PLoS ONE: Methyleret Host Cell Gene Initiativtagere og human papillomavirus type 16 og 18 Forudsigelse cervixlæsioner og Cancer

Abstrakt

Ændring i værten og /eller human papillomavirus (HPV) DNA methylering profil er formentlig en af ​​de hovedfaktorer der er ansvarlige for den maligne progression af cervikale læsioner til kræft. For at undersøge disse ændringer, vi studerede 173 cervikale prøver med forskellige kvaliteter af cervikal læsion, fra normal til livmoderhalskræft. Status methylering af ni cellulære genpromotorer,

CCNA1

,

CDH1

,

C13ORF18

,

DAPK1

,

HIC1

,

RARβ2

,

hTERT1

,

hTERT2

TWIST1

, blev undersøgt ved Methylering specifik Polymerase Chain Reaction (MSP). Methylering af HPV18 L1-genet blev også undersøgt af MSP, mens de methylerede cytosiner inden for fire regioner, L1, 5’LCR, enhancer og promotor af HPV16-genomet, der dækker 19 CpG sites blev evalueret ved bisulfit sekventering. Statistisk signifikante methylering biomarkører skelnes mellem cervikale precursor læsioner fra normal livmoderhals var primært

C13ORF18

og for det andet

CCNA1

, og dem skelne livmoderhalskræft fra normale eller cervikale precursor læsioner var

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

TWIST1

. Desuden methylering analyse af individuelle CpG-stederne i HPV16-genomet i forskellige prøvegrupper, navnlig de 7455 og 7694 sites, viste sig at være vigtigere end den samlede methylering frekvens. Størstedelen af ​​HPV18 positive prøver indeholdt både methyleret og umethyleret L1-genet, og prøver med L1-genet methylerede former alene havde bedre prognose, når korreleret med værtscellesystemerne genpromotorer ‘methylering profiler. Afslutningsvis bør begge cellulære og viral methylering biomarkører bruges til overvågning af livmoderhalskræft læsion progression at forhindre invasive livmoderhalskræft

Henvisning:. Milutin Gašperov N, Sabol I, Planinić P, Grubisic G, Fistonić I, Ćorušić A, et al. (2015) Methyleret Host Cell Gene Initiativtagere og human papillomavirus type 16 og 18 Forudsigelse cervixlæsioner og kræft. PLoS ONE 10 (6): e0129452. doi: 10,1371 /journal.pone.0129452

Academic Redaktør: Robert Dante, Institut national de la santé et de la recherche médicale, FRANCE

Modtaget: December 24, 2014 Accepteret: 8. maj 2015; Udgivet: 9 Jun 2015

Copyright: © 2015 Milutin Gašperov et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den kroatiske Ministeriet for Videnskab, uddannelse og sport (tilskud 098-0982464-2510). MG blev også støttet af Den Europæiske Unions syvende rammeprogram for forskning, teknologisk udvikling og demonstration i forbindelse med tilskudsaftale Ingen 316289. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forholdet mellem human papillomavirus (HPV) status og livmoderhalskræft (CC) udvikling er veletableret. Der er mindst 15 onkogene eller høj-risiko (HR) -HPV typer, af hvilke typer 16 og 18 bidrager op til 71% af kræfttilfælde [1]. I modsætning hertil DNA methylering af cellulære og virale gener, hvilket resulterer i nedregulering af genekspression, er blevet mindre undersøgt i cervikal cancerogenesis [2], selv om det er en af ​​de tidlige begivenheder af carcinogenese i mange andre cancertyper [3]. DNA methylering ofte sker på cytosiner i CpG-dinukleotider af gener for tumorsuppressorer, transkriptionsfaktorer og cellecyklus regulatorer dermed hæmmer genekspression ved promotor silencing [4].

