PLoS ONE: endogene humane MDM2-C udtrykkes kraftigt i Human Kræft og fungerer som p53-Uafhængig Growth Activator

Abstrakt

Menneskelige kræftformer overudtrykker

MDM2

, gennem et T til G variation på et enkelt nukleotid polymorfisme ved position 309 (

MDM2

SNP309), har funktionelt inaktiveret p53, der ikke er reel nedbrydes. De har også høj ekspression af alternativt splejsede transkript,

MDM2-C

. Alternativt splejset

MDM2

transkripter udtrykkes i mange former for human cancer og når de er eksogent udtrykte de transformerer humane celler. Men ingen undersøgelse til dato har registreret endogene MDM2 proteinisoformer. Undersøgelser med eksogen udtryk for splejsningsvarianter er blevet udført med

MDM2-A

og

MDM2-B

, men

MDM2-C

isoform har stort set uudforsket. Vi rettet den cellulære påvirkning af eksogent udtrykte MDM2-C, og spurgte, om endogen MDM2-C protein var til stede i humane kræftformer. For at detektere endogen MDM2-C protein, vi skabt en menneskelig MDM2-C antistof til splejse krydset epitop af exon fire og ti (MDM2 C410) og valideret antistoffet med

in vitro

oversat fuld længde MDM2 forhold til MDM2 C. Interessant nok opdagede vi, at MDM2-C co-migrerer med MDM2-FL ved ca. 98 kDa. Brug den validerede C410 antistof opdaget vi høj ekspression af endogen MDM2-C i menneskelige kræftceller og humane kræft væv. I østrogenreceptoren positive (ER +)

MDM2

G /G SNP309 brystcancer cellelinje, T47D, observerede vi en stigning i endogen MDM2-C-protein med østrogenbehandling. MDM2-C lokaliseret til kernen og cytoplasmaet. Vi undersøgte den biologiske aktivitet af MDM2-C ved eksogent udtrykker proteinet og bemærkede, at MDM2-C ikke effektivt målrette p53 til nedbrydning eller reducere p53 transkriptionel aktivitet. Exogen udtryk for MDM2-C i

p53

-null humane cancerceller øget kolonidannelse, hvilket indikerer p53-uafhængige tumorgene egenskaber. Vores data indikerer en rolle for MDM2-C, der ikke kræver inhibering af p53 til forøgelse cancercelleproliferation og overlevelse

Henvisning:. Okoro DR, Arva N, Gao C, Polotskaia A, Puente C, Rosso M et al. (2013) endogene humane MDM2-C er stærkt Udtrykt i Human Kræft og funktioner som en p53-uafhængig vækst Activator. PLoS ONE 8 (10): e77643. doi: 10,1371 /journal.pone.0077643

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: November 21, 2012; Accepteret: 12. september 2013; Udgivet: 11 oktober, 2013 |

Copyright: © 2013 Okoro et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Science Foundation (MCB- 0.744.316), et tilskud fra The Breast Cancer Research Foundation, og en bevilling fra Clinical Translationel Science center (CTSC) TR000457 af National center for Fremme Tranlsational Sciences i National Institutes Sundhedsstyrelsen til J. Bargonetti. Det blev også gjort muligt delvist af en infrastruktur pris til Hunter College, tilskud nummer MD007599 fra National Institute on Minority Health and Health Uligheder, en komponent af National Institutes of Health (NIH). Dens indhold er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NIMHD eller NIH. GØRE. blev delvist støttet af en CUNY Magnet Award og M. R. blev støttet af MBRs-RISE Program til Hunter College 3R25-GM060665. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

onkogen aktivitet af MDM2 er associeret med over-ekspression af MDM2 protein i humane cancere [1-3]. Mens nogle MDM2 isoformer kan danne en direkte fysisk forbindelse med p53 andre gør ikke [3,4]. MDM2 regulerer p53 proteinet gennem proteasomalaktivitet-medieret nedbrydning [5-10] og transkriptionel repression [5,11-14]. Denne p53-medieret onkogen aktivitet af MDM2 er bedst benævnt MDM2 kanoniske funktioner. Imidlertid er MDM2 også kendt for at besidde p53-uafhængige funktioner [15-19], som bedst benævnt MDM2 ikke-kanoniske funktioner.

overekspression af MDM2 på grund af en enkelt nukleotid polymorfisme af thymin til guanin (T til G) ved position 309 af

