PLoS ONE: Anti-tumor Effektivitet af Capecitabine i en gensplejset mus Model af pancreas Cancer

Abstrakt

Capecitabine (CAP) er et 5-FU pro-godkendt lægemiddel til behandling af flere kræftformer, og det er anvendes i kombination med gemcitabin (GEM) til behandling af patienter med pancreatisk adenocarcinom (PDAC). Men begrænsede prækliniske data for effekten af ​​den fælles landbrugspolitik i PDAC er tilgængelige til at understøtte brugen af ​​GEMCAP kombination i klinikken. Derfor undersøgte vi farmakokinetik og effekten af ​​den fælles landbrugspolitik som et enkelt middel først og derefter i kombination med GEM for at vurdere anvendeligheden af ​​GEMCAP terapi i klinikken. Ved hjælp af en model af spontan PDAC forekommer i Kras

G12D; p53

R172H; Pdx1-Cre (KPC) mus og subkutane allotransplantater af en KPC PDAC-afledt cellelinje (K8484), viste vi, at den fælles landbrugspolitik opnåede tumor koncentrationer (ca. 25 uM) af 5-FU i begge modeller, som et enkelt middel, og induceret overlevelse ligner GEM i KPC mus, hvilket tyder på lignende effekt.

In vitro

undersøgelser udført i K8484 celler samt i humane pancreas cellelinjer viste en additiv effekt af GEMCAP kombination men det øgede toksicitet

in vivo

og ingen gavn af en tolerabel GEMCAP kombination blev identificeret i allograft model sammenlignet med GEM alene. Vores arbejde giver præklinisk bevis for 5-FU levering til tumorer og antitumorvirkning efter oral administration CAP, der var magen til virkningerne af GEM. Ikke desto mindre, har GEMCAP kombinationen ikke forbedre det terapeutiske indeks i forhold til GEM alene. Disse data tyder på, at den fælles landbrugspolitik kunne betragtes som et alternativ til GEM i fremtiden, rationelt designede, kombineret behandlingsstrategier for fremskreden kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Courtin A, Richards FM, Bapiro TE, Bramhall JL, Neesse A, cook N, et al. (2013) Anti-Tumor Effektivitet af Capecitabine i en gensplejset mus Model af kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (6): e67330. doi: 10,1371 /journal.pone.0067330

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: Februar 6, 2013; Accepteret: 16 maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Courtin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org) via programmet Grant C96 /A8333 til DJ og via CRUK Cambridge Institute Gruppeleder finansiering til DJ og DT. Dette arbejde blev også støttet af The University of Cambridge, Li Ka Shing Foundation og ved en velgørende donation til University of Cambridge fra Hutchison-Whampoa Ltd. Arbejdet blev også støttet af midler fra NIHR Cambridge Biomedical Research Centre (www.nihr .ac.uk). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. DJ har modtaget støtte til kliniske forsøg fra Roche og har også tjent på en redaktion for Xeloda (Capecitabine) hjemmeside. Denne undersøgelse blev finansieret delvist af Hutchison-Whampoa Ltd. i form af en velgørende donation til CRUK Cambridge Institute, som bidrog til lønnen til DT. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. Alle andre forfattere erklærer, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i industrialiserede lande. Samlet fem års overlevelse er mindre end 5% [1]. Den høje grad af dødelighed af PDAC skyldes manglen på tidlig påvisning metoder og fattige effekt af eksisterende behandlinger. Gemcitabin (GEM) er standard terapi, men den mediane overlevelse er stadig kun 5-7 måneder hos patienter med fremskreden sygdom [2]. Derfor er mere effektive behandlingsstrategier kræves

