

6 celler /mus) blev injiceret subkutant i de bageste bagfjerdinger af athymiske hanmus (nu /nu, n = 5). Tumorerne blev målt med microcalipers tre gange om ugen, og forsøget blev afsluttet på 29 dage efter implantation. Tumorerne blev snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C til efterfølgende analyse.

(2) ortotopisk implantation af tumorceller blev udført som tidligere beskrevet [16].

Kort fortalt blev midterlinjen indsnit foretaget, overlegen i forhold til det genitale område af liggende bedøvede mandlige atymiske mus (nu /nu). Blæren blev eksternaliseres og udvidet med en vatpind til at afsløre de sædblærer og dorsum af prostata. Tumorceller i 50 pi serumfrit RPMI (10

6 per dyr) blev injiceret i prostata og musklen og huden blev lukket med suturer og metalklemmer hhv. Alle procedurer blev udført i sterile omgivelser. Metalklemmer blev fjernet 2 uger efter injektion. Tumorvækst blev overvåget ved GFP-fluorescens under anvendelse af små dyr billedbehandlingssystem OV100 (Olympus). Eksperimentet blev afsluttet 20 dage efter implantation. Tumorerne blev udskåret og lynfrosset til efterfølgende analyse. For at vurdere metastase, blev den tilbageværende fluorescens målt efter fjernelse af den primære tumor.

proliferationsassav

Cellerne blev podet tre gange i 96-brønds plader ved 3 × 10

3 celler /godt. Efter 24, 48 og 72 timer, 10 pi WST-1 reagens (Roche, Indianapolis, IN) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 2 timer. Absorbansen blev målt for hvert tidspunkt ved 450 nm bølgelængde under anvendelse af Biorad mikropladelæser (Biorad, Hercules, CA).

In Vitro

Invasion Assay

Transwell skær (Corning, Tewksbury, MA) blev coatet med 100 pi 1 mg /ml phenolrødtfrit vækstfaktor Reduceret Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) og fik lov at størkne ved 37 ° C i en vævskultur-inkubator i 24 timer . Cellerne blev resuspenderet ved en tæthed på 10

6 celler /200 pi i serumfrit RPMI, podet i dubletter i den øverste del af de coatede inserter og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer, med 700 pi 10% FBS tilsat til det nederste kammer som en kemoattraktant. Cellerne blev fikseret og farvet ved anvendelse DiffQuick fiksativ opløsninger (Dade Behring, Malvern, PA) og 6 felter blev afbildet for hver eksperimentel betingelse. Invasionen blev beregnet som procent invaderede celler. Eksperimentet blev udført to gange.

Cell Cycle Analysis

Cellerne blev podet ved 10

6 celler /ml i RPMI suppleret med 0,2% FBS. Efter 48 timer blev cellerne trypsineret, vasket to gange i kold PBS, fikseret i 10 ml 75% iskold ethanol og opbevaret natten over ved -20 ° C. Cellerne blev vasket to gange i 1X PBS ved 4 ° C, resuspenderet i 2,0 ml DAPI farvning opløsning (0,1% Triton X 100 i 10 ml PBS, 100 pi 1 mg /ml DAPI) og analyseret ved FACS.

Statistisk analyse

Alle kvantitative data blev genereret fra mindst to uafhængige forsøg poolede sammen, med hver enkelt datapunkt udført i tre eksemplarer. Standardafvigelse (SD) blev beregnet ved brug af Microsoft Excel software. For at bestemme statistisk signifikans af de observerede difffrences er der udført parvise sammenligning af datasættene, ved hjælp af en-halet t-test. Statistisk signifikans blev sat til P-værdi på højst 0,05.

Resultater

miR-200b opreguleres ved AR

Tidligere data fra vores gruppe viste, at androgen receptor (AR) hæmmer tumorigene egenskaber af AR-negative prostatacancer-cellelinie, PC-3 [14]. MicroRNA er vigtige modifikatorer af biologiske funktioner, herunder tumorvækst. Vi søgte miRNA, der er kontrolleret af AR og involveret i den negative regulering af prostatakræft progression. Til dette formål har vi udført miRNA profilering af tidligere genereret cellelinie med tetracyklin-inducerbar AR ekspression ([14], Fig. 1a). Cellerne blev behandlet med doxycyclin (Dox) for at sikre AR ekspression og med R1881, at inducere AR nuklear translokation og transkriptionsaktivitet.