MDM2

gen (

MDM2

SNP309) er forbundet med øget kræftforekomst og aggressivitet [20-23]. Dette

MDM2

SNP309 nukleotidændring øger bindingsaffinitet for den konstitutive transskriptionsfaktor, Sp1 [21]. Celler homozygote for G /G

MDM2

SNP309 har forbedret

mdm2

transskription og høj MDM2 protein niveauer. MDM2 overekspression i kræftsygdomme er ofte ledsaget med overekspression af alternativt splejsede

MDM2

udskrifter [3,24-28]. Over 40 alternativt og afvigende splejset menneske

MDM2

udskrifter er blevet rapporteret, men ikke alle er knoglen fide resultat af alternativ splejsning begivenheder [29]. Ikke modstå,

MDM2

splejsningsvarianter repræsenterer potentielle mangfoldighed, der er enig med resultaterne af Encyclopedia of DNA Elements (KODE) Projekt Consortium. KODE fremhæver tidligere ikke erkendte kandidat regulatoriske elementer og kodede meddelelser, i det humane genom [30]. Mangfoldigheden af ​​

MDM2 Salg splejset meddelelser kodet fra to uafhængige promotorer har kapacitet til at forøge human cancer proteomanalyse [31]. Det er derfor ikke overraskende, at

MDM2

SNP309 celler demonstrere øget mangfoldighed i deres alternativt splejset

MDM2

udskrifter med betydelig udtryk for

MDM2-C

udskrift [32].

Selvom over 40

MDM2

er blevet identificeret alternativt splejsede udskrifter [29], kun fem, (

MDM2-A

gennem

MDM2-E

) er blevet vist at udtrykke protein

in vitro

[3]. Ekspressionen af ​​disse fem

MDM2 Salg transkripter forårsager NIH3T3-celler til dannelse af tumorassocieret foci [3]. Men kun to proteinisoformer, MDM2-A og B, er blevet grundigt undersøgt for deres biologiske funktioner. Den exogene udtryk for MDM2-A [33,34], eller MDM2-B i mus [35], øger tumor dannelse i en

p53

-null eller p53-kompromitteret baggrund forårsager en ændret tumor spektrum. Men den biologiske funktion af MDM2-C forbliver ubestemt.

Vi spurgte, om kræftcellerne udtrykker høje niveauer af

MDM2-C

mRNA udtrykte endogene MDM2-C protein. Vi antager, at høje

MDM2-C

transkriptniveauer kodet fra G-allelen

MDM2

SNP309 i humane kræftformer ville resultere i høje niveauer af endogen MDM2-C protein og ville give onkogene funktioner. Celler med MDM2 overekspression via G /G

MDM2

SNP309 har stabil p53 protein, som er co-lokaliseret med p53 på kromatin [14]. Således har vi den hypotese, at MDM2 overekspression via G /G SNP309 kan producere en MDM2-C-protein isoform, der ikke ville forringe p53. Derfor satte vi os for at bestemme den cellulære funktion af eksogent udtrykte MDM2-C. Vi har også spurgt, om kræftcellerne udtrykker høje niveauer af

MDM2-C

mRNA, også udtrykte endogene MDM2-C protein.

Endogen ekspression af MDM2-C-protein er aldrig blevet påvist på grund af fraværet af antistoffer, som specifikt detekterer MDM2 isoformer fremstillet af alternativt splejsede mRNA’er.

MDM2-C

transkript ikke indeholder exonerne 5 til 9, som koder for en del af p53-bindende domæne. Vi skabte et specifikt antistof udviklet til at registrere de aminosyrer kodet af MDM2-C flankerende exon 4 og 10, som vi opkaldt C410. Brug af denne MDM2 antistof observerede vi høje basale niveauer af endogent MDM2-C-protein i forskellige MDM2 over-udtrykkende cancercellelinier og væv. Vi observerede også, at i nærvær eller fravær af p53, eksogent udtrykte MDM2-C fremmer øget kolonidannelse. Tilsammen vores resultater indikerer, at endogent MDM2-C udtrykkes i cancere, og at MDM2-C fungerer uafhængigt af p53 til at fremme tumorigenese. Salg

Resultater

MDM2 over-udtrykkende celler har høje niveauer af MDM2-C udskrifter

Mange humane kræftceller over-express MDM2 protein og har været brugt til tidligere MDM2 studier [14,21,32,36,37]. Vi brugte disse cellelinjer til at undersøge forholdet mellem

