PLoS ONE: Afvigende Gene Promoter methylering associeret med sporadisk Multiple Colorectal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal cancer (CRC) mangfoldighed er hovedsageligt relateret til polypose og ikke-polypose arvelige syndromer. I sporadisk CRC har afvigende gen promoter methylering vist sig at spille en central rolle i carcinogenese, selvom lidt om sit engagement i mangfoldighed. For at vurdere effekten af ​​methylering i tumor mangfoldigheden i sporadisk CRC blev hypermethylering af centrale tumorsuppressorgener evalueret hos patienter med både flere og ensomme tumorer, som proof-of-concept af en underliggende epigenetisk defekt.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgte i alt 47 synkron /metachronous primære CRC fra 41 patienter, og 41 køn, alder (5-års intervaller) og tumor lokationsbaserede parrede patienter med ensomme tumorer. Eksklusionskriterier var polypose syndromer, Lynch syndrom og inflammatorisk tarmsygdom. DNA methylering ved promotor region af

MGMT

,

CDKN2A

, S

FRP1

,

TMEFF2

,

HS3ST2 (3OST2)

,

RASSF1A

GATA4

gener blev evalueret ved kvantitativ methylering specifik PCR i både tumor og tilsvarende normalt udseende kolorektale slimhinde prøver. Samlet, patienter med flere læsioner udviste en højere grad af methylering i tumorprøver end dem med ensomme tumorer vedrørende alle evaluerede gener. Efter justering for alder og køn, binomial logistisk regressionsanalyse identificeret methylering af

MGMT2

(OR, 1,48; 95% CI, 1,10-1,97; p = 0,008) og

RASSF1A

(OR, 2,04 ; 95% CI 1,01 til 4,13; p = 0,047) som variable uafhængigt associeret med tumor mangfoldigheden, er den risiko forbundet med methylering af nogen af ​​disse to gener 4,57 (95% CI, 1,53-13,61; p = 0,006). Desuden er der i seks patienter, hvor begge tumorer var tilgængelige, fandt vi en sammenhæng i methylering niveauer af

MGMT2

(r = 0,64, p = 0,17),

SFRP1

(r = 0,83, 0,06),

HPP1

(r = 0,64, p = 0,17),

3OST2

(r = 0,83, p = 0,06) og

GATA4

(r = 0,6, p = 0,24). Methylering i normalt udseende kolorektal slimhinde fra patienter med multipel og ensom CRC viste ingen relevant forskel i enhver evalueret gen.

Konklusioner

Disse resultater giver et proof-of-concept, at gen-promoter methylering er forbundet med tumor mangfoldigheden. Denne underliggende epigenetisk defekt kan have bemærkelsesværdige konsekvenser i forebyggelse af patienter med sporadisk CRC

Henvisning:. Gonzalo V, Lozano JJ, Muñoz J, Balaguer F, Pellisé M, de Miguel CR, et al. (2010) Afvigende Gene Promoter methylering associeret med sporadisk Multiple kolorektal cancer. PLoS ONE 5 (1): e8777. doi: 10,1371 /journal.pone.0008777

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: September 20, 2009; Accepteret: December 23, 2009; Udgivet: 19 Jan 2010