Capecitabine. (Xeloda®; Hoffmann La Roche) er en oralt administreret fluorpyrimidincarbamat, metaboliseres i leveren og tumor ved carboxylesteraser og cytidindeaminase til 5′-deoxy-5-fluorcytidin (5’DFCR) og 5′-deoxy-5-fluoruridin (5′-DFUR) hhv. Det sidste trin i aktiveringen af ​​capecitabin (CAP), til omdannelse af 5′-DFUR cytotoksisk 5-fluorouracil (5-FU), medieres af thymidinphosphorylase [3] – [5], som udtrykkes mere stærkt i neoplastisk end normalt væv, hvilket gør CAP mere tumorspecifik end 5-FU [5], [6]. Anti-tumor effekt af fælles landbrugspolitik er blevet vist i adskillige undersøgelser under anvendelse af humane cancer xenograftmodeller af bryst-, tyktarms-, gastrisk, livmoderhalskræft, blære æggestokkene og prostatakræft (se gennemgang [7]), men kun én undersøgelse er rapporteret i en bugspytkirtel model [8], og dette var i en atypisk KRAS vildtype pancreascancer celle xenotransplantat. I klinikken er CAP godkendt af FDA som første linje enkeltstofbehandling hos patienter med metastatisk kolorektal cancer og metastatisk brystkræft som enkeltstof eller i kombination med docetaxel efter svigt af tidligere anthracyline kemoterapi. Hos patienter med fuldstændig resekterede pancreascancer, er det blevet vist, at kombineret intravenøs bolus af 5-fluoruracil og folinsyre (FUFA) er en aktiv adjuverende behandling og anvendelse af FUFA er ækvivalent med GEM når samlet overlevelse er endepunkt [9 ], [10]. Ved fremskreden PDAC, specielt i England, har CAP erstattet FUFA og anvendes i kombination med GEM (GEMCAP), baseret på resultaterne af meta-analyse udført af Heinemann og al. viser en beskeden, men signifikant overlevelse gavn af kombinationen af ​​GEM med fluoropyrimidin og især med den fælles landbrugspolitik [2]. En nylig klinisk undersøgelse bekræftede fordelene ved GEMCAP i uselekterede patienter med fremskreden PDAC [11].

I betragtning af de begrænsede prækliniske data ved hjælp af den fælles landbrugspolitik i PDAC,

in vivo

undersøgelser blev gennemført at evaluere CAP i en gensplejset musemodel af sygdommen. Kras

G12D; p53

R172H; Pdx1-Cre (KPC) mus konditionelt udtrykke endogene mutante Kras og p53 alleler i pancreasceller [12] og udvikle pancreas tumorer, som rekapitulere patofysiologiske aspekter og de molekylære karakteristika ved human PDAC [13]. Vi brugte også en allograft af en bugspytkirtelkræft cellelinje (K8484) isoleret fra en KPC PDAC. Farmakokinetiske og effektstudier blev udført med enkeltstof CAP og kombinationen af ​​GEM og den fælles landbrugspolitik. Undersøgelser fra litteraturen foreslået en sammenhæng mellem cytidindeaminase (CDA) enzymaktivitet og risikoen for toksicitet hos patienter, der får GEM eller CAP-baseret behandling [14], [15]. CDA er involveret i aktiveringen af ​​den fælles landbrugspolitik gennem deaminering af DFCR i DFUR men er omvendt ansvarlig for deaminering af GEM i sin inaktive metabolit dFdU [4], [5], [16], [17]. På grund af giftighed, vi observeret med GEMCAP kombinationen vi kvantificeret CDA enzymaktivitet i tumorvæv.

Materialer og metoder

Mus Stammer

KPC mus udvikler avancerede PDAC fra 2 til 3 måneder og har en forkortet median overlevelse på ca. 5 måneder [12], [18]. Deres kontrol søskende, Kras; p53

R172H; Pdx1-Cre (PC) mus blev også anvendt i dette studie at transplantere subkutant den K8484 cellelinie. Således udførtes alle forsøg under anvendelse af mus fra samme blandede 129 /SvJal /C57BL /6 genetisk baggrund. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de britiske Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 med godkendelse fra den lokale Animal etiske komité, og efter 2010 retningslinjer fra Det Forenede Kongerige koordineringsudvalg kræftforskningsinitiativ [19] de.

cellelinier

K8484 cellelinje blev etableret fra en KPC PDAC tumor ved Olive et al. [18], [20]. Celler blev dyrket i DMEM-medium (Life Technologies) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS). De humane pancreascancer cellelinier Panc-1 og MiaPaCa-2 blev opnået fra ECACC (Salisbury, UK) og dyrket i DMEM med 10% FBS. Identiteten af ​​alle menneskelige cellelinier blev verificeret ved STR genotypning og testet negativ for mycoplasma.

cytotoksicitetsanalyse

Drug cytotoksicitet

in vitro

blev vurderet ved hjælp af sulforhodamin B kolorimetrisk (SRB) assay. Celler blev udpladet i en plade med 96 og doseret med en række koncentrationer af 5-FU (0,03 uM til 30 uM) i rækker og gemcitabin (3 × 10

-4 uM til 0,3 uM) i kolonner, hvilket giver et gitter 8 × 8 koncentration kombinationer. Efter 72 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne derefter fikseret (3% trichloreddikesyre, 90 minutter, 4 ° C), vasket i vand og farvet med en 0,057% SRB (Sigma) opløsning i eddikesyre (w /v) i 30 minutter. Pladerne blev vasket (1% eddikesyre, 4 gange), og den proteinbundne farvestof blev opløst i en 10 mM Tris-base (pH 10,5). Fluorescens blev målt under anvendelse Tecan Infinite M200 plade-læser (excitation 488 nm, emission 585 nm). Den% Growth Inhibition (GI) sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol-behandlede celler blev beregnet for hver koncentration lægemiddelkombination.

