PLoS ONE: østrogenafhængig Dynamisk Profil Enos-DNA Foreninger i prostatakræft

Abstrakt

I tidligere arbejde har vi dokumenteret den nukleare translokation af endotel NOS (eNOS) og dens deltagelse i kombinatoriske komplekser med østrogen-receptor Beta (ERP) og Hypoxi Inducerbare Faktorer (HIFs), der bestemmer lokaliseret kromatin remodellering som respons på estrogen (E2) og hypoxi stimuli, hvilket resulterer i transkriptionel regulering af gener associeret med negative prognose i prostatacancer (PSA). At udforske rollen af ​​nukleare eNOS i købet af aggressive fænotype i PCa, vi udførte chip-sekventering på kromatin-associerede eNOS fra celler fra en primær tumor med dårligt resultat og fra metastatiske LNCaP celler. Vi fandt, at: 1. eNOS-bundne regioner (toppe) er vidt udbredt i hele genomet omfatter flere transkriptionsfaktorer bindingssteder, herunder Østrogen Reaktion Elements. 2. E2 øget antallet af toppe, hvilket indikerer hormonafhængig eNOS re-lokalisering. 3. Peak fordeling var ens med /uden E2 med ≈ 55% af dem i extragenic DNA-regioner og en spændende involvering af 5’domæne af flere Mirs liberaliseret i PSA. Talrige potentielt nye eNOS målrettede gener er blevet identificeret tyder på, at eNOS deltager i reguleringen af ​​store gen-sæt. Den parallelle fund af nedregulering af en klynge af Mirs, herunder miR-34a, i PCA celler i forbindelse med dårligt resultat førte os til at afsløre en molekylær forbindelse mellem eNOS og SIRT1, en epigenetisk regulator af aldring og tumorgenicitet, negativt reguleret af miR-34a og til gengæld aktiverer eNOS. E2 forstærker miR-34a nedregulering dermed forbedre SIRT1 udtryk, der forestiller en roman eNOS /SIRT1 samspil finjusteres ved E2-aktiveret ER signalering, og tyder på, at eNOS kan spille en vigtig rolle i aggressiv PCa

Henvisning:. Nanni S, Aiello A, Re A, Guffanti A, Benvenuti V, Colussi C, et al. (2013) østrogenafhængig Dynamisk Profil Enos-DNA Foreninger i prostatakræft. PLoS ONE 8 (5): e62522. doi: 10,1371 /journal.pone.0062522

Redaktør: Costanza Emanueli, University of Bristol, England

Modtaget: December 20, 2012; Accepteret: 22 marts 2013; Udgivet: 3 maj 2013

Copyright: © 2013 Nanni et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana Ricerca sul Cancro til afa; Italienske undervisningsministerium, Universitet og Forsknings- Tilskud: PRIN 2008NY72SJ og FIRB RBFR087JMZ til AFA og FIRB RBFR10URHP at S.N. V.B. er modtager af en FIRC (Federazione Italiana Ricerca sul Cancro) Fellowship. A.A. er støttet af midler fra Susan G. Komen for Cure Foundation. C.G. forskning er støttet af LOEWE Center for Cell og Gene Therapy, Goethe-universitetet, Frankfurt (DE). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: medforfatter AG er Genomnia srl ​​medarbejder og en Fe er en konsulent for Genomnia srl. Medforfattere CG annonce MCC er PLoS ONE redaktionelle bestyrelsesmedlemmer. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Nitrogenoxid (NO) og dets syntaser opnåede berømthed blandt onkologer på grund af beviser for hyppig deregulering af NO produktionen i flere tumorer, herunder prostatakræft (PCA, [1], [2], [3], og opdagelsen af ​​en central rolle, som endotel NOS (eNOS spillet) i tumor vedligeholdelse og progression [1 ], [3], [4] Vore tidligere eksperimentelle resultater har givet demonstration af fysiopatologisk rolle eNOS i tre cellulære sammenhænge:. normale humane endotelceller (HUVEC) før og efter behandling med 17β-estradiol (E2); epitel cellekulturer . fra PCA eksplantaterne dyrket i basal tilstand eller med E2, og prostata vævsprøver fra PCA patienter Konfokal mikroskopi og immunhistokemi har dokumenteret, især eNOS nukleare translokation i alle tre eksperimentelle modeller [1], [5] og givet følgende beviser: (i) eNOS-NO ‘nukleare’ signalering er en central vej i endotelceller respons på angiogene stimuli og i købet af en mere aggressiv fænotype i PCa; og (ii) eksistensen og funktionelle rolle af afgørende kombinatoriske komplekser på kromatin, eNOS /ERa specifikt involveret i opretholdelsen af ​​vaskulær homeostase [6], [7] og eNOS /ERp, eNOS /HIF-1α eller eNOS /HIF-2α specifikt forbundet til negativ kliniske resultat af PCa [1]. I tumormodel, disse komplekser bestemme lokaliseret ombygning af kromatin i afhængighed østrogen og hypoxi stimuli, hvilket resulterer i transkriptionel regulering af prognosticering målgener [1]. Hvorvidt eNOS og dets partnere er til stede som en konstellation af koordinere komplekser eller i form af en makro-multifaktoriel kompleks mangler at blive evalueret.