Copyright: © 2010 Gonzalo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 07-64.873), Fondo de Investigación Sanitaria (PI061384 og PI080024), Asociación Española Contra el cancer (Fundación Científica og Junta de Barcelona), Fundación Investigación Médica Mutua Madrileña (PI040296) , Fundación Olga Torres (PI040212), og Acción en Cancer (Instituto de Salud Carlos III). Victoria Gonzalo blev støttet af en bevilling fra Hospital Clinic, Cristina Rodriguez af en bevilling fra Olympus Medical Systems-Europe, Mireya Jimeno af en bevilling fra Instituto de Salud Carlos III (PI016017), Francesc Balaguer af en bevilling fra Fundación Alfonso Martín Escudero , og Sergi Castellvi-Bel af en kontrakt fra Fondo de Investigación Sanitaria (CP 03-0070). Centro de Investigación BioMedica en Red en el Área Tematica de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd) er finansieret af Instituto de Salud Carlos III. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Cristina Rodriguez var en forskning sygeplejerske finansieret af en bevilling fra Olympus Medical Systems-Europe. Den bidragyder blev dog ikke involveret i undersøgelsen design; indsamling, analyse og fortolkning af data; skrivning af papiret; heller beslutning om at indsende til offentliggørelse.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en relevant problem for folkesundheden, da den repræsenterer den anden mest almindelige ondartet svulst, og også den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i vestlige lande. Nedarvning er den underliggende årsag i op til en tredjedel af alle CRC tilfælde med meget penetrerende og veldefinerede arvelige sygdomme, dvs. adenomatøs og hamartomatous polypose og Lynch syndrom, svarende 3-5% af det samlede CRC byrde [1]. Under sådanne forhold, tilstedeværelsen af ​​en kimlinie mutation i den sygdomsfremkaldende gen (dvs.

APC

,

MYH

,

LKB1

,

Smad4

,

BMPR1A

,

PTEN

,

MLH1

,

MSH2

,

MSH6

PMS2

) [1], [ ,,,0],2], disponerer disse personer for udviklingen af ​​flere kolorektale neoplasmer. Faktisk mens familiær adenomatøs polypose repræsenterer paradigme tumor mangfoldigheden, tilstedeværelse af enten synkron eller metachronous CRC er også en af ​​de mest almindelige kliniske kriterier for mistanke Lynch-syndrom [3].

Udover de ovenfor nævnte arvelige betingelser , tumor mangfoldigheden er også en hyppig observation hos patienter med CRC, der ikke tilsyneladende er prædisponeret for sådanne neoplasmer på grundlag af deres genetiske baggrund. Faktisk er synkrone og metachronous kolorektale adenomer rapporteret hos op til 30% og 48% af patienter med sporadisk CRC, hvorimod de tilsvarende tal for carcinom er 4% og 9% [4], [5]. I denne indstilling, tydeligt familiær cancer sammenlægning eller karakteristiske personlige egenskaber er ikke åbent skelnes, og selv om der kan mistænkes en generaliseret cellulær eller molekylær uorden i hele kolorektal slimhinde, den underliggende patogene mekanisme stadig undvigende.

Et felt effekt underliggende colorektal carcinogenese er en velkendt situation i patienter med inflammatorisk tarmsygdom, en præmalign tilstand med en øget kumulative risiko for at udvikle CRC forbundet med tidlig alder for indtræden, sygdomsvarighed, og omfanget og sværhedsgraden af ​​inflammation [6], [7]. Den præcise mekanisme, hvorved kronisk colon slimhindebetændelse forårsager malignitet i denne sammenhæng er dårligt forstået, selv om det er meningen at være relateret til en fejl i reguleringsmekanismer under celledeling. Kronisk inflammation fører til frigivelsen af ​​frie radikaler fra leukocytter og makrofager, og disse reaktive oxygenspecies kan køre carcinogenese ved at forårsage DNA-beskadigelse [8]. Da der i de fleste tilfælde DNA-beskadigelse fører til inaktivering af tumorsuppressorgener, kan begrebet “field effect” bedre betegnes “field defekt”. Formodede inddragelse af et sådant felt defekt i sporadisk CRC har imidlertid ikke tilstrækkeligt bevist hidtil.

