PLoS ONE: Rolle RUNX3 undertrykke Metastase og Angiogenese for Human prostatakræft

Abstrakt

RUNX3 (runt-relaterede transskription faktor-3) er blevet rapporteret til at undertrykke tumor tumorgenese og metastase i forskellige menneskelige kræftformer. I denne undersøgelse anvendte vi væv microarray (TMA) til at bestemme betydningen af ​​RUNX3 i prostatacancer madskriden. Vores resultater viste ektopisk ekspression af RUNX3 i prostata cancer væv sammenlignet med tumor tilstødende normale prostatavæv, og reduceret RUNX3 farvning blev signifikant korreleret med TNM fase. Desuden har vi demonstreret, at RUNX3 overekspression hæmmede prostatakræft cellemigration og invasion som følge af den forhøjede opregulering af væv inhibitor af matrixmetalloproteinase-2 (TIMP-2), som efterfølgende inhiberet metalloproteinase-2 (MMP-2) ekspression og aktivitet in vitro. Banke ned af RUNX3 ekspression brød op balancen i TIMP-2 /MMP-2, hvorimod tavshed TIMP-2 resulterede i inhibering af MMP-2-ekspression i prostataceller. Vi viste også, at genoprettelse af RUNX3 nedsat vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) sekretion og undertrykt endotelcellevækst og dannelse rør. Slående, RUNX3 blev påvist at inhibere tumormetastase og angiogenese i vivo. Alt i alt, vores resultater understøtter tumor undertrykkende rolle RUNX3 i human prostatacancer, og give indsigt i udvikling af målrettet behandling for denne sygdom

Henvisning:. Chen F, Wang M, Bai J, Liu Q, Xi Y Li W, et al. (2014) Rolle RUNX3 undertrykke Metastase og Angiogenese for Human prostatakræft. PLoS ONE 9 (1): e86917. doi: 10,1371 /journal.pone.0086917

Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA

Modtaget: 14. august 2013; Accepteret: 16. december 2013; Udgivet: 24 Januar 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt er støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.302.207). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt mænd i [1] USA. Kirurgisk indgreb er stadig den mest effektive behandling for primær prostatacancer, selv om ca. 30% af prostata patienter opstår sygdomstilbagefald og /eller metastase efter de indledende behandlinger, hvilket resulterer i den relativt korte periode overlevelse (12-15 måneder) [2]. Metastase er en overordentlig kompleks proces, herunder cancerceller migrerer ud af primære tumorer og invadere ind i de omkringliggende væv, intravasate i blodet eller lymfatiske cirkulation, overleve i blodstrømmen, og målrette specifikke organer til at indlede metastatisk udvækst [3]. Det er vigtigt for bedre at forstå den mekanistiske grundlag af tumor metastase ved at identificere de vigtigste molekyler er involveret i denne proces, som vil give indsigt i udviklingen af ​​mere effektive strategier til at forhindre tumor progression.

Runt domænenavn familie, der består af RUNX1, RUNX2, og RUNX3, er Master regulatorer af genekspression i celledeling og differentiering. RUNX familie proteiner indeholder den godt konserverede domæne med 128 aminosyrer region (Runt domæne) og danner et stabilt kompleks med PEBP2b /CBFb at udøve sin transaktivering evne [4]. Alle tre RUNX familiemedlemmer spiller en vigtig rolle i normale udviklingsprocesser og tumotigenesis [5]. RUNX proteiner regulere ekspressionen af ​​cellulære gener ved at binde til promotorer eller forstærkere af target gener relateret til celle-skæbne beslutninger, som bliver sindsforvirret i cancerceller [6].

Blandt de tre RUNX familiemedlemmer, RUNX3 var oprindeligt klones som Aml2 og er lokaliseret på kromosom 1p36.1. RUNX3 blev først rapporteret at korrelere med tilblivelsen og progression af human gastrisk cancer som en tumorsuppressor [7]. Udover gastrisk cancer, er det blevet rapporteret, at ektopisk ekspression af RUNX3 blev observeret i forskellige cancerformer, herunder brystcancer, gliom [8], [9]. Analyse af kliniske vævsprøver fra peritoneale metastaser følge af gastriske cancere dokumenterer, at RUNX3 ekspression faldt betydeligt i den metastatiske væv, sammenlignet med normal gastrisk mucosa eller primære vigtigste tumorer. ([10]) er vigtigt, at faldet i RUNX3 proteinekspression er signifikant associeret med dårlig overlevelse mavekræft og melanom patienter [11], [12]. I vores tidligere undersøgelse påviste vi, at RUNX3 kan fungere som en tumorsuppressor ved at regulere cellemigrering, invasion og angiogenese i renalcellecarcinom [13]. Disse undersøgelser antyder en central rolle RUNX3 i tumorigenese og progression. Imidlertid er funktionen af ​​RUNX3 i prostatacancer er endnu ikke godt undersøgt.