CC forekomst relativt sjældne i forhold til den udbredte HPV-infektion ; de fleste kvinder er sandsynligvis smittet med mindst én, hvis ikke flere typer af HPV i løbet af deres seksuelle liv, og kun en lille del vil udvikle cervical præcancerøse læsioner og derefter invasiv cancer [5,6]. Faktorer forbundet med progression fra forstadier cervikale læsioner,

jeg

.

e

. subklinisk HPV-infektion til kræft er ikke fastslået. Både virale og værtsceller gener kan målrettes ved maskiner DNA methylering [4]. Den omstændighed, at der kan påvises methylering af cellulære gener, selv i prøver taget op til syv år før livmoderhalskræft diagnose [7], var en af ​​grundene til denne undersøgelse. Herudover baseret på vores observation methylgrupperne er stabile i år efter DNA isolation og opbevaring ved -20 ° C og i overensstemmelse med diagnosen påtaget prøveudtagning. Endvidere kunne methylering af HPV-genomet være en værtsforsvarsmekanisme til undertrykkelse af transkription af fremmed DNA eller strategi, at virus bruger til at opretholde en langsigtet infektion ved immunosurveilance flugt, eller begge [8,9]. Vi antager, at methylering af CpG sites i HPV16 og HPV18 genomer, undertrykker transskription af HPV-gener er en af ​​de faktorer, der er muligvis relevant i livmoderhalsen kræftfremkaldende progression. Derfor, i dette studie har vi fokuseret på HPV16 og HPV18 positive cervikale prøver og analyseret CpG methylering af HPV16 og HPV18 genomer samt flere centrale vært celler gener.

Der er et stort behov for at etablere præcise diagnostiske og prognostisk methylering profil for et panel af gener, der kunne skelne mellem normale cervices, cervikale læsioner og kræft. Efter en gennemgang af litteraturen med fokus på dette spørgsmål ved hjælp af lignende prøve pool og laboratorieudstyr [10-14], har vi indsnævret valget til ni cellulære gener, der skal undersøges i denne undersøgelse:

CCNA1

(CCNA1, cyklin A1) ,

CDH1

(CDH1, cadherin 1, type 1, E-cadherin),

C13ORF18

(KIAA0226L, KIAA0226-lignende),

DAPK1

(DAPK1, død-associeret protein kinase 1),

HIC1

(HIC1, hypermethyleret i kræft 1),

RARβ2

(RaRb, retinsyrereceptor, beta),

hTERT1

,

hTERT2 Hotel (TERT, telomerase revers transkriptase), og

TWIST1

(TWIST1, twist familie bHLH transskription faktor 1). Promotor methylering af

CCNA1

,

C13ORF18

RARβ2

fører til afbrydelse af cellecyklus, methylering af

CDH1

,

DAPK1

,

hTERT1

,

hTERT2

HIC1

bidrage til kræft progression ved at øge spredningen, invasion, og /eller metastaser, mens methylerede

TWIST1

betyder forringet cellulær differentiering. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme methylering profil af værtscellens genpromotorer og samtidig status methylering af HPV 16 og 18 genomer til at identificere den bedste methylering diagnostiske og prognostiske biomarkører for celleforandringer i livmoderhalsen ændringer.

Resultater og Diskussion

Dette er en af ​​de få undersøgelser af en omfattende samling antal cervikale prøver med veldefinerede forskellige cytologiske /histopatologisk diagnose, der analyserer DNA methylering af adskillige cellulære genpromotorer samt HPV16 og HPV18 genomer. Lignende undersøgelser er blevet udført af flere forfattere, men enten på et begrænset antal cellulære genpromotorer eller begrænset antal analyserede HPV-typer [15-17].

Der er nogle relevante litteratur data om methylering status af cellulære gener, følgende

CCNA1

,

CDH1

,

C13ORF18

,

DAPK1

,

HIC1

,

RARβ2

,

hTERT1

,

hTERT2

TWIST1

i livmoderhalskræft cellelinjer CaSki, SiHa og HeLa [12,18-20]. Heri, methylering profiler af de ni gen testet på cellelinier CaSki og SiHa initiativtagere bekræftede, at alle testede genpromotorer blev methylerede i CC. I cellelinjen HeLa, kun

DAPK1

promotoren blev ikke methyleret. Methylering profiler af førnævnte genpromotorer blev vurderet i forskellige prøvegrupper: prøver med normal, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3 cytologi, og histopatologisk bekræftede CC (tabel 1). I prøven gruppen med normal cytologi var der 20,0% (8/40) HPV positivt med en eller flere HR-HPV, hvoraf fire HPV 16. Størstedelen af ​​prøverne blev methyleret i de fleste testede genpromotorer.