Virkningen af ​​kombinationen blev vurderet ved anvendelse af Bliss Independance model [21], [22] i henhold til den protokol vi har beskrevet tidligere [23]. Kort fortalt blev en additivitet model bygget på baggrund af data enkelt agent fra 5-FU og GEM. GI-værdier opnået fra denne model blev derefter trukket fra de eksperimentelle værdier for at identificere områder af synergi og antagonisme. Negative tal viser mindre end additive effekter (gul til rød farve) og positive tal viser større end additiv effekt (grøn til blå).

Drug forberedelse

Capecitabin pulver (Sequoia Research) blev resuspenderet i en 40 mM citratpuffer og 5% gummi arabicum ved 100 mg /ml og administreret ved oral gavage. Gemcitabin hydrochlorid (Tocris Bioscience) blev opløst i saltvand ved 20 mg /ml og administreret ved intraperitoneal injektion.

farmakokinetik og effekt Studier i K8484 allograft Model

Bilaterale K8484 allotransplantater blev opnået ved subkutan injektion af 10

6 celler pr flanke. For farmakokinetiske undersøgelser blev mus med allograft tumor behandlet med en enkelt dosis af CAP på 755 mg /kg, og prøver blev opsamlet 10 min, 20 min, 40 min, 1 time, 2 timer og 4 timer efter, tre dyr pr tidspunkt. Blod blev opsamlet i lithiumheparin, og plasma isoleret og opbevaret ved -80 ° C. Lever og tumorer blev fjernet og snap-frosset i flydende kvælstof.

I effekt CAP studier blev mus behandlet med CAP på 755 mg /kg eller køretøjer i 5 på hinanden følgende dage om ugen i 3 uger. I GEMCAP kombination effektstudie, mus fik gemcitabin doser på 75 mg /kg, hver 3 dage alene eller i kombination med orale doser fælles landbrugspolitik på 539 mg /kg givet 5 dage om ugen. Tumorer blev målt ved hjælp af skydelærer. Tumor volumen blev beregnet som længde × bredde

2 × π /6.

Effekt og overlevelse Study i KPC Mouse Model

indskrivning af KPC mus i undersøgelsen var baseret på tumorstørrelse, målt ved ultralyd i en aksial retning. Mus med gennemsnitlige PDAC tumor diameter på 6-9 mm blev inkluderet. På kort sigt effektstudie blev mus behandlet med CAP på 755 mg /kg eller køretøjer i 7 på hinanden følgende dage. Under behandlingen blev mus afbildet to gange ved høj opløsning ultralydsbilleddannelse under anvendelse af Vevo 770 System (Visual Sonics, Inc.) [24] og tumorvolumener blev kvantificeret [18]. På dag 7 blev mus dræbt 2 timer efter dosis af den fælles landbrugspolitik. Plasma, tumor og lever blev opsamlet som ovenfor. For overlevelse studie blev mus tilmeldt, og filmede hver 3 dage, mens behandling med CAP på 755 mg /kg i 5 på hinanden følgende dage om ugen eller med GEM på 100 mg /kg hver 3 dage, indtil de endpoint kriterier blev nået. Disse omfattede udvikling af abdominale ascites, svær kakeksi, signifikant vægttab (nærmer 20%) af den oprindelige vægt eller ekstrem svaghed eller inaktivitet.

Immunhistokemi

formalinfikserede, paraffin vævssnit var farvet under anvendelse phospho-histon H3-antistof (Upstate, # 06-570) og påvist under anvendelse af DAB peroxidasesubstrat (Vector Labs). Farvning blev afbildet og kvantificeret under anvendelse af ARIOL systemet (Leica Microsystems). Mindst 3 felter pr tumor blev kvantificeret. PH3 positive celler blev defineret som dem, der har en positiv farvning kondenseret kromatin.