Sporadisk CRC opstår som følge af akkumulering af genetiske og epigenetiske ændringer, der omdanner colon epitelceller i colonadenocarcinom celler [9]. Tabet af genomisk stabilitet og deraf genændringer er vigtige molekylære patogene skridt, der opstår tidligt i tumorigenese: de tillader køb af et tilstrækkeligt antal ændringer i tumorsuppressorgener og onkogener, der omdanner celler og fremme tumor progression. Analogt til genomisk ustabilitet, epigenetiske ustabilitet resulterer i afvigende methylering af tumorsuppressorgener [9]. Faktisk har epigenetisk tumorsuppressorgen inaktivering almindeligvis været involveret i alle typer af humane tumorer, herunder CRC [10]. Afvigende cytosin methylering spiller en fremtrædende rolle i celle transformation, når det påvirker gener, der beskytter genom ustabilitet. kan også påvises Denne epigenetiske forandring i forstadier til kræft og tilsyneladende normale peritumor væv [11], [12], [13], [14], [15], hvilket tyder på potentiel involvering i den indledende carcinogene proces. Denne formodede felt defekt forbundet med genpromotor hypermethylering i normalt udseende kolorektal slimhinde er blevet foreslået med hensyn til

MGMT

genet [12], samt

ERa

,

MyoD

,

P16 (INK4a)

,

MLH1

,

TIMP3

og

DAPK

[13].

i betragtning af at hypermethylering af promotorregioner i tumorsuppressorgener kunne observeres i normalt udseende kolorektal slimhinde, vi hypotese, at dette fænomen ville være særligt relevant i patienter, som udviklede flere CRC. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at evaluere methylering mønstre af gener involveret i kolorektal carcinogenese gennem denne mekanisme i både tumorvæv og normalt udseende kolorektal mucosa prøver af patienter med multipel og ensom CRC, som proof-of-concept af en formodet underliggende epigenetisk defekt forbundet med tumor mangfoldigheden.

Materialer og metoder

patienter

Vi undersøgte i alt 47 synkron /metachronous primære CRC fra 41 patienter (36 synkrone, 4 metachronous og den ene begge) og 41 køn, alder (5-års intervaller) og tumor placering-parret patienter med solitære tumorer. Kontrol patienter med ensomme tumorer blev rekrutteret i EPICOLON projekt, et prospektivt, multicenter, landsdækkende, populationsbaseret kohorte (n = 1222) [16] og tilfældigt udvalgt blandt dem, der ikke tidligere CRC og med et minimum opfølgning af fem år efter diagnosen kræft, hvor regelmæssig koloskopi overvågning ikke identificere nogen ekstra læsion. Med hensyn til patienter med multipel CRC blev 31 også rekrutteret i EPICOLON projektet og 10 yderligere patienter ved Endoskopi enhed Hospital Clinic i Barcelona mellem juni 2007 og maj 2008. Der var ingen forskelle med hensyn til de klinisk-patologiske karakteristika begge sæt patienter med adskillige læsioner (data ikke vist). Eksklusionskriterier for den foreliggende undersøgelse var kolorektale polypose syndromer, Lynch-syndrom og personlige historie af inflammatorisk tarmsygdom. Demografiske, kliniske og tumor-relaterede karakteristika af patienter inkluderet i undersøgelsen er sammenfattet i tabel 1. Undersøgelsen blev godkendt af institutionelle etiske komité for hver deltagende sygehus, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Medlemmer af EPICOLON projektet er anført i note S1.

Frosne tumor og tilsvarende normalt udseende, peritumor kolorektale mucosa væv blev opnået enten ved operation eller endoskopi fra alle patienter, og straks opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse. Hos patienter med multiple læsioner blev vævsprøve opnået fra mindst en tumor (den mest avancerede ene eller den største når flere tumorer havde samme tumor fase).

DNA Isolation og bisulfitbehandling

frosne prøver blev optøet og genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Bisulfitbehandling blev udført på genomisk DNA under anvendelse af EZ DNA-methylering-Gold Kit® (Zymo Research, Orange, CA) ifølge fabrikantens protokol med mindre modifikationer beskrevet nedenfor [17]. Denne procedure integreret DNA denaturering og bisulfit omdannelse til et-trins, under anvendelse temperatur denaturering at erstatte kemisk denaturering med natriumhydroxid, og den var baseret på en tre-trins reaktionsproces mellem cytosin og natriumbisulfit, der konverterer ikke-methylerede cytosiner i uraciler. En mængde på 250 ng af genomisk DNA isoleret fra hver tumor eller normalt væv prøve blev anvendt pr reaktion, og et volumen på 15 pi blev anvendt til hver bisulfited DNA, der skal elueres. Den resulterende DNA blev anvendt til PCR-amplifikation eller opbevares ved -80 ° C.

