PLoS ONE: Autophagy Hæmning Fremmer 5-Fluorouraci-induceret apoptose ved at stimulere ROS Formation i Human ikke-småcellet lungekræft A549 celler

Abstrakt

Kemoterapi er en vigtig mulighed for behandlingen af ​​forskellige kræftformer, herunder lungekræft. Imidlertid har tumor modstand mod cytotoksisk kemoterapi bliver mere almindelige. Det er blevet rapporteret, at autofagi er en af ​​de processer, der bidrager til denne resistens. I nærværende undersøgelse fandt vi, at den anti-cancer drug 5-fluorouraci (5-FU) kunne fremkalde autofagi i A549 celler. 5-FU behandling kan føre til omdannelse af LC3 I /II, opreguleringen af ​​Beclin-1, nedreguleringen af ​​P62 og dannelsen af ​​sure vesikulære organeller (AVOS) i A549-celler. Forbehandling af cancerceller med 3-MA eller siAtg7 kunne forbedre 5-FU-induceret apoptose gennem aktivering af caspaser, og caspaseinhibitoren z-VAD-fmk reddet reduktionen cellernes levedygtighed. Desuden hæmning af autofagi stimuleret også ROS dannelse og latrintømning af ROS ved antioxidant NAC hæmmede caspase-3 aktivitet, forhindrede frigivelse af cyt-c fra mitokondrier og til sidst reddet kræftceller fra 5-FU-medieret apoptose. Disse resultater antyder, at 5-FU-fremkaldte autophagic respons spiller en beskyttende rolle mod celle apoptose og inhibering af autofagi kunne sensibilisere dem til 5-FU-induceret caspase-afhængig apoptose gennem stimulering af ROS-dannelse.

Henvisning : Pan X, Zhang X, Sun H, Zhang J, Yan M, Zhang H (2013) Autophagy Hæmning Fremmer 5-Fluorouraci-induceret apoptose ved at stimulere ROS Formation i human ikke-småcellet lungekræft A549 Cells. PLoS ONE 8 (2): e56679. doi: 10,1371 /journal.pone.0056679

Redaktør: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Japan

Modtaget: 13. oktober 2012; Accepteret: 12 januar 2013; Udgivet: 18 februar 2013

Copyright: © 2013 Pan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af et projekt af Shandong provinsen Højere Uddannelse Videnskab og Teknologi Program (J10LC66) og National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81.102.828, 81.273.037, 81.202.516). Forfatterne ønskede også at vise påskønnelse til Natural Science Foundation i Shandong provinsen i Kina (nr ZR2011HM011). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige ondartede sygdomme i verden og den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald i mange lande. Omtrentlig 85% af lungekræft tilfælde tilhører ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) [1], [2]. Kemoterapi er en vigtig mulighed til at kurere eller kontrollere lungekræft. 5-fluorouracil (5-FU), som udøver sine anticancer effekter gennem inhibering af thymidylatsyntase og indarbejdelsen af ​​dets aktive metabolitter i RNA og DNA for således at påvirke uracil metabolisme og eventuelt føre til apoptose i cancercellen [3] . I de seneste årtier, 5-FU-baserede kombinationsterapier er standard behandlinger for mange patienter diagnosticeret med forskellige maligne tumorer, herunder NSCLC [4] – [6]. Men sammen med dens anvendelse, har resistens mod 5-FU blevet almindelige og er blevet anerkendt som en årsag til fiasko mange kræftformer terapi [7], [8]. Derfor har mange forsøg blevet udført for at reducere modstanden og forbedre dens terapeutiske effektivitet. Selv om mange aggressive behandlinger, såsom nye lægemidler kombineret med 5-FU, har forbedre patienternes overlevelse, stadig langt fra tilfredsstillende effekten af ​​disse behandlinger på nuværende tidspunkt. Det er derfor ønskeligt at finde mere hensigtsmæssige terapeutiske muligheder for NSCLC. Heri rapporterer vi induktion af autophagy med 5-FU i humane NSCLC A549 celler.