(A) Western blot for at bekræfte inducerbar AR ekspression i PC3-AR celler. PC3-AR-celler blev behandlet 5 dage med doxycyclin at inducere AR ekspression og med R1881 at inducere AR aktivering og nuklear translokation. Sammenligningen er at ubehandlet kontrol. Totale cellelysater blev anvendt til analyse. (B). Heat kort over miRNA-ekspression i PC3-AR og kontrol celler. Totalt RNA fra celler i A blev anvendt til microarray analyse, og hver prøve analyseret i tre eksemplarer. Den statistiske signifikans for udtryk ændringer vist er blevet bestemt ved hjælp af t-test. P-værdier 0,05 blev tilskrevet statistisk signifikans

Microarray analyse viste statistisk signifikant differential udtryk for 837 individuelle miRNA som respons på AR aktivering. (P 0,05, som bestemt ved Students t-test), af som 116 var viste P-værdier under 0,01 (figur 1b, tabel S1 og S2). Vi valgte miRNA, der blev ændret mere end 2 gange og analyseret deres potentielle mål og funktioner ved hjælp af Sanger miRBase-version 11.0 og Diana Micro T version 3.0. Otte miRNA blev udvalgt på grundlag af deres potentielle engagement i kræft progression som blev bestemt ved

i silico

analyse og offentliggjorte undersøgelser. Fem af de udvalgte miRNA opreguleret i de mindre tumorigene PC3-AR celler blev også forbundet med nedsat tumorigenese i andre cancere (tabel 1). MicroRNA fra MIR-200 klynge (MIR-200a, MIR-200b) er blevet vist at virke som tumorsuppressorer i gastrisk, hals-, lunge-, bryst- og prostatacancer [9], [10], [17], [18] . Forøgede MIR-200C-niveauer har været forbundet med nedsat metastase i melanom, pladecellecarcinom, og prostatacancer [6], [18], [19]. MIR-30a og miR 30-d-ekspression er signifikant reduceret i kronisk myeloid leukæmi, ikke-småcellet lungekræft, nyrecellecarcinom, og prostatacancer [20] – [23]. I modsætning hertil blev MIR-7 og MIR-9 niveauer faldt i mindre tumorigene cellelinie. I overenskomst har miR-7 er blevet identificeret som et onkogen i renalcellecarcinom [24] og miR-9 tilskrevet en rolle i leukemogenesis [25] – [27]. Lav miR-196a niveauer blev observeret i malignt melanom [28] (Tabel 2).

Vi har valideret vælge microRNA identificeret ved array analyse hjælp real-time PCR. Faktisk MIR-200b, 30a, og 30d blev forøget, og MIR-9 faldt, og disse ændringer var statistisk signifikant (p ≤ 0,05) (figur 2a). Vi valgte MIR-200b for yderligere analyse, da det viste den højeste gange ændring og på grund af dets kendte rolle i EMT og metastase [10], [13].

(A). Mirna udtryk blev normaliseret til at kontrol- celler (Ctrl). PC3-AR og kontrolceller blev behandlet 5 dage med doxycyclin at inducere AR ekspression og med R1881 at inducere AR aktivering og nuklear translokation og totalt RNA til analyse. Sammenligningen er at ubehandlet kontrol og RNU1A_1 ikke-kodende RNA anvendes som en intern kontrol. Den statistiske signifikans af observerede forskelle sammenlignet med kontrol er * p ≤ 0,05, og ** p≤0.01 som blev bestemt ved én-halet t-test. Den gennemsnitlige værdi beregnes for to uafhængige forsøg udført tredobbelt. (B) AR aktivering opregulerer MIR-200b. PC3-AR-celler (grå søjler) blev behandlet 5 dage med både doxycyclin at fremkalde AR udtryk og med R1881 til at fremkalde AR aktivering og nuklear translokation. Sammenligningen er at ubehandlet kontrol. Flutamid blev tilsat hvor det er angivet til at blokere AR-aktivitet. Kontrol (ctrl) PC3-AR celler blev efterladt ubehandlet. RNU1A_1 ikke-kodende RNA blev anvendt som en intern kontrol. *, P 0,05; **, P 0,01, som bestemt ved Students T-test. De gennemsnitlige værdier blev beregnet for to uafhængige forsøg udført tredobbelt.