I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​RUNX3 i forhold til clinicopathologic funktioner ved hjælp prostatakræft væv microarray. Vi fandt, at tab af RUNX3 ekspression direkte korreleret med prostatakræft TNM fase. Desuden restaurering af RUNX3 ekspression førte til undertrykkelse af MMP-2 og induktion af TIMP-2, som udgør i det mindste delvis undertrykkelse af tumopr progression og metastase. Disse resultater stemmer overens med den rolle, RUNX3 i regulering TIMP-2 /MMP-2 i normale prostataceller. Endvidere har vi vist, at reduktion af VEGF-sekretion induceret af RUNX3 genindførelse inhiberede prostatakræft angiogenese. Vores kliniske og mekanistiske data viste, at RUNX3 kan være en tumor suppressor involveret i udviklingen af ​​prostatakræft og målretning af RUNX3 vej udgjorde en potentiel behandling modalitet til human prostatacancer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse af væv microarray blev udført under en protokol godkendt af Institutional Review Boards of tilknyttede Hospital i Xuzhou Medical College og alle undersøgelser blev udført efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke.

alle dyr eksperimenter blev udført under anvendelse af mandlige nøgne mus (6-7 uger gamle). Musene blev købt fra SLAC Laboratory Animal Ltd., Co (Shanghai, Kina) og plejes i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle dyr forsøgsprotokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Xuzhou Medical College (IACUC No. 1201).

Patienter og prøver

En prostatakræft TMA blev købt fra Shanghai Xinchao Bioteknologi ( Shanghai, Kina). Tumorer blev iscenesat i henhold til 2013 reviderede TNM-system som følger [14]: 139 sager med trin I-II og 79 tilfælde med trin III-IV. Desuden omfatter 52 tilfælde af tumor tilstødende normale prostatavæv. Den vifte dot diameter var 1,5 mm, og hver prik repræsenterede et væv udgangspunkt én individuelle prøve, der blev valgt, og patologisk bekræftet.

Immunhistokemi

Immunhistokemi farvning blev udført som tidligere [13] beskrevet. Den primære kanin anti-RUNX3 antistof (1:200) (Medical og Biological Laboratories, Nagoya, Japan), anti-VIII (1:100), anti-PAP (1:100) (Santa Cruz, CA, USA) og biotinyleret anti-mus IgG (1:200) (Boster Biotech, Wuhan, Kina) blev anvendt. For TMA farvning vurdering blev immunoreaktiviteten vurderet blindt af to uafhængige observatører ved hjælp af lysmikroskopi (Olympus BX-51 lysmikroskop), og billedet blev opsamlet ved Camedia Master C-3040 digitalkamera. Ekspressionen af ​​RUNX3 blev klassificeret som positivt, når 10% af tumorcellerne udviste immunopositivitet. Biopsier med 10% tumorceller viser immunfarvning blev anset negativ [15].

cellelinjer og transfektion

Menneskelig prostatakræft-cellelinier PC3, DU145 og prostata celle RWPE-1 blev købt fra Shanghai Institut for Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HUVEC’er blev fremskaffet fra Nanjing Kaiji Biotech. DU145-celler blev dyrket i F12 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS). RWPE-1-celler blev opretholdt i K-SFM mediun med 10% FCS. PC3 celler og HUVEC’er blev dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% FCS. Celler blev i et 37 ° C fugtig inkubator med 95% luft, 5% CO

2. De pFlag-kontrol og pFlag-RUNX3 ekspressionsplasmider blev opnået fra Dr. Pei-Jung Lu (National Cheng-Kung University, Tainan, Taiwan).