GEMCAP Kombination Tolerance Studies

PC mus med K8484 celle allotransplantater blev behandlet med GEM ved 100 mg /kg eller 75 mg /kg hver 3 dage alene eller i kombination med den fælles landbrugspolitik på 755 mg /kg eller 539 mg /kg eller 378 mg /kg, 5 på hinanden følgende dage om ugen, og blev dræbt, hvis kliniske tegn nærmede de tilladte grænser (som omfattede diarré, blødning og vægttab nærmer 20%). To dyr pr dosis blev anvendt. Tumor respons blev vurderet ved daglig måling af tumorerne med skydelærer.

Bestemmelse af Capecitabine og metabolitkoncentrationer i plasma, lever og Tumorer

CAP, DFCR, DFUR og 5FU blev bestemt både i plasma og væv under anvendelse af en modificeret version af protokollen tidligere offentliggjorte [25]. Kort fortalt blev vævsprøverne homogeniseret under anvendelse af en Precellys 24 homogenisator med lille kuglelejer (Kit Precellys MK28-R) i 2 x 50 sekunder ved 6 000 rpm i iskold 50:50 acetonitril: vand (volumen /volumen) indeholdende 25 ug /ml tetrahydrouridin (Promega) for at gøre en slutkoncentration på 50 mg væv pr ml. Halvtreds pi af homogenat blev overført til et rent rør prespiked med 200 pi iskold acetonitril indeholdende 50 ng /ml stabile mærket (SIL) interne standarder af alle 4 analytter (Toronto Research Chemicals). Efter centrifugering ved 20.000 g i 5 minutter supernatanten blev inddampet til tørhed, resuspenderet i 100 pi vand og injiceret på LC-MS /MS. For plasmaprøver blev 50 pi plasma udfældet med 150 pi acetonitril indeholdende 50 ng /ml stabile mærkede interne standarder og behandles på lignende måde.

Påvisning blev opnået ved LC-MS /MS under anvendelse af en Thermo TSQ Vantage massespektrometer med en Hesi-II-probe anvendes i positiv og negativ modus ved en spray spænding på 3 kV og fordamper temperatur på 325 ° C. Påvisning af ionerne blev udført i det multiple reaktion monitoreringsfunktion specifikke for hver forbindelse. Koncentrationer af capecitabin og metabolitter i prøver blev bestemt ved sammenligning med kalibrering linjer konstrueret ved hjælp af autentiske referencestandarder.

CDA Enzyme Activity

For at forberede rå enzym matrix, blev tumorvæv homogeniseret i 500 uL 0,1 M Tris-HCI pH 8 buffer i 2 × 50 sekunder ved 6000 rpm ved anvendelse af en Precelly homogenisator. Tumor lysater blev derefter centrifugeret i 10 min ved 14500 rpm ved 4 ° C, supernatanterne dekanteret og proteinindholdet blev målt ved anvendelse af DC-BIORAD proteinassay.

I CDA enzymaktivitetsassay, GEM stamopløsninger blev fremstillet i vand. For hver reaktion blev 20 pi tumor enzymekstrakt blandet med 170 pi 0,1 M Tris-HCI, 50 mM β-mercaptoethanol og 10 pi af den passende gemcitabin stamopløsning for at fremstille endelige GEM substratkoncentrationer på 50 uM til 5000 uM. Prøver blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter blev reaktionen standset ved tilsætning af 600 pi acetonitril og 50 pi intern standard dFdU-

13C,

15N

2 blev tilsat til hver prøve. Den samme protokol blev anvendt til fremstilling af en dFdU standardkurve i intervallet fra 2,5 ng /ml til 5000 ng /ml samt høj (3500 ng /ml), medium (200 ng /ml) og lav (37,5 ng /ml) kvalitetskontrol dFdU standarder.

Alle prøver blev blandet og centrifugeret ved 5000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. 200 pi supernatant blev overført i en 96 brønds plade og inddampet til tørhed. Prøverne blev derefter rekonstitueret i 200 uL vand, hvirvlet i 5 minutter, og dFdU blev kvantificeret ved LC-MS /MS og normaliseret til den samlede koncentration protein.

in vitro

konkurrence assay var udført på et enzym ekstrakt fra en ubehandlet allograft tumor under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor. Enzymet ekstrakt blev blandet med en fast koncentration på 1800 pM GEM, svarende til Km af CDA i dette enzym ekstrakt, og spænder doser af DFCR (0 til 1200 uM) som konkurrent. Den dFdU konverteret fra GEM blev kvantificeret ved LC-MS /MS.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.0. Betydningen af ​​forskellene i CAP anti-tumor effekt, CDA Vmax og Km for CAP versus køretøjet blev bestemt ved anvendelse af en uparret t-test. I tolerance og GEMCAP kombinationsstudier blev forskel i tumor vækster analyseret ved hjælp af en envejs ANOVA efterfulgt af en Newman-Keuls multiple sammenligninger post-test.