I de seneste år, en relevant rolle i human cancer initiering, progression og metastase har også blevet tildelt dysregulering af microRNA (Mirs) [8], [9]. Hvordan udtryk for prognostiske målgener reguleres i forbindelse med PCa er i øjeblikket under efterforskning, selv om flere rapporter [10], [11], [12], [13], [14] har identificeret klynger yderst relevante for prostatakræft. Her har vi udvidet på dette aspekt ved at dokumentere en væsentlig nedregulering af en klynge af Mirs, udelukkende i PCA celler i forbindelse med negativ klinisk resultat (G1 celler). Denne klynge omfatter miR-34a, den første miR identificeret som en regulator af SIRT1 deacetylase [15] en kritisk epigenetisk controller af aldring og tumorgenicitet [16].

Af note eNOS og NO har også været involveret i modningen, er en relevant observation siden aldring betragtes som en selvstændig risikofaktor i flere patologiske tilstande. Under ældning, er eNOS ofte dereguleret og de sædvanlige NO biosyntesen transformeret til produktion af frie radikaler. Denne effekt bidrager til DNA-skader og genomisk ustabilitet giver en gunstig jord til udvikling af kræft. Faktisk eNOS er for nylig blevet associeret med vedligeholdelse af pancreascancer [4] og til progression af PCa [1], en af ​​de mest almindelige cancer hos ældre. Interessant, er den rolle, eNOS under modningen strengt knyttet til funktionen af ​​SIRT1. I fysiologiske betingelser, SIRT1 aktiverer eNOS ved deacetylering. Aldring, ved at ændre SIRT1 funktion bestemmer en reduceret glukose metaboliske effektivitet samt en nedsat produktion af passende NO niveauer, hvilket forværrede det intracellulære miljø.

Disse lokaler sammen med vores oprindelige konstatering af, at NO sti repræsenterer et “

primum movens

“af et transkriptionel program fremme tilegnelsen af ​​en aggressiv fænotype i PCA celler, og at den nukleare translokation af eNOS væsentlig grad påvirker kromatin remodellering af en specifik delmængde af PCA prognostiske gener [17], har fået os til at undersøge det fulde potentiale af denne nøgle signalmolekyle som master-genet i progressionen af ​​prostatacancer. Vores mål og udfordring var at afsløre funktionen af ​​eNOS på genom-plan med en chip-sekventering tilgang, med håb om at afsløre en generel mekanisme forbundet med tilstedeværelsen af ​​nukleare eNOS i prostata tumorer. Her præsenterer vi eksperimentelle beviser, der definerer en molekylær kredsløb, der bidrager til aggressiv og metastatisk PCa og kan moduleres af eNOS eller SIRT1 hæmmere med potentiel indvirkning på nuværende behandlinger for PSA.