For transient transfektion, transfektion af pFlag-kontrol og pFlag-RUNX3 plasmider i PC3 og DU145-celler blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Shanghai, Kina) ved at følge fabrikantens protokol. Transfektion af si-RUNX3, si-TIMP-2 og styre siRNA ind RWPE-1-celler blev udført under anvendelse siLentFect Lipid Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For stabil transfektion, den lentivirale ekspressionsvektorer LV5-RUNX3 og LV5-Control blev opnået fra Shanghai Gene Pharma Company (Kina). De lentivirus blev blandet med polybren (5 ug /ml) og tilsat til DU145 celler til infektion. De positive kloner blev selekteret i puromycin (5 ug /ml). De stabile RUNX3 transfektanter blev isoleret efter 2 uger under selektion.

Migration og Invasion Assay

Cell migration og invasion assay blev bestemt ved anvendelse af en modificeret to kammer migration assay med en porestørrelse på 8 um . For migration assay blev 1 × 10

6 PC3 og DU145 celler udsået i serum-frit medium i det øverste kammer. Efter 12 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne i det øvre kammer forsigtigt fjernet med en vatpind og de celler, der var gennemkøres membranen blev fikseret i methanol, farvet med hematoxylin og talt. For invasion assay blev cellerne udsået i serum-frit medium i det øvre kammer. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev noinvasive celler forsigtigt fjernet fra toppen af ​​matrigel med en vatpind. Invasive celler i bunden af ​​matrigel blev fikseret i methanol og farvet med leucocrystal violet. For kvantificering blev cellerne talt under et mikroskop i fem felter (op, ned, median, venstre, højre. × 200).

HUVEC Vækst og Tube Formation Assay

Transficerede PC3 og DU145 celler blev dyrket i 6-brønds plade med frisk komplet medium i 24 timer blev mediet opsamlet og centrifugeret til fjernelse af eventuelt cellerester før dets anvendelse som et konditioneret medium. For cellevækst assay 2 × 10

4 HUVEC’er suspenderet i 100 pi konditioneret medium og udsået med en tæthed på 2 x 10

4 i en 96-brønds dyrkningsplade og inkuberes i 24 timer. Derefter blev celledeling detekteret ved hjælp Cell optælling kit-8 (CCK-8) købt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kina). For rør-dannelse assay blev 48-brønds plade overtrukket med Matrigel (BD Biosciences, NJ, USA) og holdt i 37 ° C i 0,5 time. Derefter, 2 × 10

4 HUVEC’er blev suspenderet i 100 pi konditioneret medium og anvendt til præ-coatede 48-brønds plade. Efter inkubation ved 37 ° C i yderligere 24 timer blev antallet af kapilllærlignende rør fra tre tilfældigt udvalgte felter talt og fotograferet under et Nikon inverteret mikroskop (Nikon, Japan).

ELISA for VEGF

PC3 og DU145-celler blev udpladet i 6-brønds vævskulturplader med en densitet på 1 x 10

6 celler pr. Derefter blev cellerne transficeret med pFlag-kontrol og pFlag-RUNX3 med serum sult. Supernatanterne blev opsamlet 24 timer efter transfektion. VEGF-koncentration blev bestemt under anvendelse Quantikine ELISA kits ifølge producentens instruktioner (R reverse GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3; TIMP2 fremad, ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG; CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG og GAPDH fremad, TGAA GGTCGGAGTCAACGGATT; reverse, CCTGGAAGATGGTGATGGGATT. Salg

Western blot-analyse

celle eller vævsekstrakter blev separeret på en 10% SDS-polyacrylamidgel. Proteinerne blev herefter overført til nitrocellulosemembran og inkuberes natten over ved 4 ° C med de følgende antistoffer: muse-anti-RUNX3, kanin-anti-MMP-9, MMP-2, TIMP-1 og TIMP-2 (Cell Signaling Technology, MA, USA) og muse-anti-β-actin (Santa Cruz, CA, USA). Membraner blev derefter vasket og inkuberet med sekundært antistof (gede-anti-kanin og ged anti-mus IgG) i 2 timer, farvet med farvning væske, som indeholder 10 ml alkalisk phosphatase buffer og fremkaldt under anvendelse NBT /BCIP farve substrat (Promega, Madison, USA ).

In vivo Eksperimentel Metastase modeller

To grupper af 8 mandlige nøgne mus blev opstaldet i SPF barriere faciliteter under en 12 timers lys /mørke cyklus. Mus blev injiceret via halevenen med RUNX3 stabilt transficeret DU145 celler (1 x 10

6 celler pr flanke) i 100 pi PBS. En insulin nål blev anvendt til halevenen injektioner. Cellelevedygtighed blev bestemt ved trypan blå-udelukkelse og kun enkelt-cellesuspensioner 95% levedygtige blev anvendt. Mus blev aflivet på 8 uger efter implantation, blev lunger fikseret i 10% formelle dehyde, og hematoxylin og eosin (HE) farvet for metastatiske knuder.