Resultater

farmakokinetik og farmakodynamik af den fælles landbrugspolitik og dens metabolitter i mus Væv

for at undersøge farmakokinetikken af ​​den fælles landbrugspolitik og dets metabolitter, vi analyseret ved massespektrometri de homogenater af plasma, tumor og lever fra mus med K8484 allograft tumor indsamlet på forskellige tidspunkter efter en enkelt dosis af den fælles landbrugspolitik gives oralt ved 755 mg /kg (2,1 mmol /kg /dag). Denne dosis er den humane ækvivalent dosis, bestemt ifølge fremgangsmåden ifølge Reagan-Shaw et al [26]. CAP, DFCR og DFUR blev fundet i 3 væv ved hvert tidspunkt (figur 1). Plasma C

max for DFCR var 393 ± 27 pM (20 min) og for DFUR 125 ± 90 pM (40 minutter) (figur 1A). I tumorvæv, DFCR og DFUR C

var max 256 ± 7 uM og 101 ± 7 uM henholdsvis 45 min efter administration af den fælles landbrugspolitik og faldt til 64,4 ± 45,3 uM og 46,4 ± 28,1 uM efter 4 h (Figur 1B). I leveren, blev C

max for alle de metabolitter nåede 10 min efter dosering og faldt derefter gradvist (figur 1C). Koncentrationerne af leveren DFCR var højere end i tumor fra de samme mus og leveren DFUR koncentrationerne var lavere, i overensstemmelse med de tidligere rapporterede distributioner af CES og CDA i væv [5]. Intra-tumorale koncentrationer af 5-FU forøges progressivt fra 12,7 ± 3,7 pM efter 10 min til 49,5 uM efter 1 time og faldt til 10,7 ± 3,4 pM efter 4 timer (figur 1b). Som vores

in vitro

eksperimenter på K8484 celler viste en IC

50 for 5-FU af 2,56 ± 0,55 uM (data ikke vist), disse

in vivo

resultater tyder på, at en mundtlig dosering CAP leverer en terapeutisk effektiv dosis til allotransplantat tumorer. 5-FU-niveauer var over 30 gange lavere i plasma (1,9 ± 0,5 pM ved 40 min og 0,3 ± 0,2 uM efter 4 timer) end i tumor og var under grænsen for kvantificering i leveren fra 2 timer (Figur 1C). En farmakodynamisk undersøgelse blev også udført for at bestemme virkningen af ​​en enkelt 755 mg /kg dosis CAP på proliferation i K8484 allotransplantat tumorer. Tumorer blev opsamlet 40 minutter, 2 timer og 4 timer efter dosering og immunhistokemi for phospho-histon H3 (PH3) blev kvantificeret. PH3 farvning blev signifikant reduceret 4 timer efter dosering (P 0,01; figur 1 D). Sammenlignet med kontrol, afslører en formindskelse i mitotisk celleantal efter behandling CAP

metabolitkoncentrationer i plasma (A), K8484 allograft tumor homogenater (B) og leverhomogenater (C) efter en enkelt dosis af CAP på 755 mg /kg. Middelværdi ± SD (n = 3, undtagen i 45 minutter og 1 time, hvor n = 2). (D) Immunhistokemi for phospho-histon H3 (PH3) kvantificeret i KPC allotransplantat tumorer på forskellige tidspunkter efter en enkelt 755 mg /kg dosis CAP. Middelværdi ± SEM af mindst tre tumorer (** p 0,01). (E) metabolitkoncentrationer i KPC musevæv 2 timer efter den sidste af 7 på hinanden følgende doser af dækslet 755 mg /kg, gennemsnit og SEM for 6 mus. (F) 5-FU-koncentrationer 2 timer efter en enkelt dosis (fuldt optrukket linie) eller fem på hinanden følgende doser (stiplet linje) af den fælles landbrugspolitik (755 mg /kg) givet til mus med K8484 allotransplantat tumorer.