MDM2-C

udskrifter til fuld-længde

MDM2

udskrifter. De cellelinjer undersøgte omfatter to høje MDM2 ekspressorer: SJSA-1 celler med vildtype

p53

overekspression af MDM2 grundet

MDM2

-genamplifikation (og

MDM2

SNP309 T /T alleler) og Manca celler med vildtype

p53

overekspression af MDM2 fra

MDM2

SNP309 G /G alleler. De omfatter også to lave MDM2 ekspressorer: K562-cellelinjen, der er

p53

-null og har en

MDM2

SNP309 T /G alleler og ML-1-celler med vildtype p53 og

MDM2

SNP309 T /T alleler.

Transkription af

MDM2-C

blev vurderet ved kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) og Northern blot-analyse (se figur 1 og figur S1). Kvantificering af total

MDM2

udskrifter, ved northern blot-analyse, viste det højeste niveau af

MDM2

udskrifter i SJSA-1 celler, som indeholder 25 kopier af

MDM2

gen [37]. Et højt niveau af

MDM2

transkription blev også observeret i Manca celler. For specifikt kvantificere udskrifter indeholder exon 6 og 7, vi gennemført QRT-PCR med en kvantitativ sonde til exon 6-7 krydset (figur 1B se sonde i grønne og figur 1C sorte søjler). For specifikt kvantificere

MDM2-C

udskrifter, vi brugte en fremadrettet PCR-primer designet til at genkende exon 4 og exon 10, junction (kaldet 4:10), og en omvendt primer til exon 12 (figur 1B, se primere i rød og Figur 1C grå søjler). I Manca celler, detekteret vi lavt niveau ekspression af

MDM2

transkript indeholdende exon 6 og 7, fra nu af omtalt som en

MDM2

fuld længde transkript (fig 1C). Vigtigere er det, Manca celler havde højt niveau udtryk for

MDM2-C

udskrift resulterer i en lavere andel af fuld længde til

MDM2-C

udskrift (figur 1C, MANCA sammenligne sort til grå bar). Dette var i modsætning til

MDM2

transskription i SJSA-1 celler, som giver samme indhold af

MDM2-C

MDM2

fuld længde udskrifter (figur 1C, SJSA -1 sammenligne sort til grå søjler). Lave niveauer af

MDM2

transkripter blev produceret i K562-celler og derfor er disse celler blev anvendt som den normalizer cellelinie. ML-1 celler viste lignende

MDM2

transkriptniveauer til K562. Dette indikerede, at overekspression af MDM2 protein i SJSA-1 celler og Manca celler korreleret med høje niveauer af

MDM2-C

udskrift. Desuden Manca celler havde den højeste andel af

MDM2-C

til fuld-længde udskrift. Dette resultat kan skyldes den

MDM2

SNP309 G /G genotype, der driver transskription fra den inducerbare P2 promoter

.

A. Kvantificering hjælp af Image J efter northern blot-analyse af RNA fra ubehandlede MANCA, SJSA-1, ML-1 og K562 celleprøver. En

MDM2

DNA-probe til exon 12 blev PCR-genereret og radioaktivt mærket med α

32P dCTP. Transkriptniveauer blev sammenlignet med K562 for basal udtryk og normaliseret for RNA-niveauer til

GAPDH

. Et gennemsnit på fire uafhængige eksperimenter er vist. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser.

B. Skematisk af

MDM2

beskeder registreres ved hjælp af en Taqman sonde til exon 6 og 7 (6-7 probe) eller fremad primer til 04:10 og reverse primer til 12 (4: 10-12 primer) til

MDM2-C

.

C. QRT-PCR med 04:10 fremad og exon 12 omvendt vs. Taqman sonde til exon 6 og 7 i

MDM2

blev udført for at opdage

MDM2-C

MDM2

(med exon 6 og 7) udskrifter.

blev påvist MDM2-C

udskrifter via Syber Green og

mdm2

(med exon 6 og 7) udskrifter blev påvist via Taqman teknologi. Transkriptniveauer blev sammenlignet med K562 for basal udtryk og normaliseret for RNA-niveauer til

GAPDH

. Et gennemsnit af tre uafhængige eksperimenter er vist. Fejl streger indikerer standardafvigelser.