Subkutan in vivo forsøg

At evaluere rør dannelse blev to grupper på 8 mandlige nøgne mus injiceret med RUNX3 stabilt transficeret DU145 celler (1 x 10

6 celler pr flanke) i 100 pi PBS /Matrigel (50:50) subkutant. Dyrene blev overvåget dagligt. Kropsvægt hver mus blev registreret, og tumorvolumen blev bestemt ved skydelære hver dag, efter formlen for A × B

2 × 0,52, hvor A er den længste diameter af tumor, og B er den korteste diameter. Mus blev aflivet efter 8 uger efter implantation, og tumorerne blev fjernet kirurgisk og fikseret i 10% formel dehyde til histologi. Alle eksperimentelle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle etiske krav og godkendt af udvalget Xuzhou Medical College for brug og pasning af dyr.

Statistisk analyse

Numeriske data er udtrykt som middel ± SD Statistiske forskelle mellem organerne til de forskellige grupper blev vurderet med Instat 5.0 (GraphPAD software, San Diego, CA) under anvendelse af envejs variansanalyse (ANOVA). For TMA, blev statistisk analyse udført med SPSS 11.5 software (SPSS). Sammenhængen mellem RUNX3 farvning og clinicopathologic parametre for patienter i prostata cancer, herunder alder, tumorstørrelse, tumor kvalitet og TNM stadie, blev evalueret ved χ

2 test. Betydningen af ​​in vivo data blev bestemt under anvendelse af to-halet Mann-Whitney U test. Forskelle blev betragtet som statistisk forskellige på

P

. 0,05

Resultater

RUNX3 Expression reduceres i Human Prostata Cancer

Vi først afgøres, om RUNX3 udtryk ændres i human prostatacancer. Immunhistokemi farvning blev udført i TMA slide indeholdende tumor tilstødende normale prostatavæv og prostatakræft væv. De presentative billeder blev præsenteret i fig. 1A. Vores resultater viste, at der var en signifikant lavere niveau af RUNX3 ekspression i tumorerne end i tumoren tilstødende normale prostatavæv (

P

0,01, figur 1B.). Disse foreslog, at RUNX3 almindeligvis blev udtrykt i normalt humant prostata væv, men nedsat eller fraværende i prostatakræft væv.

En repræsentant immunhistokemiske fotografierne blev taget på forskellige forstørrelser i tumor tilstødende normale prostata væv og prostatakræft væv (Top panel × 100, bundpanelet × 400). B sammenlignes med den i tumoren tilstødende normale prostatavæv, det samlede ekspressionsniveau af RUNX3 i prostatacancer væv var signifikant lavere (

P

0,01, χ

2 test). C Tiltaget RUNX3 udtryk var korreleret med TNM stadie (

P

0,01, χ

2 test, sammenligne I-II versus III-IV).

Tab af RUNX3 Expression i prostatakræft er associeret med Tumor Stage

i alle 218 patienter med prostatacancer, er forholdet mellem RUNX3 udtryk og patologiske og kliniske funktioner vist i tabel 1. den gennemsnitlige (SD) alder af patienterne var 58,7 år ( median, 66,5 år rækkevidde, 37-87 år). Fordi TNM stadie er en vigtig prognostisk markør for patienter med prostatakræft, opdaget vi RUNX3 udtryk i 139 den tidlige fase (I-II) og i 79 sene (III-IV) kategorier af prostatakræft væv. Vi fandt RUNX3 farvning blev dramatisk reduceret i sene stadier sammenlignet med tidlig fase I-II (

P

. 0,01, figur 1C). Men vi fandt ikke signifikant sammenhæng mellem RUNX3 udtryk med andre clinicopathologic variabler, herunder alder, tumorstørrelse og tumor klasse.