Det er tidligere blevet vist, at

in situ

KPC PDAC tumorer er mindre følsomme over for GEM end KPC allotransplantater på trods af deres identiske

Kras

p53

genotyper, og denne forskel i følsomhed blev tilskrevet begrænset lægemiddeltilførsel til KPC tumorer [18]. Derfor analyserede vi mængden af ​​CAP og metabolitter i væv fra KPC tumorbærende mus efter syv dages behandling CAP (755 mg /kg). I plasma og lever CAP, DFCR, DFUR og 5-FU-koncentrationer var sammenlignelige mellem KPC mus og allotransplantat værter 2 timer efter den sidste dosis (figur 1E). I KPC PDAC tumorer, 5-FU-koncentrationer var 26,9 ± 14,3 pM (figur 1E) sammenlignet med 23,0 ± 8,1 pM i KPC allotransplantat tumorer, 2 timer efter en enkelt dosis CAP (figur 1B). På grund af forskellen i studie protokol (7 doser i KPC mus versus enkelt dosis i K8484 allotransplantater), vi sammenlignet også data med dem fra en uafhængig PK undersøgelse udført efter 5 daglige doser af den fælles landbrugspolitik administreret i mus med K8484 allotransplantater. I denne undersøgelse 5-FU-koncentrationer i tumor 2 timer efter den femte træk dosis af CAP var 22,7 ± 7,7 pM (figur 1F), svarende til 5-FU-koncentration efter en enkelt dosis i allograft tumor (figur 1B) eller efter 7 på hinanden følgende doser i KPC tumorer (figur 1E). Disse data tyder på, at flere doser af den fælles landbrugspolitik ikke førte til 5-FU ophobning i tumor. Disse resultater viser, at oral CAP leverede et tilsvarende beløb af 5-FU til

in situ

PDAC tumorer og de allotransplantat tumorer.

CAP Anti-tumor effekt i bugspytkirtlen Tumorer

Vi først undersøgte effekten af ​​den fælles landbrugspolitik på væksten af ​​K8484 allotransplantat tumorer. Mus blev doseret med bærer eller CAP på 755 mg /kg i 5 dage om ugen. Efter 3 uger vehikel-behandlede mus udviste en gennemsnitlig tumorvolumen 1840 ± 201 mm

3 sammenlignet med 629 ± 86 mm

3 i CAP-behandlede mus (figur 2A), med en betydelig stigning i tumor fordoblingstid fra 3,5 ± 0,5 dage i køretøj til 7,5 ± 3,0 dage i CAP-behandlede mus (p = 0,0002, Figur 2B).

(A) Capecitabin effekt hos mus med K8484 allotransplantat tumorer. Dyrene modtog 755 mg /kg dagligt i 5 på hinanden følgende dage om ugen i 3 uger. Tumor volumener er repræsenteret som gennemsnittet ± SEM for 12 køretøj og og 13 CAP-behandlede mus (** p 0,01). (B) Tumoren fordoblingstid for hver tumor (*** p 0,001).

Vi fortsatte derefter til en kortsigtet effektstudie i

in situ

KPC PDAC model . KPC mus blev behandlet med CAP på 755 mg /kg i 7 på hinanden følgende dage og tumorvolumener blev overvåget to gange om ugen ved 3D ultrasonografi. Tumorvækst blev reduceret i Cap-behandlede KPC-mus sammenlignet med vehikelbehandlede mus (figur 3A). Volumenet af Cap- behandlede tumorer var 121 ± 10,2% i forhold til 199 ± 21,8% i kontrol (p 0,01, figur 3B). Tumor væv blev samlet 2 timer efter den sidste dosis af den fælles landbrugspolitik. PH3 farvning afslørede færre celler i mitose i CAP-behandlede tumorer i forhold til kontrol (p 0,05; figur 3C), hvilket tyder på vækst anholdelse

(A) Kortsigtet capecitabin effektstudie i KPC mus med

i. situ

PDAC, doseret med 755 mg /kg i 7 på hinanden følgende dage. Tumor mængder for køretøjet og CAP blev målt ved ultralyd og normaliseret til tumorvolumen ved dagen for indskrivningen i undersøgelsen (middelværdi ± SEM, n = 6 pr gruppe). (B) Tumor volumen ved endepunktet i procent af volumenet i begyndelsen, i KPC mus behandlet med vehikel eller CAP (middelværdi ± SEM, n = 6 i hver gruppe; ** p 0,01). (C) Immunhistokemi for phospho-histon H3 blev kvantificeret i PDAC tumorer 2 timer efter 7

th og sidste dosis af CAP 755 mg /kg. Resultaterne udtrykkes som middelværdien ± SEM (n = 6 pr gruppe; * p = 0,027).

