PLoS ONE: Høj uorganisk fosfat indtag Fremmer tumorigenese på tidlige stadier i en musemodel af lungekræft

abstrakt

uorganisk phosphat (Pi) er påkrævet ved alle levende organismer til udvikling af organer, såsom knogler, muskler, hjerne og lunger, regulering af ekspressionen af ​​flere kritiske gener samt signaltransduktion. Men lidt om virkningerne af langvarig kosten Pi forbrug på lungekræft progression. Dette studie undersøgte virkningerne af en høj-phosphat kost (HPD) i en musemodel for adenocarcinom. K-ras

LA1-mus blev fodret med en normal kost (0,3% Pi) eller en HPD (1% Pi) i 1, 2, eller 4 måneder. Mus blev derefter aflivet og underkastet induktivt koblet plasma masse /optisk emissionsspektrometri og laserablation induktivt koblet plasma massespektrometri analyser, Western blot-analyse, histopatologiske, immunhistokemiske og immuncytokemisk analyse for at evaluere tumordannelse og progression (herunder celleproliferation, angiogenese, og apoptose), ændringer i ion niveauer og stofskifte, autofagi, epitelial-til-mesenchymale overgangsproces og proteintranslation i lungerne. En HPD accelereret tumorigenese, som det fremgår af øgede adenom og adenocarcinom satser samt tumorstørrelse. Men efter 4 måneder af HPD, blev celledeling anholdt, og mærket stigninger i lever og lunge ion niveauer og i energiproduktion via tricarboxylsyrecyklen i leveren blev observeret, som blev ledsaget af øget autofagi og faldt angiogenese og apoptose. Disse resultater indikerer, at en HPD oprindeligt fremmer men senere inhiberer lungekræft progression grund af metabolisk tilpasning fører til tumorceller hvile. Endvidere antyder resultaterne, at nøje reguleret Pi forbrug er effektive til forebyggelse lungekræft

Henvisning:. Lee S, Kim J-E, Hong S-H Lee A-Y, Park E-J, SEO HW, et al. (2015) Høj uorganisk fosfat indtag Fremmer tumorigenese på tidlige stadier i en musemodel af lungekræft. PLoS ONE 10 (8): e0135582. doi: 10,1371 /journal.pone.0135582

Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, KINA

Modtaget: Februar 16, 2014 Accepteret: Juli 24, 2015; Udgivet: 18 August, 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: En del af dette arbejde er støttet af Grundforskningsfonden Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT Fremtidig planlægning (2012M3A9C4048819). M.H. Cho blev også delvist støttet af Research Institute for Veterinærvidenskab, Seoul National University. LA-IPC-MS blev udført med støtte fra den australske Forskningsråd, Agilent Technologies, og Kenelec Scientific som en del af koblingen Projects programmet (LP100200254). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Uorganisk fosfat (Pi) er påkrævet af alle levende organismer til diverse cellulære funktioner, inklusive mineralmetabolismen og energiproduktion fra membranphospholipider og nukleotider-og som substrat for phosphorylerede mellemprodukter i celle signalering [1]. Pi kan erhverves passivt gennem fødeindtagelse eller aktivt via cellulære stofskifte. Det er ofte brugt som tilsætningsstof til fødevarer ikke af sundhedsmæssige årsager, men for funktioner som opretholdelse af mad farve og smag, syre buffering, hævemiddel, stabilisering tekstur, og forlængelse af holdbarhed. En række fødevarer indeholder Pi, herunder cashewnødder, mandler, bacon, fiskekonserves, kondenseret mælk, smelteost, bagepulver, bagegær, æg, linser, og isotoniske og cola drikkevarer [2]. Menneskelig Pi er stigende på grund af tilgængeligheden af ​​disse fødevarer; undersøgelser viser, at brugen af ​​Pi i fødevaretilsætningsstoffer er steget støt, mens Pi indtag er steget med næsten 17% i de seneste årtier [3].

De seneste rapporter tyder på, at unormal Pi indtag er tæt korreleret med forekomsten af forskellige former for kræft [4]. Pi spiller også en afgørende rolle i genregulering under cellecyklussen samt ved signaltransduktion og transkriptionel kontrol in vitro [5]. Desuden blev en høj-phosphat kost (HPD) vist sig at fremme lunge tumorigenesis gennem ændret Akt signalering [6]. Imidlertid har der ikke været nogen undersøgelser til dato evaluerer homøostatiske vedligeholdelse i lungerne i forhold til et HPD eller rolle Pi i metabolisk tilpasning og kræft progression, hvilket indebærer autophagy, apoptose, ion niveau regulering, og adenosin trifosfat (ATP) syntese via den tricarboxylsyre (TCA) cyklussen. Nærværende studie undersøgte effekten af ​​høj Pi indtag på lungekræft progression og de underliggende mekanismer i K-ras

LA1 mus, hvor konstitutiv aktivering af K-ras-onkogen fører til udviklingen af ​​lunge adenocarcinom. Resultaterne indikerer, at en HPD oprindeligt fremmer men senere inhiberer lungecancer progression som følge af metabolisk tilpasning fører til tumorceller hvile.