Vi målte MIR-200 mia niveauer i PC3-AR-celler behandlet med kombinationen af ​​doxycyclin, et syntetisk androgen R1881 og anti-androgen flutamid , en kompetitiv inhibitor af AR funktion. MIR-200b blev øget betydeligt i reaktion på R1881 og denne stigning blev afskaffet ved flutamid i en dosisafhængig måde, hvilket tyder på en direkte transkriptionel regulering af AR (figur 2b).

miR-200b Undertrykker Vækst af prostatakræft xenografter

Vi næste søgt effekten af ​​miR-200b udtryk på prostatakræft tumorigenese. Vi overudtrykt MIR-200b i PC3-celler ved transduktion med høj titer lentivirus, under anvendelse tom vektor (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) som negativ kontrol, og bekræftet MIR-200b ekspression af real-time RT-PCR (figur 3a). De resulterende cellelinier og parentale PC3 celler blev subkutant injiceret i mandlige athymiske nøgne mus. Vigtigt er det, tumorer dannet af cellerne, der udtrykker MIR-200b var signifikant mindre derefter dannet ved den parentale PC3 tumorer og cellerne transduceret med kontrol-vektor (figur 3b). Vigtigere, blev MIR-200b ekspression opretholdt under hele forsøget, som blev verificeret ved real-time RT-PCR (figur 3c). Fordi tumor interaktioner med dens mikromiljø spiller en kritisk rolle i tumorprogression, udførte vi ortotopisk implantation af PC3-200b og styre cellelinier som beskrevet tidligere [16] i den dorsale prostata af mandlige athymiske mus. Vi benyttede sig af RFP markør inkorporeret i bicistroniske lentivirusvektoren at udføre langsgående

in vivo

billeddannelse. Den samlede fluorescens pre-dissektion var signifikant lavere i mus, der bærer PC3 MIR-200b positive tumorer sammenlignet med vektoren kontrolgruppen (figur 3d, e). Således MIR-200b-ekspression var tilstrækkelig til at reducere tumorvækst. Endvidere billeddannelse af mave efter tumor fjernelse afslørede væsentligt mindre fluorescens som følge af sekundære læsioner, hvilket antyder, at MIR-200b faldt både den primære vækst og metastase af PC-3-PCA-celler (se nedenfor).

A) Forceret ekspression af mIR-200b i PC3-celler. PC3 celler blev trasduced med en bicistronisk lentiviral shuttle-vektor (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) kodning HSA-miR-200b og tomme vektor kontrol (ctrl). Total RNA blev isoleret og miR- 200b ekspression måles under anvendelse af real-time RT-PCR. Værdierne repræsenterer tre uafhængige forsøg udført in triplo. *, P≤0.01. (B) MIR-200b reducerede tumorigenese af PC-3-celler. Parentale PC3 celler, PC3-celler trasduced med miR kontrol (ctrl) og MIR-200b blev subkutant injiceret i de bageste bagfjerdinger af athymiske hanmus (n = 5). Tumorvægt på dag 29 efter injektion er vist. *, P ≤ 0,05; **, P≤0.01. (C) Tumorerne opretholdt MIR-200b ekspression. Relativ MIR-200b ekspression blev målt ved real-time RT-PCR i tumorerne fra panelet (B). * P ≤ 0,05. (D). miR 200b nedsat tumorvækst i en ortotopisk model for prostatacancer. RFP-mærkede PC3-ctrl og PC3-200b celler blev implaned i prostata af athymiske hanmus. Den gennemsnitlige fluorescens blev målt 20 dage efter injektion. (E) Fluorescens pr dyr blev bestemt ved anvendelse af hele kroppen billeddannelse, med Olympus OV100 system. *, P ≤ 0,05. (F) Cellevækst blev målt ved WST-1 assay. PC3-ctrl eller PC3 MIR-200 mia celler blev podet ved 3000 celler per brønd i en plade med 96 brønde. Absorbans blev målt ved angivne tidspunkter ved anvendelse af en Biorad Model 680-mikropladelæser. Resultaterne viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg udført in triplo. *, P ≤ 0,05 ved t-test. (G, H) Tumor snit blev farvet for Ki-67, for at evaluere proliferation. Bemærk et signifikant fald i Ki-67-positive kerner i nærvær af MIR-200b. *, P. 0,001

miR-200 mia hæmmer proliferationen i PSA Cells

Søg faktorer, der bidrager til den nedsatte tumorvækst, vi udførte cellecyklus analyse af PC3 kontrol og PC3 miR- 200 mia celler og observeret en svag stigning i G2 /M fase om miR-200 mia positive celler tyder cellecyklusstop (figur S1). Faktisk WST-1 assay for levedygtige celler afslørede en let, men signifikant reduktion i celleantal i MIR-200 mia positive celler i sammenligning med vektorkontrol (figur 3g, h). Kombineret med signifikant fald i Ki-67 positive kerner i PC-3 tumorer på miR-200b udtryk (figur 3f), vores resultater tyder på, at den observerede faldt i tumorvækst var forårsaget af nedsat proliferation.