I de seneste årtier har apoptose induktion været den store overvejelser i anti-cancer lægemiddeludvikling. Men kræftceller udløser flere veje til at flygte fra apoptose [1]. For nylig er autofagi blevet bredt undersøgt i cancerterapi. Ud over sin husholdning rolle ved fjernelse fejlfoldede eller aggregerede proteiner, clearing beskadigede organeller og eliminere intracellulære patogener, autofagi har flere fysiologiske og patofysiologiske funktioner i cancerterapi. Mange undersøgelser har fokuseret på forholdet mellem autophagy og tumor patogenese, udvikling og behandling. , Autophagy synes dog at spille en paradoksal rolle i kræftcellen overlevelse og død. I kemoterapi, når cellerne støde på nogle anti-cancer medicin, er autophagy induceres til at beskytte kræftceller mod apoptose for celle overlevelse. Hertil autophagy er anerkendt som en cytobeskyttende proces [7], [9] – [11]; I mellemtiden har nyere undersøgelser vist, at hæmningen af ​​autofagi inducerer sænket apoptotisk niveau derfor autofagi deltager i opregulering af apoptose [12], [13]; Endvidere ligesom apoptose, autofagi er også en alternativ rute for programmeret celledød, kaldet type II programmeret celledød [14] – [16]. Formentlig kan rolle autofagi afhænge af typen af ​​tumor og stimuli, den fase af tumorigenese og apoptotisk status i tumorceller. Passende modifikation af autofagi, at inhibering af cellebeskyttende autofagi øge apoptose af tumorceller som respons på anticancermidler kan forbedre effekterne af kemoterapi [9]. Således, ud over apoptotisk respons, studiet af autofagi er en prospektiv retning for udviklingen af ​​lægemidler mod cancer.

Reaktive oxygenarter (ROS) spiller en vigtig rolle i en række cellulære programmer under fysiologiske som samt patologiske tilstande. Når det produceres i moderate mængder, ROS fungere som signalmolekyler i signaltransduktionsveje at regulere cellevækst, differentiering, overlevelse, inflammation og immunresponset [17]. På den anden side, når alt produceret, de deler evnen til at påføre oxidative skader på vitale biologiske molekyler, ligesom DNA, lipider og proteiner, som ændrer deres funktionalitet og forårsager svækkelse af cellulær integritet [18]. I de seneste år, stigende evidens for, at ROS er impliceret i autophagy induktion i kræftbehandling [19] – [21], hvilket tyder på, at ROS spiller en afgørende rolle som reaktion på kræftlægemidler er deregulering af ROS-dannelse i forbindelse med kræft initiering, progression og medikamentresistens.

i denne undersøgelse undersøgte vi den mekanisme ligger til grund for anti-cancer virkninger af 5-FU i A549 lungecarcinom. Vi fandt, at 5-FU induceret autofagi i A549-celler og inhibering af autofagi kan føre til forbedring af 5-FU-medieret apoptose. Endvidere demonstrerede vi den mekanisme, autophagy hæmning sensibiliseret celle til apoptotisk celledød var ved at øge dannelsen af ​​ROS, som til sidst lettet frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier, som efterfølgende forbedret caspase-afhængig apoptose.

Materialer og metoder

Cell kultur

de humane NSCLC celler A549 blev opnået fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellerne blev dyrket med RPMI-1640 medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C under en fugtig atmosfære af 95 % luft og 5% CO

2. Celler i den logaritmiske vækstfase blev anvendt i denne undersøgelse.

Kemiske reagenser og antistoffer

5-FU, 3-MA, 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphnyl-2H-tetrazolium (MTT), 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanin iodid (JC-1) og 5- (og 6) -carboxy-2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) blev alle anskaffet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-LC3, anti-Beclin1, anti-P62, anti-cytochrom c, anti-spaltet caspase9, anti-spaltet caspase8, anti-spaltet caspase3 og anti-spaltede PARP-antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) . Anti-actin-antistof eller det andet antistof blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. Celler blev podet i 96-brønds fladbundede mikrotiterplader ved en densitet på 1 x 10