Metoder

Hormoner og hæmmere

17β-estradiol (E2 Sigma), NG-nitro-L-arginin-methylester (L-NAME, Alexis), TSA (Sigma-Aldrich), MS275, MC1568, sirtinol, resveratrol var en venlig gave af Antonello Mai (Rom, Italien)

Antistoffer

anti-ERa (HC-20 [Santa Cruz Biotechnology]. anti-ERp (L-20 [Santa Cruz Biotechnology], anti- eNOS (eNOS /NOS Type III [BD Biosciences] Abcam, Cambridge, UK og cellesignalering, MA, USA), anti-HDAC1 (Abcam, Cambridge, UK og Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-HDAC3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-HDAC4 (Abcam, Cambridge, UK og Santa Cruz, CA, USA), anti-HDAC5 (Abcam, Cambridge, UK) anti -SIRT1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-5-methylcytidin (Eurogentec, Seraing, Belgien), anti-α-actin (Sigma-Aldrich), og anti HSP70 (StressGen Biotechnologies, San Diego, CA).

Cellekultur

HUVEC og LNCaP-celler blev dyrket som beskrevet [1], [5]. Primær prostatakræft kulturer blev opnået fra frisk eksplanterede prostatakræft prøver efter godkendelse af den institutionelle Etisk Udvalg som beskrevet [17]. Udødeliggjorte PCA-celler blev opnået ved transduktion af hTERT og SV40 stort T-antigen som beskrevet [1]. Kliniske data for patienter, der indgår i denne undersøgelse er allerede blevet rapporteret andetsteds [17]. Resultatet af patienter (overlevelse, metastaser, lokale og /eller biokemisk tilbagefald) blev fulgt op til december 2012 (observationsperiode juli 2002 til december 2012). Dårlig prognose gruppe (G1) af patienterne med PCa blev defineret ved tilstedeværelsen af ​​biokemiske /lokalt recidiv, metastaser eller sygdomsspecifikke dødelighed, og god prognose gruppe (G2) blev defineret ved fuldstændig remission med kirurgi alene. Cellelinjer afledt fra patienter er blevet tildelt tilsvarende til G1 (C1IM, C11IM, C13IM, C19IM, C27IM, C43IM, C45IM) eller G2 (C14IM, C24IM, C25IM, C35IM, C38IM, C39IM, C40IM, C41IM) fænotyper.

transfektionerne celleekstrakter og Western Blot

Transiente transfektioner blev udført af Jet Pei ™ teknik (Poly Plus Transfektion). eNOS vektor kodning S1177A var en gave fra C.M. Counter (Duke University Medical Center, Durham, USA) [4]. Totale ekstrakter for Co-IP immunfældning blev opnået med USA (Tris-HCI 50 mM pH = 7,5; EDTA 5 mM; NaCl 250 mM; Triton 0,1%; NaF 50 mM), blev nukleare og cytoplasmiske fraktioner opnået som tidligere beskrevet [18 ].

Behandlinger

Cellerne blev behandlet med 10

-7 M E2, 5 mM L-NAME, 500 nM TSA, 500 nM MS275, 10 uM MC1568, 10 uM sirtinol, 25 uM resveratrol, alene eller i kombination til de angivne tider i figurteksterne. Mindst 72 timer før eksperimentel anvendelse blev cellerne skiftet til medium suppleret med hormon-berøvet serum [19].

chips og Re-chips

chip og re-chip assays fra dyrkede celler blev udført som beskrevet [1] anvendelse af specifikke antistoffer til ERp, eNOS, SIRT1, HDAC1, HDAC 3, HDAC 4. Negative kontroller var fravær af antistof (NoAb) eller normal IgG. Analyse af methylering under anvendelse af antistof-anti-5-methylcytidin blev udført som beskrevet i [5]. DNA-fragmenter blev udvundet og analyseret ved kvantitativ realtids-PCR som beskrevet [1]. Primere er præsenteret i den supplerende afsnit.

For chip-sekventering blev chips udført som beskrevet [1], [6] med modifikationer. Kort fortalt blev kromatin opløsninger fremstillet ved sonikering under anvendelse Bioruptor UCD-200 (Diagenode) for at opnå DNA-fragmenter mellem 150-500 bps i længden. Pre-clearing af kromatin opløsning blev udført med protein G-agarose (Pierce) og genvinding af immune komplekser med protein G mættet med BSA ved en slutkoncentration på 1 pg /pl. Immunpræcipiteret og input DNA-prøver blev opløst i dobbelt destilleret H

2O. Validering af DNA forud for sekventering blev udført ved qPCR ved anvendelse af primere specifikke for hTERT og PS2 initiativtagere (se Supplemental afsnit).