CDH1

viste sig at være methyleres i de fleste tilfælde (82,5%), efterfulgt af

HIC1

(67,5%),

RARβ2

(62,5%), og

DAPK1

(55,0%). Da de har vist sig meget methyleret i den normale cervix, disse genpromotorer er ikke ideelle for methylering biomarkører for cervikal carcinogenese. I modsætning til vores resultater, Flatley

et al

. [21] fundet

CDH1

promotor methylerede i kun 2,3% normale cervikale prøver. I modsætning hertil

hTERT1

blev fundet ikke-methyleret i alle tilfælde.

hTERT1

promotor synes at være en lovende methylering biomarkør være methyleret i normal livmoderhalsen. Så vidt dette, er der modstridende resultater af Iliopoulos

et al

. [22], som fandt

hTERT1

promotor methyleres i en højere andel 26,6% i normal livmoderhalsen. Den omstændighed, at methylering profil

hTERT1

promotor fortsat relativt lav i cervikale precursor ændringer, nemlig LSIL /CIN1 (12,5%), HSIL /CIN2 (5,1%) og HSIL /CIN3 (7,1%), og stigninger i CC prøver (70,0%) favoriserer vores hypotese (tabel 1). Selv lidt mindre udtrykte lignende methylering dynamik observeres med

hTERT2

og

TWIST1

initiativtagere. Derfor hypermethylering af alle tre genpromotorer,

hTERT1

,

hTERT2

TWIST1

kunne være godt livmoderhalskræft biomarkør, efter bekræftelse på større prøve pool. I prøven gruppen med LSIL /CIN1 diagnose var der 55,0% (22/40) HPV positive prøver, herunder seks HPV16 og ni HPV18.

CDH1

HIC1

initiativtagere blev methyleret i den højeste andel af tilfælde (75,0%, begge dele), mens

TWIST1

var umethyleret i alle tilfælde. I modsætning hertil Flatley

et al

. [21] har fundet

CDH1

og

HIC1

initiativtagere methyleret i meget lavere grad i prøver med samme diagnose, i 1,8% og 7,7% tilfælde, hhv. I tråd med vores fund, høj

HIC1

methylering (67,6%) og fuldstændigt manglende methylering i

TWIST1

promotor inden for samme diagnose blev fundet af Feng

et al

. [23]. HPV blev påvist i 32 af 40 prøver (80,0%) med HSIL /CIN2 diagnose, herunder seks HPV16 og syv HPV18. På grund af mislykket bisulfit konvertering i en prøve, studiegruppen yderligere omfattede 39 HSIL /CIN2 prøver, der er specielt er klassificeret som sådan af den kroatiske cervikal cytologi klassifikation, “Zagreb 2002” [24], med henblik på at dechifrere fine forskelle mellem LSIL og HSIL. Også her blev de fleste af prøverne methyleret i de fleste testede genpromotorer,

CDH1

bliver methyleret i de fleste tilfælde (79,5%), mens

hTERT2

var umethyleret i alle tilfælde. Blandt 42 prøver med HSIL /CIN3 diagnose HPV blev påvist i 36 prøver (85,7%), herunder 17 HPV16 og fem HPV18. blev observeret Det højeste antal denatureret sager i

CDH1

(76,2%), og den laveste i

hTERT2 Hotel (2,4%) promotor. Andre forfattere rapporterede methylering af de samme gener i den samme prøve gruppe, men lidt forskellige procentdele af methylering pr hvert gen promoter [21,23]. om dynamikken i methylering profil af disse to genpromotorer, det lader til, at

CDH1

promotor konstant hypermethyleret, mens

hTERT2

promotor er langt mindre methyleres fra normal til høj grade cervikal læsioner . I CC gruppen var der 81,8% (9/11) prøver positive for HR-HPV, hvoraf syv HPV16 og én HPV18. En CC prøve, trin IV-A, stærkt nekrotisk, HPV-negative og umethyleret i enten gen-promotor blev udelukket fra yderligere analyse. De fleste af de undersøgte genpromotorer blev methyleret i denne prøve gruppe, der spænder fra 60,0% til