D. QRT-PCR af RNA ved hjælp af Taqman teknologi fra p53 målgener,

p21

puma

efter DNA skade behandling med 8 pm etoposid i 3 timer. Data fra hver cellelinje præsenteres som normaliseret til sin egen ubehandlet kontrolprøve for fold aktivering og normaliseret for RNA-niveauer til

GAPDH

. Et gennemsnit af tre uafhængige eksperimenter er vist. Fejl streger indikerer standardafvigelser.

For at se, om

MDM2

fuld længde til

MDM2-C

udskrift forholdet påvirket p53 respons, vi sammenlignet aktiveringen af ​​to p53 målgener,

p21

puma

. Vi behandlede K562, ML-1, SJSA-1 og Manca celler med etoposid at initiere en DNA-skader reaktion, og overvåges

p21

puma

aktivering af QRT-PCR (Figur 1D). Som forventet,

p21

puma

gener blev ikke aktiveret i

p53

-null K562 celler. I SJSA-1 og Manca celler, som har vildtype p53 og høj MDM2,

p21

puma

gener påvist kompromitteret genaktivering sammenlignet med den påvist i ML-1-celler aktivering , med Manca celler demonstrerer mindst p53-aktivitet (figur 1 D).

Mdm2

alternativt splejsede produkter såsom

MDM2-B

stige efter DNA-skader [38-40]. For at afgøre, om

MDM2-C

udskrift blev induceret af p53, blev cellerne behandlet med etoposid analyseret af QRT-PCR for

MDM2-C

. ML-1-celler reagerede på etoposid behandling med en robust stigning i

MDM2-C

transkriptniveauer (figur S2, red bar). Kompromitteret p53-medieret aktivering af

MDM2-C

blev observeret i SJSA-1 og Manca ligner kompromitteret aktivering observeres efter

puma

(figur S2 og figur 1D) celler. Disse data viser, at p53 transkriptionsaktivitet blev kompromitteret i MDM2 over-udtrykkende celler, og deres høje basalniveauer af

MDM2-C

(især i Manca celler) var p53-uafhængig.

Validering af MDM2-C specifikt antistof

For at afgøre, om det høje niveau af

MDM2-C

udskrifter i MDM2 over-udtrykkende celler blev oversat til protein, genereret vi en MDM2-C polyklonalt antistof. Vi immuniserede kaniner med et peptid sekvens indeholdende aminosyresekvensen af ​​det humane exon 4 til 10 splice junction (figur 2A). Peptidet var meget immunogen og antistoffet blev valideret for specificitet ved hjælp

in vitro

oversatte MDM2 proteiner i hvedekim ekstrakt. Både MDM2-C, og MDM2-FL, kan oversættes

in vitro

til protein [3,41]. Tilsætningen af ​​

35S methionin i systemet aktiveret os til hurtigt påvise de specifikt mærkede MDM2 proteiner under anvendelse autoradiografi (figur 2B). Den

35S methionin mærket MDM2-C og MDM2-FL proteiner migrerede på SDS-PAGE på størrelser tidligere bestemmes (beskrevet som højere end de forudsagte størrelser på 36 kDa og 55 kDa) [41,42]. Den langsommere mobilitet af MDM2 på SDS-PAGE er tidligere blevet tilskrevet den store sure domæne i proteinet [42].

A. Skematisk af fuld længde MDM2 (MDM2-FL) og MDM2-C. De tilbageholdte proteiner ‘biokemiske funktionelle domæner er vist som farvekoder. Peptidsekvensen anvendes som et immunogen indeholdende splejsningsforbindelsen af ​​humant MDM2-C er vist. Glycin (G) og cystein (C) rester blev tilsat til N-terminalen af ​​peptidet for at lette konjugeringen til et immunoreaktivt protein, keyhole limpet hæmocyanin (KLH).

B.

35S methionin blev brugt som en radioaktivitet kilde til at mærke

i

vitro

oversatte proteiner.

I

vitro

oversættelser af pcDNA3-MDM2-FL og pcDNA3-P2mdm2-C ved hjælp af TNT koblede hvedekim ekstrakt system. Resulterende MDM2-FL og MDM2-C-protein blev elektroforesebehandlet på a10% SDS-PAGE i en 5: 1: 1 forhold. Gelen blev overført til en nitrocellulosemembran og eksponeres for film i betydelig detektion proteinprodukt MDM2-C. Hvedekim lysat uden DNA blev anvendt som en negativ kontrol.