Kvantitativ Methylering specifik PCR

Efter omdannelse med bisulfit, dubletter af 0,5 pi af hver bisulfited DNA blev amplificeret ved den MethyLight teknik , en tidligere beskrevet fluorescens-baserede kvantitativ real-time PCR, yderst specifik, følsom og reproducerbar assay [18]. Locus specifikke PCR primere og prober til syv tumorsuppressorgener –

MGMT1

(minimal promoter),

MGMT2 Hotel (forstærker region),

CDKN2A

,

SFRP1

,

TMEFF2

,

HS3ST2 (3OST2)

,

RASSF1A

GATA4

– var specielt designet til bisulfited-konverterede DNA-sekvenser og placeret ved hver genpromotorregion. Disse gener blev valgt for deres engagement i kolorektal carcinogenese gennem methylering-drevet lyddæmpning og dokumentation for en vis grad af hypermethylering i normalt udseende, peritumor kolorektal slimhinde modstykke (tabel 2). I den forstand er det vigtigt at understrege, at gener, der foreslås som markører for den CpG øen methylator fænotype, som per definition er næsten udelukkende methyleres i cancer væv blev undgået. Primer og prober anvendt til bisulfited DNA-sekvenser er listet i tabel S1. Fuldt methyleret og fuldt

Sss

l-methylerede DNA blev anvendt indledningsvist som 0 og 100% methylerede henvisninger til at teste amplificeringen resulterer, og methyleret DNA blev yderligere anvendt som kalibrator for alle testede prøver.

ALUC4

genet blev anvendt som endogent reference til normalisere for mængden af ​​indført DNA [19]. De MethyLight reaktioner blev udført på en 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) med et slutvolumen på 12,5 pl indeholdende 900 nM af hver primer og 250 nM af den tilsvarende probe. PCR-betingelserne var: 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 92 ° C i 15 sekunder og 58 ° C i 1 minut, som det var tidligere beskrevet [18]

Hver. måling i en given prøve blev udført in duplo for begge testede og endogene gener, og tærsklen cyklus (C

t) -den brøktal ved hvilken mængden af ​​amplificeret mål nået en fast threshold- blev bestemt. Standardafvigelsen i prøve dubletter var altid under 0,2. Relative mængder af begge gener blev også normaliseret til kommerciel 100% denatureret DNA (Zymo Research, Orange, CA), der fungerer som kalibrator at kunne sammenligne på tværs af alle testede prøver. Den sammenlignende C

t metode [20], også kendt som 2

-ΔΔCt metode, blev beregnet fromwhere

ΔC

t, prøve blev testet gener C

t-værdi for enhver prøve normaliseret til

ALUC4

, og

ΔC

t, kalibrator var den testede gener C

t-værdi for kalibratoren også normaliseret til

ALUC4

. Resultatet afledt af

ΔΔC

t × 100 svarer til procentdelen af ​​methyleret reference (PMR), der angiver den procentdel af fuldt methylerede molekyler på et specifikt locus [21].

Efterforskere udfører methylering specifikke PCR i realtid eksperimenter blev blindet for de kliniske karakteristika for patienterne (dvs. tumor mangfoldigheden).

Evaluering af tumor fejlparringsreparationsmangel

tumor fejlparringsreparationsmangel blev bedømt ved både immunfarvning og mikrosatellit ustabilitet testning. Immunohistokemisk analyse omfattede vurdering af MSH2 (anti-MSH2, Oncogene Research Products, Boston, MA), MLH1 (anti-MLH1, PharMingen, San Diego, CA) og MSH6 (anti-MSH6, BD Transduction Laboratories, San José, CA), som beskrevet andetsteds [16]. Tumorceller blev vurderet til at være negative for proteinekspression, hvis de manglede farvning i en prøve, hvor normale colonocyter og stromaceller blev plettet. Hvis der ikke immunfarvning af normalt væv kunne påvises, blev resultaterne upålidelige. Mikrosatelitter ustabilitet blev vurderet ved hjælp af 5-markørpanel foreslået af National Cancer Institute og /eller pentaplex af mononukleotid gentagelser, som beskrevet andetsteds [22].