Restaurering af RUNX3 Expression Hæmmet Prostata Cancer Cells Migration og Invasion in vitro

Da RUNX3 ekspression er relateret til TNM stadie med prostatacancer, kan RUNX3 spille vigtige roller i et eller flere trin af prostatacancer metastaser. Vi først undersøge effekten af ​​RUNX3 genindførelse om migration og invasion prostata kræftceller. Vi forbigående transficeret PC3 og DU145 celler med pFlag-kontrol og pFlag-RUNX3 plasmider. Fireogtyve timer efter transfektion blev proteinet signifikant overudtrykt i cancerceller (fig. 2A og B). Transficerede celler blev underkastet cellemigrationsassay og invasion assay. I cellemigrationsassay, fandt vi, at RUNX3 restaurering i PC3 og DU145 celler faldt evnen til at migrere gennem Boyden kammer med 55% og 63%, henholdsvis (fig 2C og D). (

P

0,05) . I celle invasion assay viste RUNX3-transficerede celler signifikant lavere invasiv potens end kontrollen, med invasive celler med 57% og 82% i PC3 og DU145 celler, henholdsvis (fig. 2E og F) (

P

0,05, ANOVA)

Invasive evne kræftceller kan reguleres ved MMP.. For at undersøge den mulige rolle af MMP’er i RUNX3-induceret inhibering af celleinvasion, udførte vi gelatinezymografi at måle MMP-2 og MMP-9-aktivitet. MMP-2-enzymaktivitet blev undertrykt efter tvungen ekspression af RUNX3 i PC3 og DU145 celler (fig. 3A). Western blot blev anvendt til at undersøge de TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 og MMP-9 udtryk i prostatacancerceller. Vores resultater viste, at inhibering af MMP-2-protein niveau skyldes den øgede ekspression af TIMP-2 efter RUNX3 overekspression i begge cellelinier (fig. 3B). For yderligere at bekræfte rolle RUNX3 i regulering TIMP-2 /MMP-2, blev den normale prostata celle RWPE-1 anvendes i vores undersøgelse og vores data viste, at banke ned af RUNX3 ekspression brød op balancen i TIMP-2 /MMP -2 (fig. 3C), mens tavshed TIMP-2 resulterede i inhibering af MMP-2-mRNA og proteinekspression i prostata celle (fig. 3D og E). Disse resultater viste, at RUNX3 var involveret i reguleringen af ​​TIMP-2 /MMP-2.

En Aktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9 blev evalueret af gelatinezymografi. B Western blot-analyse af de relative proteinniveauer af MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 og β-actin i RUNX3 re-ekspression og kontrolgruppen for både PC3 og DU145 cellelinier. C Western Blot for proteinet ekspression af MMP-2, TIMP-2 og β-actin i RUNX3 udskæring og kontrolgruppe til RWPE-1-cellelinien. D Western blot-analyse for MMP-2 og β-actin-ekspression efter banke ned af TIMP-2. E Real time PCR for MMP-2 mRNA-ekspression efter banke ned af TIMP-2. Data er vist som middelværdi ± S.D. *

P

. 0,05

Restaurering af RUNX3 Expression Reduceret Angiogenese in vitro

For yderligere at bestemme virkningen af ​​restaurerede RUNX3 udtryk på angiogene potentiale menneskelige prostata cancerceller, de angiogene potentialer supernatanten af ​​PC3 og DU145 celler transficeret med pFlag-kontrol eller pFlag-RUNX3 blev bestemt ved endotelcelleproliferation assay og dannelse rør assay. I celleproliferationsassay, fandt vi, at konditioneret medium fra PC3 og DU145 celler transficeret med pFlag-RUNX3 inhiberede proliferation af endotelceller sammenlignet med de kontrolceller (fig. 4A og B). I røret formation assay blev graden af ​​dannelse rør vurderet som procentdelen af ​​cellen overfladeareal versus samlede overfladeareal. Som vist i figur 4C og D, blev det gennemsnitlige antal af komplette rørformede strukturer dannet af HUVEC’er faldt betydeligt i konditioneret medium fra RUNX3 overudtrykker PC3 og DU145 celler sammenlignet med vektor kontrollerne (

P

0,05).