Effekten af ​​CAP Administration på KPC Mus overlevelse sammenlignet med GEM

Vores farmakokinetiske data viste effektiv 5-FU levering og virknings- CAP undersøgelsesdata kortsigtede førte os til at sammenligne CAP til GEM i en længerevarende undersøgelse, hjælp overlevelse som endepunkt. KPC mus blev behandlet enten med CAP på 755 mg /kg i 5 dage om ugen eller med 100 mg /kg GEM hver 3 dage. Resultater identificeret at overlevelse var ens i de 2 grupper; median overlevelse 8 og 10,5 dage for den fælles landbrugspolitik og GEM henholdsvis P = 0,61 (figur 4A). Den længste overlevelse var 67 dage i gruppen af ​​den fælles landbrugspolitik i forhold til 26 dage i GEM gruppen. Desuden var der ingen forskel i tumorvækst mellem Cap- og perle-behandlede grupper (figur 4B), hvilket tyder på lignende effekt af GEM og fælles landbrugspolitik i PDA

(A):. Kaplan-Meier-kurver for capecitabin (skraveret ) og gemcitabin (fast stof) overlevelse. P = 0,61 Log-Rank test, Hazard Ratio = 0,78, 95% CI 0,29-2,06 (n = 10 pr gruppe). (B): Individuelle vækstkurver for Cap- (sort) og GEM-behandlede tumorer (rød). Mængder blev normaliseret til lydstyrken på dagen for indskrivning i overlevelse studiet.

Effekt af GEMCAP Kombination

Dernæst kombinationen af ​​GEMCAP blev undersøgt. For at vælge de passende doser, vi først undersøgt tolerabiliteten af ​​kombinationen i mus, der bærer K8484 allotransplantater. Mus blev behandlet med GEM ved 100 mg /kg hver 3. dag alene eller i kombination med CAP givet 5 dage om ugen på 755 mg /kg, 539 mg /kg eller 378 mg /kg. Alle tre kombinationer ved hjælp af fuld dosis GEM induceret markeret gastrointestinal toksicitet angivet med mus vægttab og histologi af musen tyndtarmen: forkortet villi med forstyrret arkitektur og krypt tab (Supplerende figur S1 D, F). Hverken CAP 755 mg /kg eller GEM 100 mg /kg alene viste nogen gastrointestinal toksicitet (figur S1, A – C) Derfor har vi gentog eksperimentet med de samme doser fælles landbrugspolitik kombineret med reduceret GEM dosis (75 mg /kg). Kombinationen gruppen behandlet med 755 mg /kg CAP viste tidligt toksicitet, bekræftes af tyndtarmen histologi (figur S1, G). Kombinationen med 539 mg /kg CAP (71% af fuld dosis) udviste ingen tegn på toksicitet over to cyklusser af behandlingen (11 dage). Baseret på disse resultater, vi derfor anvendt de sikrere doser på 539 mg /kg CAP og 75 mg /kg GEM for at studere effekten af ​​GEMCAP kombination i mus med K8484 allografter. Efter 3 uger GEM reduceret signifikant tumorvækst (p 0,001) sammenlignet med vehikel, som gjorde CAP alene (p 0,05) (figur 5). Forskellen observeret mellem GEM og CAP alene var ikke signifikant (P 0,05). Den GEMCAP kombination inhiberede signifikant tumorvækst med tumor fordoblingstid på 8,6 ± 10,8 dage (sammenlignet med 2,7 ± 0,9 dage i kontrol) men dette var ikke bedre end GEM alene (tumor fordoblingstid på 7,2 ± 2,8 dage) og ikke signifikant forskellig fra CAP alene. Under 3

rd uges behandling mus behandlet med GEMCAP kombination begyndte at vise toksicitet (vægttab), sammenlignet med enkelt middel behandlede mus, men intestinal histologi ved endepunktet forekom normale (fig S1, H og I).

GEMCAP kombination effekt hos mus med KPC allotransplantat tumorer. Dyr modtog vehikel eller GEM hver 3 dage ved 75 mg /kg eller CAP på 539 mg /kg, 5 dage om ugen eller en kombination af disse to doser. Tumor volumener er repræsenteret som middelværdien ± SEM (n = 5 pr gruppe; * p 0,05, *** p 0,001 sammenlignet med køretøjet ns: ikke signifikant).

Disse data, udviste mangel på synergi af kombinationen, er i overensstemmelse med dem fra

in vitro

cytotoksicitetsassays vi udført på K8484 celler og humane pankreas cellelinier (MiaPaCa-2 og Panc-1) doseret med en række 5- FU og GEM kombinationer, hvor additive, men ikke synergistiske virkninger blev observeret (figur S2). Tilsammen viste vores resultater additiv cytotoksisk effekt

in vitro

men også additive toksicitet

in vivo

. Derfor er GEMCAP ikke føre til bedre terapeutisk indeks i mus sammenlignet med GEM alene.