miR- 200 mia vender Epiteliale at Mesencymal Overgang i PCA Celler

i tidligere undersøgelser, miR-200b udtryk i bryst, mave, og renalcellecarcinom korrelerer med den mere differentieret tilstand, og re-introduktion af miR-200b vender EMT [ ,,,0],10], [11], [29]. Disse ændringer kan i sidste ende bidrage til både nedsat tumorvækst og metastase. Derfor analyserede vi niveauerne af kendte EMT og differentieringsmarkører udtrykt af PC-3-celler i nærvær eller fravær af MIR-200b. Først viste Western blot-analyse en betydelig stigning i de typiske differentieringsmarkører af prostata epitel Cytokeratin Ck8 og CK18 af MIR-200b, hvilket antyder en mere differentieret tilstand af MIR-200 mia positive celler (figur 4).

(A ). CK 8 og CK 18 blev analyseret ved Western blot af totale proteinlysater fra PC3-Ctrl og PC3 MIR-200 mia celler. (B) Kvantitativ analyse af forsøget (A) med Image J software. Grafen repræsenterer data gennemsnittet af to uafhængige forsøg. *, P ≤ 0,05 og **, p. 0,01 af t-test

Efter aftale, niveauerne af E-cadherin blev også forøget (figur 5a), hvilket tyder på et skift i retning epitelial fænotype . Endvidere vimentin, en mesenchymal markering, undergik et statistisk signifikant fald upon MIR-200b ekspression. En anden mesenchymal markering, fibronectin (FN), der vises en lignende tendens, men faldet ikke nåede statistisk signifikans (figur 5b). Fordi der i tidligere undersøgelser miR-200b styret E-Cadherin og EMT ved undertrykkelse af den transkriptionelle faktor ZEB1, har vi vurderet både totale ZEB1 protein og RNA-niveauer i miR-200b-positive og kontrol PC-3 celler. Vi observerede en signifikant og reproducerbar nedgang i ZEB1 protein og mRNA i respons på MIR-200b (figur 5c, d). Dette resultat er i overensstemmelse med den forøgede E-cadherin ekspression (figur 5a). Vores resultater viser tydeligt, at MIR-200b ekspression fremmer epitelcellen egenskaber og undertrykker mesenchymal funktioner i PC3-celler. Salg

(A) Markers ramt af MIR-200b i PC-3-celler. E-cadherin, Fibronectin, og vimentin blev påvist i helcellelysater fra PC3 ctrl og PC3 MIR-200 mia celler ved Western blot. (B) Kvantitativ analyse af forsøget er vist i (A) udføres med Image J software. *, P 0,05 og **, p≤0.01 som bestemt ved t-test. To uafhængige forsøg blev samlet sammen. (C) Western blot for ZEB1 og kvantificering udført som ovenfor (gennemsnittet af to eksperimenter er vist). (D) End-point PCR for ZEB1. (E)

In vitro

transwell invasion assay: sammenligning af PC3-Ctrl og PC3 miR-200 mia celler. 10% FBS blev anvendt som kemoattraktant og eksperimentet blev udført i dobbeltbestemmelse. *, P 0,05 ved t-test. (F)

in vivo

spontane metastaser ved PC3-Ctrl og PC3 miR-200 mia celler. Cellerne blev implanteret orthotopisk i de ventrale prostata mandlige nøgne mus. Musene blev udsat for hele kroppen billeddannelse til RFP-positive masser ved hjælp Surface billede. Ved slutningen af ​​eksperimentet blev dyrene aflivet, bughulen åbnes og metastase visualiseret ved fluorescens billeddannelse efter fjernelse af en primær tumor inde i bughulen og på forvæggen af ​​maven (bughulen). Bright felt (BF) og fluorescens (RFP, rødt fluorescerende protein) er vist. (G) Kvantificering af forsøget er vist i (F). Metastaserne blev talt og totale fluorescens pr metastase beregnet (venstre). Gross metastatisk byrde blev estimeret som total fluorescens per mus. Ctrl indikerer kontrol og 200b angiver MIR-200b. **, P≤0.01 ved t-test.