Bibliotek Forberedelse, chip-sekventering og Bioinformatik Analyse

NGS bibliotek forberedelse og solid sekventering blev udført ved Genomnia. DNA-prøver i 50 pi Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8 blev klippet ved anvendelse af Covaris ™ S2 System, med følgende indstillinger: duty cycle 10%, intensitet 5%, cykler /burst 200, cyklustid 60 s , antal cyklusser 3. DNA størrelse efter klipning, kontrolleres på Bioanalyzer, var 25-400 nt med en top omkring 140 nt. Klippet DNA (50 ng) var ultimo repareret og ligeret hjælp Quick ligation kit (New England Biolabs) til 27 pmol af multiplex P1 adapter og 27 pmol af en (forskellig for hver ligation) af bar-kodet multiplex P2 dobbelt-strenget adaptere (fast ™ Fragment Library Oligos Kit, Applied Biosystems PN 4.401.151). Prøver blev inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter, oprenset under anvendelse af Agencourt® AMPure® Kit, og nick-translation blev udført på ikke-ligeret 3′-ender. Endelig bibliotek molekyler blev amplificeret ved PCR for 15-17 cykler og oprenset ved anvendelse af Agencourt® AMPure® Kit, som beskrevet før. Prøverne blev kvantificeret ved hjælp qubit dsDNA HS eller BR kits og kontrolleres på Bioanalyzer (Agilent Technology) ved hjælp af en DNA 1000 chip. For at opnå den binding og den klonale amplifikation af bibliotekets fragmenter på overfladen af ​​sekventering perler blev de 8 poolede DNA-biblioteker tilsat til emulsionen PCR-reaktionen udført i overensstemmelse med producentens instruktioner (Applied Biosystems). Efter amplifikation blev emulsionen brudt med butanol, blev perler beriget med skabelon positive perler, 3′-enden forlænges og kovalent bundet på én sekventering objektglas, og sekventeret med standardindstillinger på det faste system, version 3.5 til at producere 50 nukleotider lang læser.

Kortlægning af Sequencing data

Kortlægning af Color Space sekventering læser til referencen genom (UCSC Homo sapiens hg19 fra UCSC) blev udført med Lifetech Lifescope 2.5.1 bioinformatik softwarepakke, efter “en priori “fejlkorrektion med SAET proceduren. De resulterende alignment filer (parvis Input og eksperiment) i standard.bam format blev analyseret for peak ringer direkte med MACS softwareversion 1.4.1 [20]. Desuden blev the.bam alignments konverteret til the.bed format med bamToBed bedtools nytte og anvendes for peak ringer med SICER analyse software [21], for at tage hensyn til den heterogene karakter af disse DNA – protein interaktioner, der kan omfatte ret lange områder for interaktion. Alle kryds mellem MACS og SICER seng filer og genom-dækkende funktioner blev udført med bedTools v2.17.0 softwarepakke (https://code.google.com/p/bedtools/).

Peak Identifikation

Eksplorativ dataanalyse af sekventering og kortlægning resultater af MACS peak kvalitet, af den relative annotation og yderligere peak kald blev udført med den kommercielle Integromics SeqSolve bioinformatik software suite. Korrelation af MACS og SICER toppe (Eksperiment

versus

Input) med kendt NCBI RefSeq gen struktur og anmærkning blev udført med in-house Genomnia perl scripts eller med ChIPpeakAnno BioConductor bibliotek, udgave 2.10 [22]. Differential peak analyse blev udført med den SICER-df.sh rutine i SICER software eller med BioConductor DiffBind biblioteket [23], suppleret med in-house Genomnia perl scripts. Fjernelse af åbne kromatin (falske positiver) regioner blev udført ved hjælp af “En omfattende samling af signal artefakt blackliste regioner i det humane genom”, Anshul Kundaje, ftp://encodeftp.cse.ucsc.edu/users/akundaje/rawdata/blacklists/hg19 /). Statistisk test i forbindelse med sekvens funktioner (evaluering af TSS og peak længde gennemsnitlige forskelle) blev evalueret med Welch Two Sample t-test i R-version 2.15.1 statistiske sprog. Sequence-linked statistiske analyser, herunder beregninger kernel tag tæthed, blev udført med de relevante statistiske rutiner og biblioteker af R-version 2.15.1 statistisk sprog (https://www.r-project.org/). Short-læse sekventering data og den tilhørende eksperiment information er blevet deponeret på EBI ArrayExpress database (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) med tiltrædelse Number E-mtab-1204.