4 celler /ml med 100 pi per brønd, inkuberet i 24 timer og derefter udsat for de angivne koncentrationer af 5-FU i de angivne tidsrum . Efter behandling blev 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml) tilsat til hver brønd og inkuberet i en befugtet 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C i 4 timer. Krystallerne blev derefter opløst i 100 pi dimethylsulfoxid /brønd. Absorbansen af ​​opløsningen blev målt ved 490 nm med en mikrotiterpladelæser (Bio-Tek ELX800). Cellelevedygtighed blev beregnet ifølge følgende formel: Cellelevedygtighed (%) = A490 (prøve) /A490 (kontrol) x 100. Mindst tre gentagelser blev udført for hver behandling.

Immunofluorescens for LC3

Niveauet af LC3 blev undersøgt ved hjælp af en immunofluorescens assay ifølge vores tidligere rapport [22]. Kort fortalt blev A549-celler podet på dækglas. Efter behandling med 5-FU (10 uM) i 48 timer i nærvær eller fravær af 3-MA (5 mmol /l), blev celler fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter. Efter fiksering blev cellerne permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i 30 minutter og derefter blokeret med 2% BSA i 1 time ved stuetemperatur. Efter blokering blev cellerne inkuberet med anti-LC3 (1:400 fortyndet i BSA-puffer) antistof ved 4 ° C natten over og omsættes derefter med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret gede-anti-kanin IgG (1:100 fortyndet i BSA-puffer) i 1 time ved 37 ° C. Kernen blev farvet med 1 pmol /L DAPI (Sigma-Aldrich) i 5 min. Derefter blev opdaget LC3 puncta og farves kerne under et fluorescensmikroskop og fusionerede (Olympus, Japan).

Påvisning af sure vesikulær organeller (AVOS)

For at kvantificere udviklingen af ​​Avos, A549 celler podet i 24-brønds fladbundede mikrotiterplader ved en densitet på 1 x 10

4 celler /ml med 1 ml per brønd og inkuberet i 24 timer. Efter behandling med 10 pM 5-FU i 48 timer i nærvær eller fravær af 3-MA (5 mmol /l) blev celler farvet med 1 pM acridinorange ved 37 ° C i mørke i 15 minutter, derefter vasket to gange med PBS. Billeder af AO farvning blev visualiseret straks med fluorescens mikroskop. For at kvantificere antallet af sure vesikler i de behandlede celler blev andre celler udsået i 6-brønds plader. Efter farvning med AO i PBS ved 37 ° C i 15 minutter, blev cellerne høstet, vasket to gange i PBS og resuspenderet i 200 pi PBS, derefter analyseret ved flowcytometri assay. Grøn (500-550 nm, FL1 kanal) og rød ( 650 nm, FL3 kanal) fluorescens, som blev belyst med blåt (488 nm) lys excitation, blev målt ved anvendelse flowcytometer med CellQuest analysesoftware (Becton Dickinson)

Apoptose detektion ved flowcytometri

påvisningen blev udført ved AnnexinV-FITC Apoptose Detection Kit (BD Biosciences, San Diego, USA). Breifly, Celler blev podet i 6-brønds plader og inkuberet i 24 timer og derefter udsat for 10 uM 5-FU i 48 timer i nærvær eller fravær af 3-MA (5 mmol /l). Efter behandling, ca. 1 × 10

6 celler blev høstet, vasket to gange i PBS, og derefter farvet med Annexin V-FITC og PI ifølge producentens anvisninger. Den resulterende fluorescens blev påvist ved flowcytometri med CellQuest analysesoftware.

mitochondriemembran Potential (MMP) Analyse

Værdierne af mitochondriemembranpotential blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse JC-1-farvning ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev de behandlede-cellerne opsamlet, vasket med PBS og inkuberet med 10 pM JC-1 i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. De positive celler blev derefter detekteret ved flowcytometer med CellQuest analysesoftware.