DAPK1

til 100,0% for

CDH1

promotor. Blandt CC diagnose

hTERT2

promotor blev methyleret i 60,0% af prøverne. I tilfælde af

hTERT

højere genekspression opnås ved hypermethylering. I undersøgelsen af ​​Kumari

et al

. [25] behandling med 5-azacytidin og deraf følgende demethylering af

hTERT

promotor førte til reduktion af genekspression. Det var i modsætning til hvad der er blevet observeret for konventionelle tumorsuppressorgener. Den mulige forklaring på dette fænomen er, at methylering af

hTERT

initiativtagere er heterogen, og at kun methylerede alleler udtrykkes [12]. Ja, det blev observeret i studiet af Zinn

et al

. [26], hvor de fleste af cancercellelinjer havde

hTERT

promotor tæt methylerede, men CpG’er omkring transkriptionsstartstedet af et betydeligt antal af

hTERT

alleler var umethyleret. Afslutningsvis heri observeret hypometylering i normal cervix betyder lavere ekspression af

hTERT

genet og lavere telomeraseaktivitet. Dette kan forklare bedre prognose for patienter med CC, hvis tumor celler mangler

hTERT

promotor methylering [27]. Resultaterne promotor methylering af andre forfattere på CC prøver korrelerer godt med vores. Den methylering varierer over 65% for

hTERT

og

DAPK

initiativtagere [22], 41% til

DAPK

, og mindre for

CDH1

,

HIC

og

RARp

initiativtagere [21]. For et større antal initiativtagere,

hTERT

,

CDH1

,

DAPK

,

HIC1

RARp

methyleringen varierer selv mere, der spænder fra 0 til 100% [27-29].

Heri vi har identificeret fem methylering biomarkør kandidater,

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

, og

TWIST1

, hvis promotor methylering status adskiller CC fra normal og HSIL /CIN3 prøver (tabel 2). Progressionen fra HSIL /CIN1 til HSIL /CIN2 synes at være relateret til højere methylering af

RARβ2

TWIST1

promotor, selvom den statistiske signifikans er lavere for

RARβ2

( Fishers eksakte test p = 0.024696) end

TWIST1

(Fishers eksakte test p = 0,001030). Den sene fase af cervikale forandringer, CC synes at være præget af høj methylering af

hTERT1

,

hTERT2

, og

TWIST1

promotor, og i en lavere grad i

RARβ2

promotor. Vi grupperet også cervikale forstadielæsioner (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3) for at evaluere forskelle mellem normale, cervikale læsioner, og CC. I en sådan sammenligning

CCNA1

C13ORF18

initiativtagere afslørede at være statistisk signifikant hypermethyleret i cervikale precursor læsioner sammenlignet med normale cervices (Fishers eksakte test p = 0.023742 og 0.022603 henholdsvis). Derudover methylering af disse to potentielle biomarkører sammenlignet med normale cervices synes at være en tidlig begivenhed i cervikal cancerogenesis, med

C13ORF18

promotor er statistisk signifikant methyleret i LSIL /CIN1 og HSIL /CIN2 (Fishers eksakte test p = 0.036738 i begge tilfælde), mens

CCNA1

promotor bliver statistisk signifikant methylerede i HSIL /CIN3 (Fishers eksakte test p = 0,010994). Derfor er observeret statistisk signifikante methylering forskelle mellem normale cervices, læsioner og CC i fem genpromotorer:

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

og

TWIST

. Sammenfattende disse genpromotorer repræsenterer mulige gode methylering biomarkører for påvisning af cervikale forandringer og kunne være nyttig i klinisk praksis. Det lader til, at i cervikal cancerogenesis der en kaskade af DNA methylering. Primært nogle gen-promotorer er denatureret, såsom

C13ORF18

efterfulgt af

CCNA1

, og derefter andre, nemlig

hTERT1

,

hTERT2

TWIST1

(figur 1)

LSIL, lav kvalitet planocellulært intraepithelial læsion.; HSIL, high-grade planocellulært intraepithelial læsion; CIN, cervikal intraepithelial neoplasi; ↑, hypermethyleret; ↓, hypomethylated.