SIRT aktivitet

Enzymatisk aktivitet blev vurderet med HDAC-assay kit (Upstate) ifølge producentens instruktioner under anvendelse 40micrograms af totale ekstrakter.

konfokal mikroskopi

Konfokal analyse blev udført som tidligere beskrevet [1]. Prøve blev analyseret med en Zeiss LSM510 Meta Konfokal mikroskop med 63x forstørrelse. For hver prøver 10 uafhængige felter blev analyseret og repræsentative billeder vises. Colokalisering maske blev opnået ved LSM510 software til at producere billeder, der indeholder udelukkende colocalized regioner.

Exiqon Microarrays og Data Analysis

Total RNA oprensning, herunder miRNA, blev udført ved hjælp af miRNeasy kit (QIAGEN) og prøver blev opbevaret straks ved -80 ° C. RNA kvantificering og integritet blev vurderet ved hjælp NanoDrop og Agilent 2100 Bioanalyzer. Kun prøver med et RNA-integritet nummer (RIN) 8,0 blev taget til analyse. I alt 500 ng RNA fra prøven og reference blev mærket med Hy3 ™ og hY5 ™ fluorescerende mærke henholdsvis ved hjælp af miRCURY ™ LNA Array power mærkningskittet (Exiqon, Danmark) ved at følge fremgangsmåden beskrevet af producenten procedure. Den Hy3 ™ -mærket prøver og en hY5 ™ -mærket henvisning RNA prøve blev blandet parvis og hybridiseret til miRCURY ™ LNA Array-version 5

th Generation (Exiqon, Danmark), der indeholder capture prober rettet mod alle miRNA til human , mus eller rotte registreret i miRBase udgave 16,0 ved Sanger Institute. Hybridiseringen blev udført i overensstemmelse med miRCURY ™ LNA-array manual under anvendelse af en Tecan HS4800 hybridisering station (Tecan, Østrig). Efter hybridisering mikroarrayet objektglas blev scannet og lagret i en ozon frit miljø (ozon niveau under 2,0 ppb) for at forhindre potentiel blegning af fluorescerende farvestoffer. De miRCURY ™ LNA-array microarray objektglas blev scannet under anvendelse af Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) og billedet analyse blev udført under anvendelse af Imagene 9.0 software (BioDiscovery, Inc., USA). De kvantificerede signaler blev korrigeret for baggrund (Normexp med offset værdi 10 [24] og normaliseret ved hjælp af den globale Lowess (lokalt vægtet Scatterplot Smoothing) regression algoritme. Differentiel ekspression af miRNA mellem grupper blev udført ved anvendelse af en t-test one-hale hvorefter en

s

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant alt 52 Mirs blev brugt til at generere en heatmap hvor røde og grønne farver indikerer høj og lav udtryk henholdsvis en to-vejs overvåget clustering analyse blev udført ved hjælp af Pearsons korrelationer.. og Ward kriterier som sammenkædning regel. C27IM cellelinje blev hybridiseret to gange med korrelation = 0,92. Microarrays data er blevet deponeret i Curie database på https://microarrays.curie.fr/, login brugernavn og password er tilgængelige efter anmodning .

Modne miRNA og PRI-miR Detection

Revers transkription blev udført ifølge producentens protokol under anvendelse af TaqMan-fremgangsmåden (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Real-time PCR blev udført tre gange i to eksemplarer på en ABI Prism 7500 eller 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Relativ mængde af hver modne miR eller pri-miR blev målt som fold ændring ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode (RNU6B eller RNU19 og β-actin eller GAPDH tjente som endogen kontrol, henholdsvis).