Måling af reaktive oxygenarter (ROS)

ROS-niveauer blev bestemt ved anvendelse af fluorescerende markør 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA). Kort fortalt blev de behandlede-celler trypsiniseret, vasket og inkuberet med 10 pM DCFH-DA i 30 minutter i mørke, og intensiteten af ​​fluorescens blev efterfulgt af flowcytometer med CellQuest analysesoftware.

Måling af cytochrom C Slip

mitokondrier fraktion og cytosol fraktion blev udarbejdet af forskellige centrifugering som Jie Li, beskrev MD [3]. Kort fortalt blev de behandlede-cellerne høstet og vasket to gange med PBS, derefter blev resuspenderet i en sucrose-puffer (250 mM saccharose, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI pH 7,5 suppleret med 1 mM PMSF, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin A, 5 ug /ml aprotinin, og 5 mM DTT) på is i 30 minutter. Cellerne blev homogeniseret og derefter centrifugeret ved 1000 g i 10 minutter ved 4 ° C til fjernelse kerner og ubrudte celler. Fraktionen mitochondrier blev derefter pelleteret ved centrifugering ved 10.000 g i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev centrifugeret yderligere ved 100.000 g i 60 minutter ved 4 ° C for at få cytosolen fraktion.

Caspase aktivitetsassay

Aktiviteten af ​​caspase-3 blev målt ved anvendelse af kommercielt tilgængelige caspase kolorimetrisk assay kits (Beyotime, Kina). Kort fortalt, efter behandlingen med angivne midler blev A459-celler høstet og vasket med PBS ved centrifugering ved 600 g i 5 minutter ved 4 ° C. Cellepellets blev resuspenderet i lysepuffer og efterladt på is i 15 minutter. Lysaterne blev centrifugeret ved 160.000 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev opsamlet for caspase 3-aktivitet assay i lysis buffer indeholdende Ac-DEVD-pNA ifølge kits anvisninger. Koncentrationen af ​​pNA blev målt ved 405 nm med en mikrotiterpladelæser, der bruges som en indikation af caspase 3-aktivitet.

Western blot-analyse Salg

A549-celler, inkuberet med de respektive betingelser, var høstet og lyseret. Samme mængde protein blev separeret ved SDS-PAGE (5-15%) og overført til PVDF-membraner. De blottede membraner blev blokeret med 5% skummetmælk i 1 time og derefter inkuberet med de ønskede primære antistoffer (fortynding 1:1000) natten over ved 4 ° C. Så de immunreaktive bånd blev visualiseret ved forøget kemiluminescens under anvendelse af peberrodsperoxidasekonjugeret IgG sekundære antistoffer. Til kvantificering lige påsætning blev membranen probet igen med β-actin-antistof.

Undersøgelse af autophagosome ved TEM

A549-celler blev fikseret i 2,5% glutaraldehyd ved 4 ° C natten over, og efterfikseret med 1% OSO

4 i 1,5 timer. Derefter blev cellerne farvet med 70% ethanol mættet med uranylacetat, efterfulgt af gradient dehydrering med ethanol-acetone, og til sidst indlejret i epoxyharpiks for afsnit. De ultratynde snit blev dobbelt farvet ved uranylacetat og blycitrat og analyseret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM)

RNA-interferens af Atg7

Atg7 RNA-interferens blev opnået ved transfektion af A549-celler med Atg7- målrettet siRNA og verdenserklæringen kontrol siRNA (Invitrogen; 100 pmol /brønd). Korte oligo-RNA’er blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Efter 24 timer transfektion blev cellerne behandlet med 5-FU i yderligere 48 timer. Derefter blev cellerne opsamlet og cellelysater blev underkastet immunoblotting af Atg7, LC3 og PARP. Celler blev også behandlet for cellelevedygtighed og apoptose-analyse.

Statistisk analyse

Resultaterne udtrykkes som middelværdi ± SD (n≥3). Statistisk analyse mellem de to grupper blev beregnet ved hjælp af t-test, og flere grupper blev udført af SPSS 10.0 program.