Materialer og metoder Salg

Dyr og kost

Metoder, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg på Seoul National University (SNU-120904-3-2). Forsøgene blev udført på 5 uger gamle mandlige K-ras

LA1 mus opnået fra Human Cancer konsortium af National Cancer Institute (Frederick, MD, USA). Dyr blev opretholdt i et laboratorium ved en standard temperatur på 23 ° C ± 2 ° C og en relativ fugtighed på 50% ± 10% under en 12:12 timer lys /mørke-cyklus. blev tilfældigt afsat i alt 36 mus til seks grupper af seks mus hver; halvdelen af ​​musene (1, 2, og 4 måned grupper) blev fodret med en standard American Institute of Nutrition (AIN) 93-baserede kost indeholdende 0,3% Pi (normal kost, ND), mens den anden halvdel (1, 2, og 4 måneders grupper) fik den samme kost suppleret med 1,0% Pi (HPD). Sammensætningen af ​​den modificerede AIN-93G oprenset gnaverkost [7] er vist i tabel 1. kropsvægt, samt mængden af ​​pellet og vand, der forbruges, blev målt en gang om ugen. Efter 1, 2, eller 4 måneder på diæt, blev mus bedøvet med 15 mg /kg Zoletil (Laboratories Virbac, Carros, Frankrig) og 3 mg /kg xylazin (Laboratories Calier, Barcelona, ​​Spanien), og transcardial perfusion blev udført . Under obduktionen blev hjerne, thymus, hjerte, lunge, lever, milt, nyre og testikler fjernes. Tumorer på hele lungeoverfladen blev talt, og læsioner diametre blev målt med digital skydelærer under et mikroskop som tidligere beskrevet [8].

histopatologisk undersøgelse, immunhistokemi og immuncytokemi

Tissue prøver blev fikseret i 10% bufferet formalin, indlejret i paraffin, og skåret i en tykkelse på 5 um, med sektioner indsamlet på ladede objektglas (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Til histopatologisk analyse blev snit deparaffiniseret i xylen og rehydreret gennem en gradueret række af alkohol, derefter farvet med hematoxylin og eosin (H succinatdehydrogenase kompleks, underenhed A (SDHA) (ab14715) og cytochrom c-oxidase-underenhed (COX) -IV (ab33985) (begge fra Abcam); cytochrom c (A-8), Rieske (A-5), B-celle lymfom (Bcl) -2 (C-2), Bcl-2-associerede dødsfald promotoren (Bad) (C-7), Bcl-2- associeret X protein (Bax) (B-9), eIF4E (P-2), fibroblastvækstfaktor (FGF) -2 (147), prolifererende cellekerneantigen (PCNA) (PC10), N-cadherin, og actin (I -19) (alle fra Santa Cruz Biotechnology); og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (LF-PA0212, AbFrontier, Seoul, Korea). Protein bands blev påvist ved hjælp af LAS-3000 selvlysende billede analysator (Fujifilm, Tokyo, Japan) og kvantificeres ved hjælp af Multi Gauge-version 2,02 software (Fujifilm).

QRT-PCR-analyse

QRT-PCR analyse blev udført ved at isolere RNA anvendelse af total RNA blev isoleret under anvendelse af QuickGene RNA-kittet (Fujifilms Life Science System, Tokyo, Japan). Komplementær DNA blev produceret med SuPrimeScript RT Premix (Genet Bio, Cheonan, Sydkorea). Reaktionerne blev sat op i tre eksemplarer med Prime Q-Mastermix (Genet Bio) og køre på CFX96T realtid System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). I genekspressionerne præsenteres som udtrykket i forhold til actin. Sekvenserne af primerne, der blev anvendt til qPCR var som følger muse E-cadherin, fremad (5′-TCGAGGAAATCTGCATTCATACTC-3 ‘), revers (5′-TCTCCGCTGCCATTTCTAAC-3’), muse-β-actin, fremad (5 ‘ – TTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATG-3 ‘), og omvendt (5’CACTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC-3’)

Påvisning af sporstoffer i væv

Laser ablation induktivt koblet plasma-massespektrometri (LA-ICP. MS) blev udført ved hjælp af en New Wave Research UP-213 laser ablation-system (Kenelec Technologies, New South Wales, Australien) udstyret med en neodymium-dopede yttrium aluminium granat laser udsender et nanosekund laser puls i den femte harmoniske med en bølgelængde på 213 nm . Laseren blev tilsluttet et 7500ce ICP-MS (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) Tygon slange. Nærmere oplysninger om analysemetoderne er tidligere blevet offentliggjort [10]. Kort fortalt blev laserstrålen bitmapobjekt langs prøveoverfladen i en lige linje. Data blev erhvervet med en laser spot størrelse på 65 um, laser scanning hastighed på 20 um s