Statistik

statistisk analyse blev udført under anvendelse af Prism 2.01 statistisk software (GraphPad). Forskelle blandt emnegrupper blev vurderet ved 2-halet Mann-Whitney U-test og 1-tailed t-test. En 95% konfidensinterval (P 0,05) blev betragtet som signifikant. Data er repræsenteret som kassediagrammer diagrammer (bokse viser medianer og øvre og nedre kvartiler af dataene og whiskers indikerer minimums- og maksimumsværdier), som middelværdi ± SEM eller som fold induktion (+/- behandling), som angivet i figurteksterne.

Resultater

genom-bred profil af eNOS-bindende Begivenheder i prostata cancer Cells

Vi har tidligere dokumenteret, at eNOS i prostata kræftceller translokerer til kernen i respons på østrogen, en proces inhiberet af anti-østrogener [5]. Her viser vi ved konfokal mikroskopi, at denne østrogenafhængig re-lokalisering er også effektivt forhindret af L-NAME, en inhibitor af eNOS (Fig S1). Dette fund støtter kraftigt en årsagssammenhæng mellem eNOS aktivitet, NO produktion og østrogen signalering.

Vores åbne spørgsmål blev

i.

Hvordan eNOS spille en rolle i prostatakræft under basale betingelser eller som reaktion til østrogener og i forlængelse, i østrogen-afhængige transkriptionelle program i forbindelse med prostatakræft aggressiv fænotype ?, og

ii.

Er nukleare funktion eNOS inddrage molekylære interaktioner med proteiner i stand til at ændre kromatin struktur og ændre transkriptom i østrogen-responsive prostata kræftceller? For at løse disse spørgsmål kromatin immunoudfældninger koblet til massiv parallel sekventering (chip-seq) blev udført før og efter behandling med 17β-østradiol (E2, 10

-7) i to cellelinjer:

jeg

. C27IM celler afledt fra en primær prostatacancer med en aggressiv fænotype og godt karakteriseret ved immunofænotype cytogenetiske markører, vækst og kolonidannelse, genamplifikation, mRNA-genet og miR profil [1], [17] og

ii

. i LNCaP-celler, en human prostata cellelinie afledt fra en lymfeknude-metastase [25], således repræsentativ for den “metastatiske” fænotype. Den beholdt lydhørhed af disse celler til sex steroid hormoner, både androgener og østrogener [19], [26], gør dem en optimal kontrol for et hormon-responsive primær tumor aggressiv, men endnu ikke metastatisk.

Målet med vores undersøgelse var at identificere, i prostata mikromiljø, signalering de primære transkriptionelle mål for E2 forbundet med eNOS. Vi fokuserede på en kort hormonbehandling (45 min) på grundlag af tidligere studier af os og andre, der klart angivet dette interval som optimal til at følge de primære og umiddelbare virkninger af E2-afhængig transskription, før aktiveringen af ​​sekundære mål [1 ], [6], [19], [27], [28].

eNOS chip-seq blev gennemført, og eNOS-associerede DNA regioner (toppe) blev identificeret ved hjælp af to algoritmer, MACS 1.4.1 ( Linux version eller som indgår i den kommercielle software SeqSolve ™ fra Integromics) og SICER v1.1, for at minimere peak opkalds bias og at overveje ‘udvidet’ karakter af interaktionen af ​​eNOS /ER-komplekser med kromatin [20], [21] . Differentiel analyse af udtrukne toppe eller udvidede områder (øer) blev også udført med to metoder, sammenligne og skærer resultaterne, af de samme grunde (se Metoder og [22], [23], [29], [30]).

antallet af sekventering læser og eNOS-bindende begivenheder for hver cellelinie, ubehandlet eller udsættes for E2

, er vist i tabel S1. Under begge betingelser blev de eNOS-holdige DNA toppe fundet udbredt i hele genomet med bevarede hyperdensity regioner, som vist oven på de menneskelige kromosom ideogrammer for begge cellelinier (Figur S2). Dette mønster, der minder om den genomiske fordeling af ERE sites beskrevet af Carroll

et al.

[31], understøtter vores tidligere fund af eksistensen af ​​eNOS /ER-komplekser [1], [5], [6] .