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

5-FU hæmmer celledeling i A549 celler

For at undersøge 5-fluorouracil s potentielle cellevækstinhibering i A549-celler blev virkningen af ​​5-FU behandling på celler undersøges med MTT-assay. Som vist i fig. 1A, 5-FU (0-200 uM) producerede en dosis- og tidsafhængig reduktion i A549 cellevækst. IC50 i 48 timer af 5-FU behandling i A549-celler var 10,32 ± 0,69 uM. Baseret på resultatet blev 10 uM 5-FU i 48 timer i A549-celler anvendt til yderligere eksperimenter. Desuden morfologiske ændringer anførte også, at 5-FU behandling faldt celledensitet. Interessant har 5-FU-behandlede celler ikke opstår meget indlysende apoptotiske tegn men mange vakuoler i cytoplasmaet (fig. 1B). Dette fik os til at undersøge, om 5-FU induceret autofagi også var inkluderet i lungecancerceller.

(A) Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assay efter behandling med forskellige koncentrationer af 5-FU i 24 timer og 48 timer . IC50 blev beregnet ved IC50 softwareprogram. (B) Morfologiske ændringer blev observeret efter behandling af celler med 10 pmol /L 5-FU i 48 timer ved omvendt mikroskop (Olympus, Japan). Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

5-FU inducerer autofagi i A549 celler

Efterfølgende blev transmissions elektron mikroskopi anvendes til at kontrollere dannelsen af ​​autophagosomes i 5- FU-behandlede celler. Som vist i figur 2A, behandling med 5-FU i 6-48 timer forårsagede akkumulering af autophagic vakuoler, som udviste autophagosome og /eller autolysosomal egenskaber, hvorimod kun få vakuoler blev observeret i kontrolceller. Autophagy markører LC3, Beclin-1 og p62 blev også anvendt til at undersøge de autophagic niveauer og autophagic flux i denne proces ved immunoblotanalyse. Som vist i fig. 2B er opregulering af Beclin-1, nedreguleringen af ​​P62 og omdannelsen af ​​LC3 I /II fremvist stigende dannelse af autophagosomes i en tidsafhængig måde i A549-celler.

A549-celler blev behandlet med 10 pmol /L 5-FU til forskellige tidsrum som angivet, og derefter blev påvist de autophagosomes og autophagic niveauer. (A) Dannelse af autophagosomes i behandlede celler blev kontrolleret ved TEM. (B) LC3, Beclin-1 og p62 blev undersøgt ved western blot. β-actin var en loading kontrol. Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Dernæst For yderligere at bevise autofagi induceret af 5-FU, indførte vi 3-MA, som er et populært inhibitor af autofagi [3 ]. 5 mM 3-MA blev sat til A549-celler i 1 time før 5-FU eksponering. Celler blev inddelt i fire grupper: kontrol (ingen behandling), 3-MA (behandlet med 3-MA), 5-FU (behandlet med 5-FU), og kombination (behandlet med begge af 5-FU og 3-MA) . Flowcytometri blev udført efter farvning af celler med acridinorange til kvantificering af Avós. Resultaterne viste, at antallet af sure vesikler i 5-FU-gruppen steg naturligvis, som blev inhiberet af 3-MA, der bekræfter induktionen af ​​autofagi (fig. 3A og C). Lignende resultater blev også opnået på fluorescens mikroskopisk undersøgelse. Som vist i fig. 3B, A549-celler behandlet med 5-FU i 48 timer udviste et stort antal fluorescerende vesikler i cytoplasmaet, hvorimod kun få af fluorescerende vesikler blev observeret i kontrolgruppen, 3-MA-gruppe og kombinationsgruppen. Derudover blev LC3 immunofluorescens og immunblot også udført. Fluorescens mikroskopi afslørede punktformig fordeling af LC3 fluorescens forøget i 5-FU-gruppen (fig. 3D). Western blot anførte også, at ekspressionen af ​​LC3 i kombination gruppe delvist tilbage til den oprindelige tilstand, samtidig, afspejler den effektive inhiberende virkning af 3-MA (fig. 3E). Disse resultater viste sig at autofagi blev induceret i 5-FU-behandlede A549-celler. Derfor besluttede vi at undersøge, om inhiberingen af ​​autofagi påvirker følsomheden af ​​A549 celle til 5-FU behandling.