C. Immunopræcipitering af

35S-methionin radioaktivt-mærket

i

vitro

oversatte MDM2-FL og MDM2-C-proteiner ved hjælp MDM2 C410 og præ-immune polyklonale serum antistoffer. Protein-forhold som vist i B blev anvendt i pull down assay. Prøver blev elektroforeret på en 10% SDS-PAGE-gel overført til en nitrocellulosemembran og eksponeres for film i proteinpåvisning. Dette er repræsentativt for tre uafhængige forsøg.

D.

I

vitro

oversatte protein fremstillet i kaninreticulocytlysat (RRL bane 1 og 2) blev sammenlignet med protein oversat i hvedekim ekstrakt (WGE spor 3 og 4). Disse proteiner blev påvist med enten antistof 4B11 (øverste felt) eller 2A9 (nederste panel). HRP-konjugeret anti-mus og anti-kanin blev anvendt som sekundære antistoffer.

For yderligere at validere specificiteten af ​​MDM2-C-antistof, vi gennemført en immunopræcipitation eksperiment af hvedekim ekstrakt

in vitro

oversat

35S radioaktivt mærkede MDM2-C og MDM2-FL proteinprodukter. MDM2 C410 polyklonale antistof trukket ned MDM2-C (figur 2C, sammenlign bane 3 og 8), men ikke MDM2-FL (figur 2C, sammenlign bane 4 og 9). Endvidere MDM2-C og MDM2-FL

in vitro

oversatte proteiner blev immunpræcipiteret under anvendelse af MDM2 C410 polyklonale antistof og analyseret ved Western blot med MDM2 monoklonale antistof mix. Kun MDM2-C-protein blev detekteret (figur S3, sammenlign bane 2 og 3).

For at mere grundigt behandle forskellen vandring af MDM2-C og MDM2-FL, sammenlignede vi immunreaktivitet af

in vitro

oversatte proteiner fremstillet i både kaninreticulocytlysat (RRL) og hvedekim ekstrakt (WGE) systemer. Når proteiner translateres

in vitro

, de er posttranslationelt modificeret af de faktorer, der er repræsenteret i celleekstrakten systemet. Som forudsagt, den C-terminale monoklonale antistof 4B11 detekteret MDM2-C og MDM2-FL isoformer mens antistoffet 2A9, målretning den centrale region, detekteres kun MDM2-FL (figur 2D, sammenlign øverste og nederste paneler til bane 1 og 3 versus baner 2 og 4). Interessant nok MDM2-C produceret i pattedyrs RRL systemet resulterede i høj ekspression af tre differentielt migrerende arter på SDS-PAGE-elektroforese med en form co-migrerer med MDM2-FL ved ca. 98 kDa (figur 2D, sammenlign bane 1 med bane 2 ). Gennemgået yderligere potentielle post-translationelle modifikationer af MDM2-C i humane celler (og migration af MDM2-C ved ca. 98 kDa) ved anvendelse af en HeLa

in vitro

translationssystem fra Pierce (figur 3A og 3B ). Vigtigere er det, i dette system, detekteret vi også en form for MDM2-C ved ca. 98 kDa. Vores data indikerer klart, at nogle af MDM2-C-protein isoform produceres i dette humane system co-migrerer med MDM2-FL. Således tilvejebringer bevis for, at påvisningen af ​​MDM2 af antistoffer, der kan interagere med fuld længde og splejsede varianter isoformer vil resultere i det mindste nogle co-migrerende polypeptider på en Western blot. Interessant, ved anvendelse af HeLa-system, vi for første gang, detekteret nogle MDM2-C-protein på den forudsagte molekylvægt på 36 kDa (figur 3B bane 1).

Immunopræcipitation hjælp MDM2 C410 og præ-immune polyklonale serum antistoffer med HeLa

i

vitro

oversatte MDM2-C ekstrakter bruger pre immune sera, MDM2 C410 og N-20 polyklonale antistoffer. Prøver blev underkastet elektroforese på en 10% SDS-PAGE-gel i to eksemplarer. A. Den ene halvdel blev farvet med coomassie blå for protein detektion. B. Prøver fra halvdelen af ​​gel blev overført til nitrocellulosemembran og MDM2 blev påvist med 4B11 monoklonalt antistof. HRP-konjugeret anti-muse blev anvendt som sekundært antistof. Pile skildre MDM2-C-protein.