Vi identificeret af MACS peak opkald analyse i C27IM og LNCaP celler henholdsvis 12,034 og 2.344 eNOS-associerede toppe før E2 behandling og 57,802 og 34,560 derefter (tabel S2). Notatet fjernelse af åbne kromatin regioner er kendt for at generere falske positiver i chip-seq eksperimenter (de såkaldte “ultra-høj signal artefakt regioner”) efterladt væsentlige uændret resultaterne i form af peak nummer: 11,694 og 2333 i ubehandlet C27IM og LNCaP celler og 57.616 eller 34.451 i C27IM og LNCaP celler efter E2 behandling (tabel S2 og figur 1A) (se Metoder og [32].

A) Venn diagram over regioner viser eNOS-rekruttering i fravær ( NT) eller nærvær af estradiol (E2). Antal diskrete genomiske eNOS-rekruttering toppe identificeret ved chip-Seq i C27IM_NT og C27IM_E2 (til venstre), LNCaP_NT og LNCaP_E2 (til højre) ved hjælp af MACS-analyse (FDR 0,1 og P-værdi p 1e-5). Overlap mellem toppe i NT og E2condition blev bestemt ved hjælp af tærskelværdi på 1 nt. B) Længde fordeling Enos toppe i C27 IM_NT, C27 IM_ E2 (til venstre) og LNCaP NT, LNCaP E2 (til højre). Data er præsenteret som oven box plots af peak længder for E2 behandlet (sort) eller ubehandlet (grå). Sort linie er E2 toppe betyder længde, grå linje er den NT toppe betyder længde. p 2.2E-16 NT vs E2. C) Cirkeldiagram Enos-toppe distribution i intra /extragenic regioner (venstre) eller af afstand fra TSS (til højre). Tal i procent repræsenterer min-max værdier i hver kategori. D) Venn-diagram af MACS-toppe i C27IM_E2 og LNCaP_E2. Overlap mellem eNOS toppe blev bestemt ved hjælp af tærskelværdi på 1 nt. E) Validering ved kvantitativ PCR af chip-Seq Enos toppe. eNOS binding blev overvåget i 9 genomiske regioner, blev specificitet vurderet i en “tom” region (region uden eNOS toppe) af kromosom 5. Data repræsenterer middelværdien +/- SEM af 3 uafhængige forsøg. * P. 0,05 eNOS_E2 vs eNOS_NT

Klart ved østrogenbehandling antallet af toppe steg betydeligt (4.8- og 14-fold i C27IM og LNCaP-celler, henholdsvis), der angiver et specifikt hormon-afhængig eNOS re-lokalisering langs genomet. En kvantitativ sekvens sammenligning af eNOS-associerede toppe før og efter E2 behandling afsløret eksistensen af ​​overlappende toppe mellem de to betingelser, (6.805 almindelige toppe i C27IM og 1368 i LNCaP-celler (figur 1A). En tilsvarende overlapning 5.190 og 1.630 gener i C27IM og LNCaP celler henholdsvis blev også fundet for Enos toppe er forbundet med den nærmeste genet som kommenteret i NCBI RefSeq database indarbejdet i UCSC Genome Browser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) (data ikke vist). De overlappende toppe (og tilhørende gener) repræsenterer således en undergruppe Enos-bundne regioner, som ikke responderer på estradiol behandling, hvilket tyder på eNOS interaktioner med proteiner andre end eR.

On den anden ende, de fleste toppe er følsomme over for E2, hvilket resulterer i induktion af

de-novo

eNOS genomet binding (50,811 toppe i C27IM og 33.083 i LNCaP) eller løsrivelse (4.889 toppe i C27IM og 965 i LNCaP ). af interesse i begge tilfælde, flere eNOS MACS toppe induceret af estradiol eksisterer

pr

gen. I E2-behandlede celler fleste eNOS målgener var bundet en eller to gange, blev ca. 5% bundet 3 gange, og ca. 9% var bundet 4 eller flere gange (tabel S3). Desuden E2 stimulation ændret fordelingen af ​​eNOS som angivet med markant øget peak længde efter E2 behandling tyder en DNA-eNOS /ER-komplekset stabilisering efter hormonbehandling (tabel S2 og figur 1B).