Celler blev forbehandlet med 5 mmol /l 3-MA i 1 time før udsættelse for 10 mmol /l 5-FU i 48 timer, derefter acridinorange blev anvendt til at farve AVOS blev fluorescensaktiveret celler analyseret ved flowcytometri (A). Efter behandling blev cellerne farvet med acridinorange for AVO observation. Cellerne blev visualiseret under et rødt filter fluorescensmikroskop (B). TIL kvantificering af celler udvikler AVO i A549-celler, blev procentdelen af ​​udviklede AVOS beregnes på basis af resultaterne af fluorescens-aktiveret cellesortering assay (C). Fluorescensmikroskop ved immunfluorescensfarvning for LC3 i den behandlede-A549-celler (D). Western blot-analyse blev udført for at påvise LC3 proteinniveauer. Blots blev igen bevist med anti-β-actin som et loading-kontrol (E). Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Autophagy hæmning øger 5-FU-induceret apoptotisk celledød

For det første at undersøge, om hæmning af autofagi sensibiliserer A549 celler til 5-FU-induceret celledød, blev virkningen af ​​behandling undersøgt med MTT-assayet (fig. 4A). I kombinationen gruppen, levedygtighed A549-celler faldet hurtigere end i 5-FU-gruppen, kombinationsgruppen kørte 65,75% af cellerne ihjel, om en stigning 39,28% i, at der i 5-FU-gruppen. Selvom cellen levedygtighed i 3-MA-gruppe også faldet, omfanget var ikke signifikant. Disse resultater indikerede, at 3-MA forøger 5-FU-induceret celledød i A549-celler. Dernæst at validere den observation, at inhibering af autofagi påvirker celle følsomhed over for 5-FU, Annexin V-FITC og PI farvning blev udført. Flow cytometic analyse viste, at antallet af AV- og AV /PI-positive celler signifikant forøget i kombinerede gruppe behandling end 5-FU-only behandlingsgruppe (fig. 4B). For yderligere at bekræfte dette, bødlerne, caspase-8, caspase-9, caspase-3 og PARP blev derefter undersøgt. I 5-FU-behandlede grupper, blev de alle spaltes i deres specifikke aktive former, og aktiviteten i de 5-FU-behandlede celler med inhiberet autofagi var signifikant højere end i celler behandlet med 5-FU alene (fig. 4C).

Celler blev forbehandlet med 5 mmol /l 3-MA i 1 time før udsættelse for 10 pmol /L 5-FU i 48 timer. (A) Cellelevedygtigheden blev målt med en MTT assay. Data repræsenterer middelværdier af fire uafhængige forsøg. (B) Cell dødeligheden blev analyseret af Annexin V assay ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og metoder. (C) Cellelysater blev fremstillet og underkastet immunoblotting med antistoffer mod caspase-9, caspase-8, caspase-3, PARP, og β-actin. Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

rolle autophagy i 5-FU-cytotoksicitet blev yderligere undersøgt ved at banke ned Atg7 udtryk ved hjælp siRNA. Som vist i fig. 5, udtryk for Atg7 blev markant undertrykt i A549-celler transficeret med Atg7 siRNA, men ikke dem med kontrol siRNA (Fig. 5A). Følgelig celler transficeret med Atg7 siRNA viste reduceret niveau af LC3-II ophobning og forøget niveau af clPARP efter 5-FU-behandling (fig. 5A). Desuden blev den cytotoksiske virkning af 5-FU forøges betydeligt ved at blokere Atg7 ekspression og pancaspase inhibitor z-VAD-fmk reddet celledøden (fig. 5B). Tilsvarende blev graden af ​​apoptose induceret af 5-FU også forbedret, når vælte den Atg7 ekspression og z-VAD-fmk reducerede celleapoptosen signifikant (fig. 5C). Som opsummeret i fig. 5, knockdown af Atg7 også fremskynde apoptose induceret af 5-FU. Disse resultater var i overensstemmelse med anvendelse af 3-MA, der viser, at autofagi induceret af 5-FU spiller en beskyttende rolle af tumorceller mod apoptose og blokade af autofagi efterfølgende forbedret apoptose gennem aktivering af caspaser i A549-celler.