MDM2-C protein udtrykkes endogent

Mens alternativt splejset

MDM2

meddelelser er blevet påvist i kræft, er der ingen dokumentation for endogent producerede polypeptider fra sådanne meddelelser . Vi sammenlignede co-migrerende art MDM2-C og MDM2-FL anvendelse af variable immunreaktivitet af humane cancercellelinier ekstrakter probet med MDM2 C410 polyklonalt antistof (til påvisning af MDM2-C) til de samme ekstrakter probet med MDM2 pan-reaktive mus monoklonalt 4B11 antistof (til påvisning af MDM2-C og MDM2-FL). Høje niveauer af MDM2 ekspression blev observeret i MANCA og SJSA-1 celleekstrakter med 4B11-antistof (figur 4A, bane 9 og 10). Manca celler produceret den højeste ekspression af MDM2-C når detekteret med C410 (figur 4A, bane 1). MDM2 C410 polyklonale antistof knapt detekteret MDM2-C i ML-1-celler (figur 4A, bane 3). Men det anerkendte MDM2-C-protein i celleekstrakterne fra K562-celler, som er G /T genotype celler, såvel som i SJSA-1-celler, der har en genamplifikation (figur 4A, bane 2 og 4). Ekspressionen af ​​MDM2-C i ML-1-celler og Manca celler korrelerede med den basale transkription af

MDM2

fuld længde og

MDM2-C

(sammenlign figur 1C til figur 4A). Af grunde, der forbliver uklart, en bestemt sammenhæng mellem de

MDM2

udskrifter og MDM2 proteinisoformer var ikke tydeligt for SJSA-1 celler og K562-celler. Dette kan have været på grund af forholdet mellem MDM2-FL protein til den splejsede variant, og efterfølgende E3 ubiquitin ligase-medieret nedbrydning af MDM2 proteiner, reduceret proteinstabilitet.

A. Western blot analyse af helcelleekstrakter fra: MANCA, SJSA-1, ML-1 og K562-celler. MDM2-C-protein-niveauer blev analyseret via MDM2 C410 polyklonale serumantistoffer (C410, bane 1-4) og total MDM2 blev påvist med det monoklonale 4B11 (bane 9-12 og lang eksponering for bane 12). Actin blev anvendt som en loading kontrol. Pre immune polyklonalt serum blev anvendt som en negativ kontrol. HRP-konjugeret anti-muse og anti-kanin blev anvendt som sekundære antistoffer. Dette er repræsentativt for tre uafhængige forsøg.

Bi. Manca Cellerne blev lyseret enten som helcelleekstrakter (WCE) eller i cellulært compartments- cytosoliske (CYTO) og kromatin (CHR). Proteiner blev påvist som i A. MDM2-C-protein-niveauer blev analyseret via MDM2 C410 polyklonale serumantistoffer (C410, bane 1-3) og total MDM2 blev påvist med det monoklonale 4B11 (bane 1-9 og lang eksponering for bane 9).

Bii. Tubulin og Fibrillarin blev brugt til at vise en effektiv cellulær fraktionering af ekstrakt.

C. Spinning disk konfokal mikroskopi af Manca celler. Cellerne blev fikseret, permeabiliseret og inkuberet med p53, MDM2 C410 og præ-immune polyklonale serumantistoffer. Objektglas blev inkuberet med sekundære Alexa-konjugeret gede-anti-kanin og FITC-konjugeret ged anti-mus. DAPI blev anvendt til at farve cellekernerne. Billeder blev taget ved 60X forstørrelse. Pile viser regioner af Mdm2-C-protein kernelokalisering.