Andre forfattere bestemt nogle af de udvalgte gener som gode biomarkører, men mest som en enkelt biomarkør for at skelne en bestemt diagnose. For eksempel, Yang

et al

. [13] valgt

CCNA1

og

C13ORF18

som gode methylering biomarkører til at skelne prøver med CIN2 + diagnose fra normale prøver. Kitkumthorn

et al

. [18] valgte hypermethylering af

CCNA1

promotor som biomarkør for tidlig diagnose af invasiv CC, De Wilde

et al

. [12] valgte differentieret methylering af

hTERT

at diagnosticere CC, mens Eijsink

et al

. [14] identificeres

C13ORF18

og

TERT

sammen med

EPB41L3

JAM3

, som bedste methylering biomarkører for CC. Derfor, fra litteraturen er det vanskeligt at bestemme den bedste methylering biomarkører. I en genom-dækkende undersøgelse med Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip metode bekræftede vi det høje methylering niveau af

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

og

TWIST1

initiativtagere i CC i forhold til det normale væv. Men den ukontrollerede hierarkiske clustering ført til et andet sæt af gener som kandidat biomarkører,,

RGS7

,

LHX8

,

STGALNAC5

,

TBX20

,

KCNA3

, og

ZSCAN18

[30], som ikke blev vurderet heri. Desuden er det i samme undersøgelse [30], under anvendelse af de mRNA-ekspression datasæt for ekstern validering, demonstrerede vi en god sammenhæng mellem DNA-methylering data og genekspression array. Derfor kan vi konkludere, at methylering af DNA er en god forudsigelse af genekspression; dermed DNA methylering test er gode og tilstrækkelig valg til at forbedre diagnostik, iscenesættelse og prognosticering i klinisk undersøgelse på grund af omkostningerne og tid fordel i forhold genekspression analyse.

Vi undersøgte også methylering status CpG af HPV16 og HPV18 genomer i sammenhæng med cytologiske /histopatologisk diagnose og status methylering af cellulære gener. De mønstre for methylering af HPV16-genomet er blevet analyseret ved bisulfit sekventering for hver af 19 CpG sites på grund af afvigende litteraturdata. Som forventet mønstre for methylering af HPV16-genomet i 12 prøver med forskellige diagnoser, korrelerede med de for SiHa cellelinje (S1 tabel). De fleste methylerede CpG’er i HPV16 genom SiHa-celler blev påvist i L1 og promotorregionen, mens de fleste af ikke-methylerede CpG’er i 5’LCR region og enhancer (fig 2). Ofte begge kopier af HPV16, methyleret og umethyleret blev fundet i alt diagnose spænder fra normale cervix til livmoderhalskræft, hvor methylering profiler af CC prøver var meget lig en af ​​SiHa cellelinie. I næsten alle prøver med normal cytologi (N) methylering profil var anderledes end i SiHa celler og CC prøver. Alle tre grupper af prøver med livmoderhalskræft precursor ændringer (LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3) havde meget lignende HPV16 methylering profiler. Grund af ligheden af ​​methyleringsmønsteret, er alle tre cervikale precursor ændringer vist sammen på fig 3B. Desuden er alle CpG lokaliteter, der var methylerede og ikke-methylerede i den samme prøve præsenteres som methyleret (figur 3). Vores resultater understøtter resultaterne af Kalantari