Celler blev transficeret med Atg7 målrettet siRNA og Control siRNA i 24 timer før udsættelse for 10 mmol /L 5-FU i 48 timer. (A) Cellelysater blev fremstillet og underkastet immunoblotting med antistoffer mod LC3, Atg7, PARP, og b-actin. (B) Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse MTT assay. (C) apoptotisk celledød blev analyseret af Annexin V /PI-assay. Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Ændringer i mitokondrie membranpotentiale og frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier

Tidligere undersøgelser viste, at aktiveringen af ​​caspaser var drevet af cyt -c gennem iboende mitokondrie apoptosecyklus [23], [24]. Derfor blev virkningen af ​​hæmmet autofagi på 5-FU-medieret frigivelse af cyt-c fra mitokondrier i cytosol undersøgt ved hjælp af celle fraktionering. De resultater, vi opnåede viste, at inhibering af autofagi i 5-FU-behandlede celler førte til en drastisk stigning i akkumuleringen af ​​cytochrom c i cytosolen (Fig. 6A). Effekten på mitokondrier blev også bekræftet af et fald i mitochondriemembranpotential. Som vist i fig. 6B, inhibering af autofagi i 5-FU-behandlede celler inducerede en indlysende fald i mitochondriemembranpotential. Disse data tyder på, at tab af mitochondriemembranpotential kan være påkrævet for 5-FU kombineret 3-MA-induceret cyt-c frigivelse til cytosol, som senere udløste aktivering og kløvning af caspaser og resulterede celle apoptose.

Celler var behandlet som i fig. 3. (A) mitokondrier og cytosol fraktioner blev isoleret som beskrevet i Materialer og metoder, og derefter blev underkastet immunoblotting til detektering af cytochrom c. (B) Den MMP ændring blev vurderet ved JC-1-farvning ved flowcytometri som beskrevet i Materialer og metoder. Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Hæmning af autofagi stimulerer ROS dannelse, som er nødvendig for 5-FU-medieret apoptose i A549 celler

For nylig, flere rapporter fremlagt beviser for inddragelse af reaktive ilt arter (ROS) i induktion af autophagy og apoptose og vist betydningen af ​​ROS i frigivelse af cyt-c fra mitokondrier [25], [26]. Derfor besluttede vi at analysere, om inhibering af autofagi kan stimulere dannelsen af ​​ROS i 5-FU-behandlede A549-celler. De behandlede-celler blev farvet med chlormethyl-2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (CM-H2-DCFDA), en celle permeabel fluorescens farvestof, som reagerer på et bredt spektrum af ROS. Som vist i figur 7A, blev ROS-niveauer steg naturligvis i cellerne behandlet med 5-FU kombineret med 3-MA sammenlignet med 5-FU alene ved flowcytometri, og sådan stigning var effektivt dæmpet når cellerne blev forbehandlet med 10 mM N- acetylcystein (NAC) i 1 time. Da niveauet af ROS var forhøjet i celler med undertrykt autofagi, vi analyseret yderligere, om inhibering af ROS påvirket 5-FU-medieret celledød. Til dette formål blev ROS-dannelse inhiberet af NAC og apoptose blev målt ved flowcytometri. Som vist i figur 7B, sensibilisering af celler til 5-FU-induceret celle apoptose blev fuldstændigt blokeret ved at forhindre ROS-dannelse. Endelig undersøgte vi, hvorvidt inhiberingen af ​​ROS påvirkede caspaseaktivitet og frigivelse af cyt-c. Faktisk scavenging af ROS inhiberede caspase-3-aktivitet, forhindres frigivelsen af ​​cyt-c fra mitokondrier, og reddede A549-celler fra 5-FU-medieret apoptose (fig. 7C og D). Disse resultater viser klart indikeret, at dannelsen af ​​ROS spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​celledød som respons på 5-FU.