Den høje ekspression af MDM2-C i Manca celler antydede, at proteinet vil være klart påviselige i cellekamrene. Vi undersøgte lokaliseringen af ​​endogent MDM2-C ved anvendelse af celle fraktioneringsmetoder (figur 4B) og roterende skive konfokal mikroskopi (figur 4C). Brug af chromatin fraktioneringsmetoder, vi har registreret MDM2-C i cytoplasmaet og på kromatin (fig. 4Bi, bane 1-3) og størstedelen af ​​MDM2 isoformer detekteres med 4B11 var i cytoplasmaet (fig. 4Bi, bane 7-9 ). Eksogent udtrykte MDM2-A og MDM2-B isoformer er tidligere blevet vist at udvise kernelokalisering [43] til trods for at de regioner, der koder for MDM2 kernelokalisering og eksport-signaler splejses ud. Tilsvarende MDM2-C, som også har disse regioner splejsede ud, lokaliseret til cytoplasmaet og kernen af ​​disse hæmatopoietiske celler (sammenlign DAPI og antistof farvede område i fig. 4CI-iii probet med C410 og Fig 4Cvi-viii probet med præimmun kaninserum). Manca celler udtrykker høje niveauer af vildtype p53-protein [14], og vi observeret nogle co-lokalisering af p53 og MDM2-C-proteiner i cytoplasmaet og kernen som angivet med gul merge farve (fig. 4CV). Mens betydningen af ​​co-lokalisering ikke umiddelbart forstået, mener vi, at det er en vigtig observation. De røde pile peger på stærk antistof farvning, der repræsenterer en konsekvent observation af protein lokaliseret til diskrete nukleare områder (fig. 4Ciii og 4CV). Da Manca hæmatopoietiske celler er små og har ikke meget cytoplasma, var det muligt at hvad syntes cytoplasmatisk var i periferien af ​​kernen. Derfor undersøgte vi MDM2-C lokalisering i brystcancer epitelceller og også observeret nukleare og cytoplasmatisk MDM2-C lokalisering (figur 5C).

A. MCF-7 og T47D-celler blev dyrket og behandlet med 10 nM østrogen (E2) i fem dage. Cellerne blev lyseret og proteiner blev analyseret via western blot. MDM2 C410 polyklonalt serum-anti-kanin-antistof blev anvendt for protein detektion. Præimmun polyklonalt serum blev anvendt til at detektere baggrundssignal. HRP-konjugeret anti-muse og anti-kanin blev anvendt som sekundære antistoffer. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Dette er repræsentativt for tre uafhængige forsøg.

Bi. MCF-7 og T47D-celler blev lyseret for hel celle eller chromatin fraktioneringstrin ekstrakter. 50 ug af prøverne blev løst ved anvendelse af 10% SDS-PAGE og MDM2 C410 polyklonale sera (bane 1 – 6) og MDM2 monoklonalt antistof, 4B11 (bane 13 – 18) blev anvendt til proteinpåvisning. Pre immun blev anvendt til at detektere baggrundssignal (bane 7 – 12). Sekundære anvendte antistoffer var samme som i A.

Bii. Tubulin og Fibrillarin blev anvendt til bestemmelse fraktionering renhed.

C. Roterende skive mikroskopi af MCF-7 og T47D-celler. Celler blev dyrket på dækglas og behandlet med 10 nM E2 i fem dage. Celler blev fikseret og inkuberet med p53-antistof og Mdm2 C410 polyklonalt antistof til protein detektion. Præimmunserum blev anvendt som en negativ kontrol for farvning. Objektglas blev inkuberet med sekundære Alexa-konjugeret gede-anti-kanin og FITC-konjugeret ged anti-mus. DAPI blev anvendt til at farve kerner. Celler blev visualiseret ved 60X forstørrelse. Pile skildrer MDM2-C lokalisering regioner.

MDM2-C stiger med østrogenbehandling og lokaliserer til særskilte punktformet foci i cytoplasmaet og kernen i ER + brystkræftceller

MDM2 er forhøjet efter østrogenbehandling af østrogen receptor positive (ER + ) brystkræftceller [36]. Endvidere

MDM2

knockdown i østrogen behandlet brystcancer celler resulterer i et fald i proliferation, hvilket giver bevis for betydningen af ​​MDM2 i brystkræft cellevækst. Den overekspression af MDM2 er forbundet med øget

MDM2

splejset variant udskrifter [3,24-28]. Derfor undersøgte vi ekspressionen af ​​MDM2-C protein i to ER + brystkræft cellelinier, MCF-7 og T47D, der besidder andre genotyper for

MDM2

SNP30

9 Hotel (T /G versus G /G henholdsvis) og

p53

(vildtype versus mutant henholdsvis). Vi observerede en svag stigning i MDM2-C-protein efter østrogenbehandling af MCF-7 og T47D-celler (figur 5A bane 2 og 4). Årsagen til forskellen i molekylvægten af ​​MDM2-C isoformer kan skyldes forskelle i post-translationelle modifikationer i helcellelysater. Den præ immune polyklonale antistof serum blev anvendt som en baggrundskontrol for MDM2 C410-antistof og resulterede i praktisk taget intet protein detektion (figur 5A bane 5-8). Derudover i T47D-celler,