A og B CCK-8 celleproliferation assay blev udført til påvisning af HUVEC’er proliferation. C og D Repræsentative billeder blev taget på stedet for dannelse rør i supernatanten af ​​PC3 og DU145 celler transduceret med pFlag-kontrol og pFlag-RUNX3. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. E-ELISA for sekretion af VEGF i PC3 og DU145 celler transduceret med pFlag-kontrol og pFlag-RUNX3. Data er vist som middelværdi ± S.D. *

P

. 0,05

VEGF er en vigtig mitogen og overlevelse faktor for endotelceller. Som reaktion på angiogen stimulation, endotelceller indgå en aktiv proliferativ tilstand. For at evaluere den mekanisme af RUNX3 regulere angiogenese, blev ELISA udført for at påvise VEGF udskilt i konditioneret dyrkningsmedium af prostatacancerceller. Som vist i fig. 4E, blev der observeret signifikant reduktion i VEGF-sekretion i konditioneret medium fra PC3 og DU145 celler transficeret med pFlag-RUNX3 sammenlignet med kontrol-celler (

P

0,05).

Restaurering af RUNX3 Expression Hæmmet metastase in vivo

Fordi RUNX3 ekspression faldt tumorcellemigration og invasion in vitro, blev en halevene metastatisk assay anvendes til at analysere in vivo virkningerne af RUNX3 ekspression på den metastatiske styrke af DU145 celler. Sammenlignet med kontrol celler inficeret med tomme virusvektor, viste han-farvning, at haleveneinjektion af celler, der stabilt inficeret med LV5-RUNX3 i athymiske nøgne mus medførte signifikant færre antal knuder i lungerne (fig. 5A og B). For yderligere at bekræfte dette fjernmetastaser, udførte vi immunhistokemi for at detektere kritiske markører for prostatakræft. Prostataspecifikt antigen (PSA) og prostata-sur phosphatase (PAP) anses for at være kritiske markører til diagnosticering af prostatacancer [16]. Imidlertid er PSA ikke udtrykkes i DU145-celler [17]. , Brugte således vi PAP i vores undersøgelse for at undersøge kilden til tumor knuder i lungerne. Som vist i fig. 5C, PAP positiv i lungevæv viste, at den fjerne metastaser i dyremodellen var fra DU145 celler, som blev injiceret fra hale fartøj. Disse resultater viste bemærkelsesværdige inhibitoriske virkninger af RUNX3 på pulmonal metastase af prostatacancerceller.

En Mus blev injiceret med blev injiceret via halevenen med DU145-celler transficeret med de anførte ekspressionsplasmider. Grupper indeholdt 8 mus. Otte uger senere blev musene aflivet, og lungerne metastase af DU145-celler blev målt ved makroskopisk efter obduktion. Histologisk analyse af metastatiske læsioner i ribbenene af nøgne mus blev båret af HE-farvning. B Kvantificering af knuder i lungerne med ændrede RUNX3 niveauer. Antallet af knuder blev blindt evalueret i 5 tilfældige felter pr implantat ved 200 forstørrelser. Data er vist som middelværdi ± S.D. *

P

0,05. C repræsentant immunohistokemiske fotografier af PAP udtryk i lungevæv (forstørrelser, × 200 og × 400). * Tumor væv.

Restaurering af RUNX3 Expression Undertrykt tumorigenese in vivo

For at undersøge effekten af ​​RUNX3 behandling på tumorvækst in vivo, vi etableret en subkutan tumor i nøgne mus. Fig. 6A viste, at RUNX3 protein var overudtrykt efter stabilt inficeret med LV5-RUNX3. Tumorer i mus stabilt inficeret med LV5-RUNX3 havde lidt et markant vækst anholdelse i forhold til kontroller (

P

0,05). Et repræsentativt fotografi, der viser tumorvækst i kontrol og RUNX3 udtrykte mus (fig. 6B).

en nøgen mus blev injiceret subkutant med DU145 celler stabilt udtrykker LV5-RUNX3 eller LV5-Control. Western blot blev anvendt til at undersøge RUNX3 proteinniveau. B Tumorerne blev overvåget for alt otte uger. Tumordiameter blev målt med en passer hver uge, og tumorvolumen blev beregnet efter formlen af ​​A × B

2 × 0,52, hvor A er den længste diameter af tumor, og B er den korteste diameter. Tumoren volumen var signifikant større ved otte uger i mus, der fik kontrol lentivira sammenlignet med disse givne RUNX3 lentivirus (*

P

0,05). C Repræsentative mus med tumorer behandlet med kontrol sammenlignet gruppe med RUNX3 gruppe. D Ekspressionsniveauerne for RUNX3 og VIII blev analyseret i tumorvæv ved immunhistokemi med repræsentative billeder viste (forstørrelser, × 400). E Kvantificering af mikrokardannelse i tumorer med ændrede RUNX3 niveauer. MVD blev vurderet via fartøj tælling. Antallet af farvede mikrokar blev blindt evalueret i 5 tilfældige felter pr implantat på 200 × forstørrelse. * Angiver signifikant forskel fra kontrollerne (

P

0,05).