Statistisk analyse

Sammenligning af methylering grad mellem flere og ensomme CRC patienter blev udført kvalitativt hvor methylering positivitet blev sat som PMR ≥4, som tidligere valideret [23]. Da information om methylering i normalt udseende kolorektal slimhinde var begrænset, blev analysen i denne indstilling udføres i henhold til både en ≥4 PMR cut-off og en ekstra, vilkårligt valgt ≥1 PMR cut-off for at konstatere eventuelle mindre effekt. Analysen blev udført under anvendelse af Fishers eksakte test. Sammenhæng mellem methylering niveauer af tumor par blev analyseret ved Spearman korrelationsanalyse.

Sammenligning mellem patienter med flere og ensomme tumorer vedrørende methylering grad i både tumor og normalt udseende kolorektal mucosa prøver blev også udført ved hjælp af binomial logistisk regression, både ukorrigerede og korrigeret for alder og køn. Endvidere har vi testet den uafhængige virkning af gen methylering på tumor mangfoldigheden ved at inkludere alle evaluerede gener i binomial logistisk regressionsmodel, sammen med alder og køn. Disse variable blev “beskæres” anvendelse af en automatiseret trinvis procedure til optimering af Akaike information kriterium [24]. Multiplikative interaktioner blev testet for hvert par af gener uafhængigt associeret med tumor mangfoldigheden ved at inkludere både primære effekter og et samspil sigt (et produkt af to effekter) i den logistiske regressionsmodel. Endelig har vi testet de kumulative virkninger af methylerede gener på tumor mangfoldigheden ved at tælle antallet af udvalgte gener uafhængigt forbundet med dette fænomen i hvert fag. Odds ratio for tumor mangfoldigheden for patienter, der bærer en hvilken som helst kombination af de udvalgte methylerede gener blev estimeret ved at sammenligne dem med patienter, der bærer ingen af ​​disse gener ved anvendelse af logistisk regressionsanalyse. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af “R” (R Core Development team, https://www.R-project.org).

kontinuerlige variabler blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Alle p-værdier var tosidet. En p-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at indikere en statistisk signifikant forskel.

Resultater

Fyrre-én patienter med enten synkron eller metachronous CRC, og 41 køn, alder og tumor placering-parret patienter med ensomme tumorer udgjorde grundlaget for denne undersøgelse. Som det er vist i tabel 1, begge patientgrupper var ens med hensyn til eventuelle demografiske, kliniske og tumorrelaterede karakteristika, bortset fra tilstedeværelsen af ​​synkrone kolorektale adenomer.

genpromotor Methylering i tumorprøver

Sammenligning af genpromotor methylering i tumorprøver fra patienter med multipel og ensomt CRC er afbildet i tabel 3. Generelt patienter med flere læsioner udviste en højere grad af methylering i tumorprøver end dem med ensomme tumorer vedrørende alle evaluerede gener. Andelen af ​​tumorer udviser genpromotor hypermethylering var signifikant højere hos patienter med multiple læsioner end i dem med ensomme CRC med hensyn til

MGMT2

(40,4%

vs

14,6%, henholdsvis;. P = . 0,009) og

RASSF1A

(17,0%

vs

0%, henholdsvis; p = 0,006) (tabel 3)

Vurdering af risikoen for tumor. multiplicitet forbundet med genpromotor methylering i tumorprøver er vist i tabel 4. efter justering for alder og køn, binomial logistisk regressionsanalyse indikerede, at methylering af promotorområder af