et al

. [31], at HPV-genomet er normalt hypermethyleret og behøver kun en kopi at være transkriptionelt aktiv. Hertil kommer, som præsenteres heri, for en god methylering biomarkør er det vigtigere at præcist at bestemme den procentdel af specifikke CpG steder inden HPV16 genom end den samlede methylering i forskellige sample grupper methylering. Heri, observerede vi, at den cervikale præcancer læsion gruppe havde den laveste samlede methylering sats (33%), mens prøver med normal cytologi og CC havde 53% samlet methylering sats, begge. Disse resultater er delvist uenige med konklusionerne fra andre forfattere, der hævder, at methylering af HPV16 er den laveste i normale og den højeste i CC prøver [17,32,33]. I denne undersøgelse fra puljen af ​​19 undersøgte bindingssteder for CpG for HPV16-genomet, to synes at være den mest betydningsfulde, CpG 7455 (5’LCR) og CpG 7694 (enhancer), hvori den fuldstændige mangel på methylering blev fundet i carcinoma prøver og SiHa cellelinje, mens de var stærkt methyleret (100% af normale cervix og 83% af prækursor læsioner i CpG 7455) og moderat methyleret (75% af normale cervix og 33% af prækursor læsioner i CpG 7694) i andre prøvegrupperne. Desuden blev CpG’er i positionerne 7434 og 7461 methyleret i 50% af prøverne med normal cytologi men der observeredes ingen methylering i forstadielæsioner, CC eller SiHa cellelinie. I modsætning hertil blev CpG 31 methyleret kun CC prøver (50%) og SiHa cellelinie. CpG’er i positionerne 37 og 52 blev methyleret i 75% prøver med normal cytologi og 100% af prækursor læsioner, CC og SiHa cellelinje. CpG 58 blev methyleret i 50% prøver med normal cytologi og 100% af prækursor læsioner og CC, samt i SiHa cellelinie. Den methylering blev ikke observeret i CpG’er ved positionerne 7535 og 7862 i hverken en af ​​de prøver eller SiHa cellelinje. I modsætning hertil blev CpG 7682 methyleret i alle undersøgte prøver, precursor cervikale læsioner, CC og SiHa cellelinie (fig 2 og 3). Forskellige methylering frekvenser inden HPV 16 genom på samme CpG websteder fra vores resultater og forskellige konklusioner er blevet rapporteret af Kalantari

et al

. [34]. Imidlertid blev lignende resultater på CpG methylering profiler i CC prøver til vores identificeret i studiet af Bhattacharjee og Sengupta [35]. Således er den fuldstændige mangel eller lav CpG-methylering i 5’LCR og enhancer, snarere end i promotorregion er afgørende for HPV-aktivitet og følgelig immortalisering af værtsceller

N, normal cytologi.; I, LSIL /CIN1 diagnose; II, LSIL /CIN2 diagnose; III, HSIL /CIN3 diagnose; CC, livmoderhalskræft; SiHa, livmoderhalskræft cellelinie; M, methyleret; U, ikke-methyleret; M + U, methylerede og umethylerede med overvejende methylerede DNA; U + M, methylerede og umethylerede med overvejende umethyleret DNA

Normale cervices (N = 40).; cervikale forstadielæsioner, LSIL /CIN1, HSIL /CIN2 og HSIL /CIN3 (N = 121); halscarci- prøver (N = 10). CpG websteder, der var methyleret og umethyleret i den samme prøve præsenteres heri som methyleret.

Undersøgelse HPV18 L1-gen methylering på 22 prøver (S1 tabel) ved MSP metoden vi observeret, at det hænger sammen med cytologiske /histopatologisk diagnose, og kan bedre forudsige sygdomsprognose. Især er de fleste af de analyserede prøver og HeLa-cellelinje indeholdt både methylerede og ikke-methylerede former af HPV18 L1-genet (tabel 3). Faktum er, at L1-genet forbliver intakt i cervikale læsioner og cancer prøver, selv når HPV-genomet integrerer ind i en værtscelle [36]. Methylering af HPV 18 L1-genet i cervikal precursor læsioner og CC prøver var i overensstemmelse med den diagnose og methylering profil HeLa-cellelinje. Især vores prøver, der kun indeholder methyleret form af HPV18 L1-genet havde bedre prognose;

jeg

.

e

. i disse prøver cellulære gener blev methyleret ved en lavere grad og hovedsagelig dem, der ikke er blevet statistisk bevist som potentielle biomarkører. Turan

et al

. [37,38] også fundet begge kopier af HPV18 i HeLa-cellelinie, med overskud af methyleret form mens hypermethylering af HPV18 L1 i alle carcinomer og manglende methylering i de fleste asymptomatiske udstrygninger og lav kvalitet læsioner. Desuden Badal

et al

. [39] har erklæret, at HPV18 genom hypermethylering i HeLa celle linje og CC prøver viser, at HPV faktisk er målrettet efter cellulært DNA methylering maskiner, der kan påvirke sent og tidlig gentranskription.