For at undersøge, om undertrykkelse af tumorvækst er forbundet med effekten af ​​injicerede RUNX3 stabilt transficerede celler, den tumorer blev dissekeret for at undersøge RUNX3 ekspression ved immunohistokemisk analyse. Som vist i fig. 6C RUNX3 protein blev overexpressesed i RUNX3-injicerede xenotransplantat sammenlignet med lav RUNX3 ekspression i kontrolgruppen. Disse resultater yderligere at styrke signifikant effekt af RUNX3 undertrykkelse på vækst prostatakræft.

Restaurering af RUNX3 Expression Reduceret Angiogenese in vivo

Da RUNX3 ikke påvirkede tumorcelleproliferation in vitro, er det sandsynligt, at RUNX3 undertrykt tumorigenese in vivo gennem blokering VEGF i endotelceller (angiogenese). Vi testede derfor virkningen af ​​RUNX3 på angiogenese. DU145-celler, der stabilt udtrykker RUNX3 eller kontrol vektorer blev blandet med Matrigel og injiceres i begge flanker af de nøgne mus. Musene blev aflivet 56 dage efter implantation. Antallet af VIII-positive mikrokar var meget lavere i sektionerne fra xenotransplantater af RUNX3-udtrykkende DU145-celler (fig. 6C og D), hvilket indikerer, at RUNX3 svækket prostatacancercelle-inducerende angiogenese. Resultaterne antydede, at den ændrede tumorvækst og metastase ved restaureret RUNX3 udtryk var korreleret med ændret angiogenese.

Diskussion

rolle RUNX3 i tumorigenese er blevet omfattende undersøgt i de seneste år. Tidligere rapporter har vist, at RUNX3 ekspression blev reduceret i mange typer af humane cancere, såsom brystcancer, colorektal cancer, renalcellecarcinom, melanom [8], [11], [13], [18]. Der har været tegn på, at RUNX3 methylering var særligt hyppige i forskellige kohorter af prostatakræft, men ikke i normal prostata mucosa [19], [20]. Disse observationer antyder en vigtig rolle for RUNX3 i humane cancere, herunder prostatacancer. Imidlertid har den funktion RUNX3 i prostatacancer ikke undersøgt. Bedre at forstå den nøjagtige rolle af RUNX3 i udvikling af prostatacancer, brugte vi TMA teknologi, in vitro celle model og in vivo dyremodel til at undersøge den rolle, RUNX3 i prostatacancer. Vores kliniske resultater viste, at RUNX3 gik tabt i prostatakræft og korreleret med TNM fase. Vores in vitro studier viste, at RUNX3 i prostatacancerceller reducerer cellemigrering, invasion og angiogenese evner, hvilket var i overensstemmelse med funktionen af ​​RUNX3 in vivo.

Kirurgisk resektion er den mest populær anvendte strategi i behandling med det primære prostatacancer [2]. Men for patienter med de avancerede sygdomme, det kirurgiske indgreb viser, færre kvalifiicere [21]. Således er det vigtigt at forudsige risikoen for tilbagefald til at minimere de skadelige virkninger og maksimere den terapeutiske virkning af behandling af prostatacancer. Men af ​​de tilgængelige prognostiske faktorer for prostatacancer, det vigtigste er International Union Against Cancer TNM fase som bestemt af dybden af ​​invasion, involvering af lymfeknuder, og tilstedeværelsen af ​​fjernmetastaser [14]. I denne undersøgelse fandt vi, at RUNX3 ekspression blev tabt i prostatakræft væv. Desuden blev RUNX3 protein signifikant reduceret i sent stadium (fig. 1). Vores kliniske beviser støttede klart den opfattelse, at ændrede udtryk for RUNX3 bidrager til prostatakræft udvikling og metastase. Det er blevet rapporteret, at reduceret ekspression af RUNX3 ofte var forårsaget af CpG island hypermethylering [19]. Desuden blev punktmutationer af RUNX3 observeret i gastriske og blære kræft [22], [23]. Men det molekylære grundlag for tab eller nedsættelse af RUNX3 udtryk i prostatakræft stadig, der skal fastlægges.

Tumor celle migration og invasion er væsentlige skridt i processen med metastaser.