miR-200b Fald Invasion og metastase af PC-3 Celler

Fordi miR-200b forårsagede EMT vending i PCa PC 3 celler, var det rimeligt at forvente en nedsat invasiv potentiale som godt. Under anvendelse af en standardprocedure til måling celleinvasion, observerede vi en signifikant fald i procentdelen af ​​invaderede celler på grund af MIR-200b ekspression sammenlignet med kontrol (figur 5e). Dette faldt invasion sandsynligvis ligger til grund for faldet regionale metastaser af PC3 miR-200 mia celler

in vivo

.

ortotopisk injektion af forældrenes PC-3 og vektor kontrol celler ind i de dorsale prostata af atymiske hanmus resulterede i spontan metastase, som blev påvist efter fjernelsen af ​​de primære tumorer (fig. 5f og figur S2). Den overordnede fluorescens på grund af metastaser blev dramatisk reduceret i mus implanteret med PC-3 celler, der overudtrykker miR-200b (figur 5f, g og Figur S2). Således vores data tyder på, at miR-200b signifikant nedsætter mesenkymale funktioner i prostata kræftceller og reducerer dermed deres invasive egenskaber og metastatisk potentiale.

miR-200b Reducerer tumorangiogenese

En anden funktion, der kan gøre det muligt metastaser er angiogenese og EMT er ofte ledsaget af forøget angiogenese. Udtrykket af miR-200b syntes at vende angiogene kontakt i PC-3 celler som fremgik af nedsat mikrovaskulær tæthed i miR-200 mia positive tumorer i forhold til forældrenes pc-3 eller vektor kontrol tumorer (fig. 6).

Snit fra tumorerne dannet af kontrol og mIR-200 mia positive PC-3 tumorer blev farvet for endotel markør CD31 og antallet af mikrokar hver mark bestemt i ti 10 × felter. *, P. 0,01

Diskussion

MIR-200 familie er en tumor-undertrykkende familie af microRNA, der spiller kritiske roller i undertrykkelse af EMT. Mens den rolle, MIR-200 familie i bryst- og nogle andre epiteliale cancere er veletableret, er der kun få fund forbinder MIR-200 med prostatacancer. En lille skala undersøgelse (20 patienter) antyder en sammenhæng mellem den biokemiske tilbagefald efter radikal prostatektomi og de lavere niveauer af miR-200c [30]. Et studie af He

et al.

Viser, at lave niveauer af MIR-200b-3p i androgen-uafhængige celler skyldes reduceret ekspression af p-53-relateret protein p73 og bidrage til øget proliferation [31] . De to klynger koder MIR-200 familie findes på kromosom 1 og 12, med MIR-200b, MIR-200a, og MIR-429 på kromosom 1 og MIR-200C og MIR-141 på kromosom 12. MicroRNA 200c menes at være epitel-specifik og dets ekspression er undertrykt af hypermethylering af den proksimale CpG ø i fibroblaster og i brystcancercellelinier [32]. I PC-3, men ikke i LNCaP og DU145 PCA celler, svarende hypermethylering af CpG øen falder sammen med de lave niveauer af miR-200c og ​​miR-141 [32]. I overensstemmelse med vores resultater, i denne undersøgelse PC3 celler negative for MIR-200C og MIR-141, viser en klar mesenchymale fænotype og evnen til invasion og metastase [32]. To undersøgelser viser rollen for miR-200 i tumorigenese ved PCA stamceller. I stamceller-lignende PCA-celler ekspressionen af ​​Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B og /eller Notch1 er konsistent med forøget klonogene overlevelse og evnen til at danne sfæroider (prostaspheres). Disse stamceller-lignende funktioner er forbundet med nedsat ekspression af miR-200b /c og /eller lade-7 familie hvorved re-ekspressionen af ​​miR-200 hæmmer prostasphere dannelse og mindsker Notch1 og Lin28B, førere af selvfornyelse [33] . I en uafhængig undersøgelse, den invasive tumorgene kloner afledt af benign prostatahyperplasi (BPH) -1 cellelinje kronisk udsat for TGF-p display fremtrædende EMT funktioner med høje niveauer af SNAI2, ZEB1, og ZEB2, alle bekræftede MIR-200 mål; Men de basale miR-200 niveauer i disse celler forbliver uændret antyder en divergerende mekanisme [34].

De augmented stamceller-lignende funktioner foreslår forbedret tumorgenicitet. Faktisk har flere grupper vist, at miR-200b ændrer væksten i eksperimentelle tumorer ved de dyrkede PCA celler [35]. Vores data klart bekræfter disse observationer.