Fremtidige undersøgelser bør validere brug af methyleret HR-HPV som en prædiktiv og /eller diagnostisk biomarkør for risikoen for livmoderhalskræft blandt HPV-positive kvinder [32,40,41]. Især MSP primere for HPV16-genomet, der omfatter CpG’er 7455 og 7694 bør udformes for at undgå dyre og tidskrævende bisulfit sekventering og som sådan, forenkle kliniske anvendelser. Vores overvejelser om HPV genom methylering test sammen med det cellulære test gen methylering som triage af kvinder med høj risiko for at udvikle livmoderhalskræft blev også allerede diskuteret [10,27,42], men spørgsmålet er, hvilke HPV-typer, som HPV genom regioner og som cellulære gener til analyse. Vi mener, at de resultater, der præsenteres i denne undersøgelse, underforståede efter bekræftelse på et større antal prøver, kunne løse disse bekymringer. Derfor vil vi foreslå, at alle HR-HPV-positive kvinder blive testet for methylering af

CCNA1

,

C13ORF18

,

hTERT1

,

hTERT2

og

TWIST1

initiativtagere samt mindst HPV16 CpG 7455 og 7694 steder og HPV 18 L1-gen methylering. Testresultaterne skal være korreleret, og i tilfælde af øget methylering af kandidat biomarkør gener og ændrede methylering profil HPV16 og 18 genom kvinder bør forvaltes og efterfølgende overvåges mere grundigt (figur 1). Desuden er baseret på faktiske viden om cellulært og viral DNA-methylering den mulige brug af demethylering narkotika [27,43], såsom DNA methyltransferaser hæmmere kunne betragtes som lægemidler, men bør anvendes med stor forsigtighed.

Materiale og metoder

Study gruppe

undersøgelsen inkluderede 173 cervikale prøver af kvinder med normal cytologi, forstadier til kræft (skællede celle intraepitel læsioner, lav kvalitet, LSIL og high-grade, HSIL),

jeg

.

e

. cervikal intraepitelialneoplasi (CIN) grad 1 til 3, der er klassificeret i henhold til “Zagreb 2002”, der er i tråd med “NCI Bethesda System 2001” [24], og histopatologisk bekræftede CC [44]. Fra puljen af ​​prøver indsamlet for regelmæssige diagnostik ved Rudjer Boskovic Institute, Zagreb, 40 prøver med normal cytologi, 40 med LSIL /CIN1, 40 med HSIL /CIN2 og 42 prøver med HSIL /CIN3 diagnose blev taget tilfældigt for methylering analyser. Desuden blev 11 CC (8 pladecellekræft og 3 adenocarcinom) prøver taget med cytobrush lige før kirurgiske procedurer.

Etik Statement

Verbal patient /deltager samtykke blev opnået for hver cervikale prøve der blev opsamlet både HPV diagnostiske og forskningsmæssige formål. Skriftlig patient /deltager samtykke var ikke nødvendigt, fordi samtlige hals- prøve ledsages af laboratorietjeneste anmodningsformularer, som skal underskrives og godkendes af praktiserende læge, der er ansvarlig for den verbale patient /deltager samtykke (indspillet af klinikeren på laboratoriet serviceanmodning former). Således er det kun prøver fra patienter /deltagere, der verbalt aftalte blev inkluderet i denne undersøgelse. De relevante patientdata (alder, cytologisk diagnose, HPV detektions- og maskinskrivning resultat), og det ekstraherede DNA blev yderligere kodet og behandlet anonymt i laboratoriet. Undersøgelsen blev opnået inden forskningsprojektet “Aberrant DNA methylering i HPV forbundet læsioner” (Grant 098-0982464-2510 støttet af det kroatiske Ministeriet for Videnskab, uddannelse og sport), som blev godkendt, samt proceduren for prøvetagning af Ethical bestyrelse Rudjer Boskovic Institute, og den etiske bestyrelse Sisters of Mercy Hospital og Klinisk Hospital center Zagreb, der er i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen (DOH /Oct2008).