Vi derefter undersøgte tumor CDA aktivitet. Brug PERLE som substrat, vi bestemt omregningskursen for GEM i dFdU og de kinetiske konstanter for CDA, Vmax og Km, i køretøj og og den fælles landbrugspolitik-behandlet allotransplantat tumorer (figur 6). Resultater viste reduceret Vmax og Km i CAP-behandlede tumorer (15,1 ± 2,6 nmol /h /mg protein og 1320 ± 147 pM) sammenlignet med ubehandlede tumorer (56,3 ± 7,2 nmol /h /mg protein og 1880 ± 82 uM henholdsvis; figur 6C og 6D) tyder på, at gemcitabin metaboliserende kapacitet CDA blev nedsat i transplanterede PDAC tumorer under behandling fælles landbrugspolitik. Som tumorerne blev opsamlet mellem 2 timer og 4 timer efter den sidste dosis af CAP, spekulerede vi hvis den reducerede aktivitet skyldtes konkurrence mellem det tilsatte GEM substrat og DFCR allerede i tumorerne. Vi udførte derfor et

in vitro

konkurrence-assay under anvendelse af enzymet ekstrakt fra en ubehandlet allograft tumor, en fast GEM koncentration på 1800 pM svarende til Km af CDA i enzymet ekstrakt og DFCR koncentrationer i området fra 0 til 1200 uM . Resultater, præsenteret i figur 6E viste minimale ændringer i omregningskursen for GEM i dFdU selv i nærværelse af den højeste koncentration af DFCR. LC-MS /MS-analyser af CAP-behandlede tumorer viste, at de højeste DFCR koncentrationer var 511 uM, inden det testede i denne konkurrence analyseområdet, støtte, at den observerede nedgang i CDA aktivitet i CAP-behandlede tumorer ikke var relateret til et substrat konkurrence. Dette antyder, at behandling CAP kan nedregulering CDA aktivitet.

CDA enzymaktivitet blev bestemt i ubehandlede (A) og Cap-behandlede (B) KPC allotransplantat tumorer under anvendelse GEM som substrat. Omregningskursen for GEM i dFdU blev målt i homogenater fra individuelle tumorer i slutningen af ​​effekten CAP undersøgelse præsenteret i figur 2, og de kinetiske konstanter Vmax (C) og Km (D) blev bestemt (n = 10 pr gruppe; * * p 0,01, *** p 0,001). (E)

In vitro

konkurrence-assay udført på enzymet ekstrakt fra en ubehandlet allograft tumor. En fast GEM koncentration på 1800 pM svarende til Km af CDA i enzymekstrakt og DFCR koncentrationer i området fra 0 til 1200 uM blev anvendt.

På grund af den

in vivo

toksicitet og manglen på forbedret effekt af GEMCAP sammenlignet med GEM alene i allotransplantater, vi ikke teste GEMCAP i KPC PDAC mus, hvis helbred er mindre robust.

diskussion

undersøgelserne præsenteres her giver for første gang, prækliniske data om farmakokinetik og effekt af capecitabin i en gensplejset musemodel af PDAC. Vi brugte Kras

G12D; Trp53

R172H; Pdx1-Cre musemodel [12], fordi det rekapitulerer det kliniske syndrom og histopatologi af den humane sygdom. Vores farmakokinetiske data viste, at efter oral indgivelse, CAP undergår omfattende metabolisme i plasma, lever og tumor. Koncentrationer af den fælles landbrugspolitik metabolitter i hvert af disse rum er i overensstemmelse med dem, der findes i et menneske tyktarmskræft xenograft [27]. De er også i overensstemmelse med den tidligere rapporterede fordeling af de involverede i stofskiftet af den fælles landbrugspolitik i human og mus enzymer [5], [27]. 5-FU blev fundet ved højere niveauer i tumorvæv end i plasma fra 30 minutter efter administration og var upåviselig i leveren bekræfter tumor selektiv levering af 5-FU efter indgift CAP også beskrevet af Ishikawa et al. [6]. Den lave 5-FU i plasma og lever kan forklare den lave toksicitet af den fælles landbrugspolitik ved en dosis på 755 mg /kg: ingen af ​​mus viste tegn på toksicitet på grund af den fælles landbrugspolitik behandling alene.