MGMT1

locus (odds ratio (OR), 1,57 95% konfidensinterval (CI), 1,01-2,43; p = 0,04),

MGMT2

locus (OR, 1,50; 95% CI, 1,14-1,96; p = 0,003), og

RASSF1A

gen (OR, 2,02; 95% CI, 1,03-3,93; p = 0,03) var forbundet med en øget risiko for at udvikle dissemineret CRC (tabel 4)

Den justerede multivariat logistisk regressionsanalyse. identificeret methylering af

MGMT2

locus (OR, 1,48; 95% CI, 1,10-1,97; p = 0,008) og

RASSF1A

gen (OR, 2,04; 95% CI, 1,01-4,13; p = 0,047) som variable uafhængigt forbundet med tumor mangfoldigheden. Hertil kommer, når produktet af disse to variabler blev tilsat til regressionsmodellen, denne interaktion udtryk blev ikke valgt (OR, 0,88; 95% CI, 0,67 til 1,16; p = 0,37). Endelig, når de kumulative virkninger af methylerede gener blev evalueret, er risikoen for tumor mangfoldigheden forbundet med methylering af nogen af ​​disse to udvalgte gener var 4,57 (95% CI, 1,53 til 13,61; p = 0,006), med ingen signifikant stigning, når begge gener blev samtidigt methyleret (OR, 2,31; 95% CI, 0,00 til ubestemt; p = 0,99).

Endelig har vi analyseret sammenhængen i methylering niveauer i den delmængde af seks patienter med multiple tumorer hos hvem begge tumorer var tilgængelig for analyse (figur 1). Denne analyse viste en ikke-signifikant sammenhæng i methylering niveauer af

MGMT2

(r = 64, p = 0,17),

SFRP1

(r = 0,83, 0,06),

HPP1

(r = 0,64, p = 0,17),

3OST2

(r = 0,83, p = 0,06), og

GATA4

(r = 0,6, p = 0,24).

MGMT1

CDKN2A

viste ikke tegn på overensstemmelse mellem tumorer i den samme patient (r = -0,05, p = 0,91; r = -0,09, p = 0,91, henholdsvis), og

RASSF1A

blev sjældent methyleret i disse tumorer, der udelukket en ordentlig korrelationsanalyse.

Resultater er udtrykt som en procentdel af methylering baseret på PMR.

Gene Promoter methylering i normalt udseende colorectal slimhinde prøver

Methylering i normalt udseende kolorektal slimhinde fra patienter med multipel og ensom CRC viste ingen relevant forskel i enhver evalueret gen (tabel 5). For at fastslå en eventuel mindre effekt, blev analysen gentaget ved hjælp af en ≥1 PMR cut-off (tabel 5). I denne anden analyse blev der ikke observeret nogen konsekvent methylering mønster, med nogle gener, der viser hypermethylering (dvs.

MGMT1

,

MGMT2

RASSF1A

), og andre hypometylering (dvs.

SFRP1

,

TMEFF2

og

GATA4

) hos patienter med multiple læsioner. Ingen af ​​disse forskelle var statistisk signifikant (tabel 5).

Diskussion

Resultaterne af denne undersøgelse viser, at tumorer fra patienter med synkron og metachronous CRC udviser en højere grad af methylering end dem fra patienter med solitære læsioner. Tumor hypermethylering af

MGMT

genenhancer regionen og

RASSF1A

genpromotorregion blev identificeret som variable uafhængigt forbundet med en fem-fold øget risiko for udvikling af flere læsioner. Endvidere fandt vi lignende methyleringsmønstre i tumor-par fra den samme patient. Samlet set giver disse observationer en proof-of-concept for et epigenetisk defekt medieret af gen-promoter hypermethylering som favoriserer tumor mangfoldigheden i sporadisk CRC.