DNA forberedelse

DNA fra cervikale prøver blev isoleret på BioRobot EZ1 (Qiagen, USA) ifølge producentens anvisninger. Efter DNA ekstraktion blev det oprensede DNA opløst i 50-100 pi tri-destillat sterilt vand og opbevaret ved -20 ° C indtil yderligere analyse. Hver DNA blev analyseret spektrofotometrisk og visuelt på 1% agarosegelelektroforese, og visualiseres ved UV-bestråling på Alliance 4,7 (UVItec Cambridge, UK) [45].

HPV detektering og genotype

Detection og genotypebestemmelse af HPV’er er tidligere beskrevet af Milutin-Gasperov

et al

. [46] Kort fortalt tre sæt konsensus primere (PGMY09 /PGMY11, L1C1 /L1C2-1 /L1C2-2 og GP5 + /GP6 +) blev anvendt for HPV afsløring og typespecifikke primere til HPV-genotypebestemmelse af typer 6/11, 16 blev 18, 31, 33, 45, 52 og 58. PCR-produkter analyseres ved elektroforese på 2% agarosegeler farvet med ethidiumbromid.

Cellelinjer

Isolerede DNA fra HPV 16 positive CC celle linjer, CaSki (ATTC CRL-1550) og SiHa (ATCC HTB-35), og HPV18 positiv, HeLa (ATCC CCL-2), blev anvendt som positive kontroller for afvigende methylering profiler af cellulære gener og respektive HPV-genomer. CaSki celler indeholder et integreret HPV16-genom (ca. 600 kopier per celle) samt sekvenser relateret til HPV18. SiHa celler indeholder en integreret HPV 16 genom (1 til 2 kopier per celle), mens HeLa celler indeholder HPV18 sekvenser.

Bisulfite DNA konvertering

DNA af cervikale prøver blev modificeret med natriumbisulfit hjælp EpiTect Bisulfite (Qiagen, USA) og derefter oprenset ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt er alle umethylerede cytosiner konverteret til uracil ved bisulfitbehandling, mens methylerede cytosiner forbliver uændrede.

Host celle genpromotorer ‘methylering beslutsomhed

De methylering profiler af

CCNA1

( kromosom 13: 36.432.177-3.643.232),

CDH1

(kromosom 16: 68.737.114-6.873.722),

C13ORF18

(kromosom 13: 46.387.345-4.638.746),

DAPK1

(kromosom 9 : 87497883-87497981),

HIC1

kromosom 7: 19.117.831-19.118.031,

RARβ2 Hotel (kromosom 3: 25.428.191-2.542.842),

hTERT1

(kromosom 5: 1.295.019 til 1.295.259 ),

hTERT2

(kromosom 5: 1.294.824 til 1.295.014) og

TWIST1

(kromosom 7: 19117831-19118031) genpromotorer blev identificeret. status genpromotor methylering blev opnået ved methylering Specifik polymerasekædereaktion (MSP) med primere specifikke for methylerede former for genpromotorer. Den samme fremgangsmåde blev anvendt til påvisning af ikke-methylerede former af de samme genpromotorer bortset fra

C13ORF18

promotor. Den positivitet af prøver med methylerede former for genpromotorer tjente som den interne kontrol, da cervikale udstrygninger indeholder blandinger af celler med forskellige methylering status vært genpromotorer [17]. Den MSP-metoden og betingelser for de udvalgte gener allerede beskrevet af Yang

et al

. [13,47], Feng

et al

. [23], Kitkumthorn

et al

. [18], og Dessain

et al

. [19], men betingelserne blev ændret i de fleste tilfælde heri. Kort beskrevet blev 5 min denaturering ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 sek, annealing ved 56-61 ° C i 30 sek, forlængelse ved 72 ° C i 50’erne, og den endelige 7 min forlængelse ved 72 ° C. Annealingstemperaturen varieret med forskellige primere: 56 ° C i

hTERT1

(U, umethylerede primere) og

TWIST1

(M, denatureret primere), 58 ° C i

CCNA1

(M) og

CCNA1 Hotel (U), 59 ° C i

CDH1 Hotel (U),

C13ORF18 Hotel (M),

DAPK1

(