MDM2-C

besked blev forøget to gange efter østrogenbehandling (data ikke vist). Vi fraktioneret cellerne og undersøgt cytoplasmatiske og chromatin fraktioner for MDM2-C-protein (fig. 5Bi for C410, kanin præ immune og monoklonalt muse-4B11 reaktivitet og fig. 5Bii for markører for fraktion renhed). Den cytoplasmatiske fraktion indeholdt ikke kromatin som viser sig ved fravær af fibrillarin farvning og hver fraktion viste nogle MDM2-CRP (Fig. 5Bi bane 2 og 5). Interessant kromatin fraktion fra MCF-7-celler viste en stærk MDM2-C-reaktive arter og mindre 4B11 reaktivt protein (fig. 5Bi, sammenlign bane 3 og 15).

For at bestemme om østrogenbehandling påvirket lokaliseringen af MDM2-C i MCF-7 og T47D-celler, vi udført immunoflouresence. MDM2-C i MCF-7 blev detekteret i et mønster af diffust og punktformig cytoplasmatiske og nukleare lokalisering før og efter østrogenbehandling (fig. 5Cii og 5Cvii). Trods meget lidt detekterbart p53 i MCF-7-celler (fig. 5Civ og 5Cix), den cytoplasmatiske p53 syntes at co-lokalisere med MDM2-C, som co-farvning blev detekteret som et gult sammenfletning signal (fig. 5cv og 5Cx ).

visualisering af MDM2-C ved immunoflouresence i T47D-celler, før og efter østrogenbehandling, viste lignende farvning til MCF-7 celler (Fig. 5Cxii og 5Cxvii). Desværre fik T47D-celler ikke demonstrere co-lokalisering af mutant p53 og MDM2-C (fig. 5Cxv og 5Cxx). Årsagen til denne forskel i co-lokalisering for MCF-7 celler og T47D-celler kan ligge i det faktum, at disse cellelinjer har vildtype versus mutant p53 proteiner hhv. Mange eksogent udtrykte MDM2 splejset isoformer vekselvirker ikke med p53 [43,44], og er kendt for at splejse ud størstedelen af ​​p53-bindende domæne [29]. Vi observerede, at T47D-celler hovedsageligt udtrykt nuklear mutant p53 (fig. 5Cxiv og 5Cxix) mens MCF-7-celler udtrykker lave niveauer af cytoplasmatisk og nuklear vildtype p53 [45].

MDM2-C er højt udtrykt i liposarkom og bryst carcinom væv

Høj MDM2 udtryk er ofte observeret i liposarkomer og er i øjeblikket bruges som en kræft diagnostisk biomarkør [46-49]. Vi var interesseret i at undersøge, om C410 antistof ville være nyttigt at undersøge MDM2-C som en liposarkom biomarkør i patientprøver. Vi anvendte immunhistokemi (IHC) for at teste for MDM2-C-ekspression i humant væv liposarkom fra humane patientprøver. For to ud af tre prøvesæt analyseret, blev positiv farvning for MDM2-C observeret (repræsentativt billede vist i figur 6A). Præ immun serum opdaget lav baggrundsfarvning og når vi undersøgte lipoma væv, blev opdaget kun lav positiv MDM2-C farvning. Vi er begyndt lignende undersøgelser ved hjælp af brystkræft væv mikro-arrays og har registreret MDM2-C i invasive duktale carcinomer (figur 6B). Ved hjælp af immunhistokemi, observerede vi en lignende farvning mønster af positive væv med MDM2 C410 og MDM2 4B11 antistof (fig. 6Bii og 6Bii), mens mus IGG ikke resulterede i væv farvning (fig. 6Biii).

A. Immunhistokemi af lipoma og liposarkom væv under anvendelse MDM2 C410 og præ-immune polyklonale serumantistoffer. Biotinyleret sekundært antistof, ABC Reagent og DAB fra Vector Labs blev anvendt. Billeder blev opnået ved 20X og 40x forstørrelse. H & E betegner hematoxylin og eosin kontrastfarvning.

A. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

Støtte Information

Figur S1.