Styrker af denne undersøgelse er afhængige af, at den blev udført på en generel befolkning gennem en prospektiv, multicenter, landsdækkende undersøgelse, hvor umarkerede og konsekutive patienter med CRC blev inkluderet uanset deres personlige og familiemæssige forhold; tidligere genetiske karakteriseringen i forbindelse med EPICOLON projektet tillod en passende identifikation og efterfølgende udelukkelse af patienter med arvelige sygdomme (dvs. kolorektal polypose, Lynch-syndrom og MYH-associeret CRC) [16], [22], [25], [26 ], [27], [28], i hvem en specifik og veldefineret molekylær mekanisme retfærdiggør tumor mangfoldigheden; det repræsenterer den største serie af patienter med multiple læsioner evalueret så langt for tumor methylering, samt den første undersøgelse, hvor en kontrolgruppe af patienter med en ensom læsion var inkluderet med tilstrækkelig lagdeling til køn, alder og tumor placering; og endelig, kvantitativ methylering specifik PCR blev udført i både tumor prøve og parret normalt udseende kolorektal slimhinde, og data analyseres i et blindet måde.

Vi er opmærksomme, men af ​​nogle begrænsninger af denne undersøgelse. Først RNA-prøver var ikke til rådighed til at udføre parallelle udtryk analyser og verificere den biologiske betydning af gen-promoter methylering. Alligevel er der en stor mængde beviser for, at MethyLight analyser giver en fremragende korrelation mellem promotor methylering og gendæmpning i lignende tumor indstillinger [11], [29]. eksisterer mere usikkerhed, dog med hensyn til værdien af ​​disse resultater i ikke neoplastiske væv. Selvom det er blevet foreslået, at den epigenetiske underskrift kræftformer kan have tidlige fase, normal-væv modstykker potentielt involveret i initiering af carcinogene proces [14], er det stadig uklart, om den samme cut-off af methylering bruges til tumor prøver ( dvs. PMR ≥4) anvendes i ikke-neoplastiske væv. For at overvinde denne begrænsning, opnåede resultater i normalt udseende kolorektal slimhinde blev analyseret under anvendelse af to forskellige cut-off-niveauer. For det andet, denne undersøgelse repræsenterer en kandidat-gen, hypotese-drevet undersøgelse, hvor et reduceret antal gener blev udvalgt på grundlag af tidligere oplysninger, der viser deres engagement i kolorektal carcinogenese gennem methylering-medieret gen-nedregulering, og tegn på en faldende grad af hypermethylering blandt tumor, peritumor normalt udseende kolorektal slimhinde, og normal colorektal slimhinde fra ikke-tumor individer. Hovedformålet med denne fremgangsmåde var at give en proof-of-concept af den potentielle inddragelse af gen-promoter hypermethylering i tumor mangfoldigheden i stedet at identificere den epigenetiske signatur bag denne proces. For at nå dette sidstnævnte mål, er high-throughput teknikker med genom bred nødvendige kapacitet, en tilgang igangværende i vores laboratorium. Tredje, evaluering af normalt udseende colorectal slimhinde var begrænset til peritumor område i langt de fleste tilfælde, da de fleste prøver blev opnået fra kirurgiske prøver. Dette aspekt udelukker generalisere resultaterne opnået i tilsyneladende normal slimhinde til hele tyktarmen. Faktisk slående kolon segment-specifikke forskelle i forekomsten af ​​methylering af nogle gener (dvs.

MLH1

MGMT

) er observeret [14]. Hvordan dette scatter mønster vil påvirke den potentielle anvendelse af methylering analyse i CRC risikovurdering og dermed formodede methylering-drevne strategier screening og overvågning, er ved at blive evalueret.