Distribution Enos-toppe i forhold til den nærmeste TSS opnået ved hjælp Kernel tag tæthed analyse viste, at

i.

deres hyppighed er centreret på TSS og falder på begge sider med en klar asymmetri mod intrageniske områder (Figur S3A) og

ii

. E2 behandling udvides det globale område, som toppene i C27IM og, i mindre grad, i LNCaP-celler, som vist ved anvendelse af en 10.000 bp vindue, selvom toppene viste en signifikant berigelse omkring TSS følgende E2 stimulus (fig. S3B).

det er bemærkelsesværdigt, den globale peak distribution i kommenterede genomiske regioner var ens i begge eksperimentelle betingelser (+/- E2), med en lille udbredelse (53-58%) af toppe lokaliseret i extragenic regioner, og resten i intrageniske regioner, navnlig inden introner (figur 1C). Som vist i figur 1D, der var betydeligt overlap mellem toppe fremkaldt af E2 i C27IM og LNCaP celler.

Sammenhæng mellem antal lokaliteter identificeret af MACS og SICER i både C27IM og LNCaP celler viste en betydelig konkordans (se Metoder ), yderligere valideret af resultaterne af chip-analysen vist i figur S4. For eksempel hTERT, en østrogen target gen, med flere kendte østrogenresponselementerne [1], [19], [33], [34] viser MACS toppe og E2-øget SICER øer i korrespondance til websteder godt karakteriseret ved chip-qPCR (figur S4A ); pS2 (TFF1), en klassisk østrogen målgen, udviser E2-øget SICER-afledte øer på sites forstærkes af chip-qPCR (figur s4b); GSTP1, et gen bragt til tavshed af den ERp-eNOS kompleks i fravær af ligand [5] viser MACS toppe i korrespondance til steder forstærkes af chip-qPCR, udelukkende i ikke-stimulerede tilstand (figur S4C).

Desuden matrixen af ​​parvise korrelation afbilder DNA belægning på basis af MACS peak score og koordinater (fig S5A) samt den hierarkiske klyngeanalyse af bindingsaffinitet (heatmap), der viser affiniteter for differentielt bundne sites opkalds beregnet ud fra læser tælledata og MACS peak koordinater (fig S5B) afslørede, at bindingssteder grupperet først som reaktion på E2 og derefter i henhold celletypen. I alt 692 E2 vs NT forskelligt repræsenteret toppe (FDR 0,05). Blev identificeret, heraf 287 med en positiv fold forandring og resten med en negativ

Endelig vi valideret eNOS chip-Seq berigelse data observeret efter estradiol behandling. E2 virkning blev overvåget i C27IM celler, ubehandlede (NT) eller E2-behandlet, ved anvendelse af anti-eNOS-antistof og chip-qPCR på otte genpromotorer tidligere identificerede eller afledt af microRNA profil-analyse (figur 1 E og figur 2A nedenfor) [1] . Vores resultater viser en signifikant sammenhæng mellem tilstedeværelsen Enos-toppe, som på vej ud af chip-Seq datasæt ved østrogenbehandling (figur S4 og

data ikke vist

) og østrogen-inducerede rekruttering af eNOS på samme genomiske regioner som vurderet af traditionelle chip-qPCR. Berigelser blev normaliseret til fravær af antistof (noAb), eller et ubeslægtet antistof (Ab IgG). Specificitet af chip-Seq blev sikret ved hjælp af primere amplificerer et genomisk region inden kromosom 5 mangler eNOS toppe og samtidig viser fraværet af eNOS rekruttering af klassisk chip-qPCR.

A) Overvåget klynge analyse af microRNA profilering (Exiqon Array) for de to grupper af patienter, defineret ved recidiv status (god eller dårlig prognose). B) Validering af kvantitativ realtids-PCR med differentierede miRNA niveauer i G1 (Bad prognose n = 7) og G2 (god prognose n = 8) grupper, * p 0,05 G1 vs G2. C) Differential niveau af primære transkripter (PRI-MIR) i G1 (n = 7) og G2 (n = 8), * p 0,05 G1 vs G2. Data er repræsenteret som box plot på en logaritme skala.

Cluster analyse af miRNA mønster i PCA celler.

Med henblik på at differentiere dødelige og ikke-dødelige prostatakræft og i sidste ende forbedre