Celler blev forbehandlet med 10 mM NAC i 1 time før den 10. pmol /L 5-FU ( 48 h) behandling i nærvær eller fravær af 3-MA. (A) Den ROS-generering blev påvist under anvendelse DCFDA af en flowcytometer. Data blev behandlet med CellQuest software og analyseret ved densitometri. (B) Celledød blev målt ved Annexin V /PI-farvning. (C) Caspase-3-aktivitet assay blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. (D) cyt-c niveau i cytosol fraktion blev detekteret ved immunoblotting. Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Diskussion

I lungekræft, er kemoterapi almindeligt anvendt til at helbrede og udvide postoperativ overlevelse hos patienter. 5-fluorouracil (5-FU) effektivt anvendes som et lægemiddel i behandlingen af ​​en række forskellige humane cancere, herunder lungekræft. Den største mekanisme bag dens antitumoraktivitet er blevet tilskrevet indblanding af DNA og RNA-syntese. I de seneste årtier har apoptose induktion med 5-FU været den største overvejelse i cancerterapi [27] – [29]. For nylig autophagy er blevet grundigt observeret hos 5-FU behandling [3], [7], [30] – [32]. I vores undersøgelse fandt vi, at 5-FU kunne hæmme A549 celleproliferation tydeligvis (fig. 1A), som omfattede celle autofagi og apoptotisk celledød (fig. 2,3,4 og 5). Vores resultater viste også, at både LC3-II og Beclin1, som er blevet anset markør af autofagi [33], blev signifikant øget efter 5-FU behandling i A549-celler ledsaget af nedregulering af P62-ekspression (fig. 2B). I mellemtiden er den stigende dannelse af autophagosomes og /eller autolysosomal med tid detekteret ved TEM (fig. 2A) og den øgede dannelse af karakteristiske AVOS i cytoplasmiske billede anden to beviser (fig. 3A-C). Alle disse resultater viste, at autofagi blev induceret ved 5-FU.

Autophagy er et intracellulært bulk-nedbrydning, der er fundet ubikvitært i eukaryoter, som er ansvarlig for nedbrydningen af ​​de fleste langlivede proteiner og nogle organeller. Cytoplasmatiske bestanddele, herunder organeller, er afsondret i dobbelt-membraned autophagosomes og derefter sikringen med lysosomer at danne autolysosomes hvor deres indhold nedbrydes. De nedbrudte produkter recirkuleres til cytoplasmaet til genbrug [34]. Autophagy stimuleres som respons på eksterne stressfaktorer og interne behov for at opretholde cellulær metabolisme samt overlevelse. Ikke desto mindre kan autofagi også resultere i celledød kaldet “autophagic celledød” (programmeret celledød type II) gennem overdreven selv-fordøjelse og nedbrydning af vigtige cellulære bestanddele under visse omstændigheder [18], [35]. For nylig, en voksende mængde af beviser indikerer rolle autophagy i kræft formering og i respons på behandling. , I cancerkemoterapi, autofagi synes imidlertid at spille en modstridende rolle, sandsynligvis fremme eller inhibere apoptose, i cancer celleoverlevelse og død [9]. For at undersøge bidraget fra autofagi i processen med 5-FU-induceret A549-celle apoptose anvendte vi autophagy inhibitor 3-MA, en specifik inhibitor af den tidlige fase autophagic proces, i denne undersøgelse. Som forventet, 3-MA hæmmede 5-FU-induceret autophagy (fig. 3). Autophagy hæmning forstærket 5-FU-induceret celle apoptose gennem caspaser aktivering i A549-celler (fig. 4). For yderligere at præcisere, hvilken rolle autophagy i 5-FU-induceret A549 celledød, vi brugte Atg7 siRNA at banke ned Atg7 og evalueret rolle autophagy mere direkte. I overensstemmelse med resultaterne under anvendelse af 3-MA, transfektion af Atg7 siRNA inhiberes effektivt LC3-II akkumulering, øget clPARP produktion og forbedret den apoptotiske celledød induceret af 5-FU i A549-celler (fig. 5).