Et felt defekt medieret af

MGMT

genpromotor methylering tidligere er blevet foreslået [12]. I den skelsættende undersøgelse, hypermethylering af

MGMT

genet blev observeret i 46% af tumorer samt i 50% af normalt udseende colorektale mucosa prøver af patienter, hvor

MGMT

promotor methylering blev fundet i den tilsvarende tumor. I en anden undersøgelse, deltagelse af DNA-methylering i fem CIMP-specifikke genpromotorer, herunder

MGMT

, blev også evalueret i seks synkrone carcinoma par [30]. I denne undersøgelse blev det observeret, at mens nogle tumor par viste diskordante methyleringsmønstre, andre viste lignende, men ikke fuldstændig identisk, profiler af promotor methylering, hvilket antyder, at epigenetiske ændringer i synkron CRC sandsynligvis har både tilfældige og ikke-tilfældige komponenter [30]. . For nylig Konishi

et al

fundet væsentlige forskelle i methylering mellem flere tumorer i forhold til ensomme læsioner for

MGMT

(. 26,5%

vs

17,3%; p 0,05) og

p14

(16,1%

vs

9,3%; p. 0,05) [31]. Interessant, disse forfattere fundet en signifikant sammenhæng for methylering af forskellige gener, herunder

MGMT

mellem tumor par af samme sted (proksimal

vs.

Distal). Desværre er dette interessant spørgsmål kunne kun delvis af vores undersøgelse, idet, på grund af udformningen af ​​EPICOLON projektet blev der kun én tumor prøve indsamlet fra de fleste patienter med synkron CRC, hvilket begrænser denne parvise sammenligning med 6 patienter. Selvom de positive korrelationer for

MGMT2

ikke nåede statistisk signifikans (sandsynligvis på grund af det lave antal af parrede tumorer tilgængelige), vores resultater er i overensstemmelse med de data, der opnås ved Konishi

et al.

[31 ], støtter den hypotese, at patienter med flere tumorer viser samstemmende methylering i deres tumorvæv. Meget nylig, i en skelsættende publikation, LINE-1 methylering niveauer blev signifikant korreleret i 10 synkrone CRC par og dermed styrke hypotesen om et felt effekt [32].

Methylering-associeret inaktivering af

RASSF1A

er ofte observeret i flere humane maligniteter, herunder sporadisk CRC [33], [34], [35], [36], [37]. Faktisk tumor promotor hypermethylering af

RASSF1A

forekommer i ca. 20% af CRC, og det synes at eksistere en gensidigt udelukkende forhold til tilstedeværelsen af ​​

KRAS

mutationer [34], [35]. Interessant nok i tumorer med fejlparringsreparationsmangel, sås ingen signifikante forskelle i hyppigheden af ​​

RASSF1A

methylering mellem ustabile sporadisk CRC og tumorer er forbundet med Lynch-syndrom [37]. De ovennævnte resultater [32], sammen med demonstration af

RASSF1A

methylering i tumor prøver fra patienter med multiple læsioner, og manglen på forskelle i andre faktorer, som disponerer for tumor mangfoldigheden (dvs. familiens historie) favoriserer hypotesen af en underliggende epigenetisk defekt. Men om denne methylering-driven gene silencing mekanisme udgør en potentiel felt virkning på grund af en uidentificeret molekylær ændring i normal slimhinde eller ekspressionen af ​​eksisterende multiple hyperplastiske polypper, hvorfra CRC opstår gennem den savtakkede pathway [38], som det har været nylig foreslået [32], er fortsat ukendt.

Som det blev nævnt, afvigende methylering af nogle CpG øer er blevet set i normalt udseende kolorektal slimhinde. I en undersøgelse [13], blev dette fænomen demonstreret for

ERa

MyoD

gener, samt for

P16 (INK4a)

,

MLH1

,

TIMP3

og

DAPK

gener på et lavere niveau. Interessant nok blev nogle gen polymorfismer forbundet med en lavere methylering af CpG-øer undersøgte, hvilket antyder, at genetiske faktorer kan påvirke denne epigenetiske ændring i normal colorektal mucosa [13]. De fysiologiske tilstande associeret med afvigende promotor methylering i tilsyneladende normale kolorektale slimhinde er også for nylig blevet evalueret i forhold til to DNA-reparation gener,

MLH1

MGMT

[14]. I den undersøgelse prøver fra hanner viste ingen konsistente mønstre for enten promotor, men forekomsten af ​​

MLH1

MGMT

methylering steg betydeligt med alderen, især i højre colon, og var i overensstemmelse med