-1, og ICP-MS integration samlet tid på 0,325 s. For ICP-optisk emission (ICP-OES) grundstofanalyse blev vævsprøver spaltet i svovlsyre og hydrogenperoxid. Alle kemiske reagenser var af analytisk kvalitet. Vand (resistivitet på 18,2 MOhm) var de-ioniseret med en Milli-Q-systemet (Millipore, Bedford, MA, USA). Salpetersyre (65% v /v) og svovlsyre (95% -97% v /v) (begge fra Samchun Chemical Co., Seoul, Korea) blev anvendt til prøvefremstilling. Acid fordøjelse af vævsprøver fortyndet med Milli-Q-vand under anvendelse af en syre koncentration på 0,2% blev udført ved 70 ° C i 24 timer efterfulgt af hydrogenperoxid (70 ° C) fordøjelse natten over. Koncentrationer af elementært Mn, Fe, Cu og Zn blev kvantificeret ved ICP-MS og koncentrationer af elementært Na, Ca, S, og P blev målt ved ICP-OES. Operationelle forhold for begge procedurer er vist i tabel 2.

Statistisk analyse

Den studerendes

t

-test blev anvendt til at evaluere forskelle mellem to grupper (GraphPad Software , San Diego, CA, USA). Stjerner (*) angivet statistisk signifikante forskelle til ND.

Resultater

Høj Pi indtag accelererer tumorigenese på tidlige stadier i en lungekræft model

For at undersøge effekten af ​​høje Pi indtag på lungekræft cellevækst blev tumorer på lungeoverfladen målt i HPD- og ND-fodret mus (fig 1A). Alle HPD-fodret mus udviste progressiv adenocarcinom og adenom, som observeret af H 1,5 mm, og tumor volumen i ND- og HPD-fodret mus. Resultaterne er gennemsnit ± standardafvigelse (SD) af seks uafhængige målinger. Fejl bar repræsenterer SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. (C) Tumorer på lungerne af ND- og HPD-fodret mus, som visualiseret ved H 0,05; ** P 0.01.

En hpd øger autofagi og epitelial-til-mesenkymale overgang i lungerne

De tidligere resultater viste, at høj Pi forbrug oprindeligt fremmer men senere hæmmer tumorigenese. At vurdere, om ændringer i overensstemmelse med tumorsuppression forekomme som følge af langvarig høj Pi forbrug blev markører for autofagi og epithelial-til-mesenchymal overgang (EMT) undersøgt. Ekspressionen af ​​autophagosomal markører LC3 og ATG5 blev forøget i lungerne hos HPD-fodrede mus sammenlignet med ND-fed mus efter 4 måneder, som påvist ved Western blotting (Fig 4A). I lungevæv prøver blev lejlighedsvis LC3 signaler observeret i 1- og 2-måneders HPD grupper ved immuncytokemi (data ikke vist), hvorimod efter 4 måneder, det fluorescerende signal var signifikant højere i HPD end i ND-gruppen (fig 4B ). Desuden ekspressionen af ​​EMT markør N-cadherin var højere i HPD end i ND grupper, selv om forskellen mellem de to ernæringsbetingelser var størst efter 4 måneder (Fig 4C). I QRT-PCR-analyse, ekspression af epitelial markør E-cadherin var lavere i HPD end i ND grupper (Fig 4D). Disse resultater antyder, tumorprogression undertrykkes af høj Pi forbrug på senere trin som følge af aktiveringen af ​​autofagi og EMT.

(A) Protein ekspression af autofagi markører LC3 og ATG5 i lungevæv-homogenater som bestemt ved western blotting under anvendelse actin som et loading kontrol. (B) LC3 ekspression (grøn) i lungevæv sektioner blev bedømt ved immunocytokemi. Den højeste immunreaktivitet blev observeret i 4 måneder HPD gruppe i forhold til den tilsvarende kontrol (ND) gruppe. Målestokken: 10 um. (C) Protein ekspression af EMT markør N-cadherin i lungevæv homogenater af K-ras

LA1 mus fodret en ND eller HPD for 1, 2, eller 4 måneder (n = 6 pr gruppe), som bestemt ved western blotting under anvendelse actin som et loading kontrol. Resultaterne er gennemsnit ± standardafvigelse SD. Fejl bar repræsenterer SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. (D) QRT-PCR-analyse af epiteliale markører, E-cadherin. Resultaterne er gennemsnit ± standardafvigelse SD. Fejl bar repræsenterer SD. * P 0,05; *** P 0,001.

HPD forbrug øger protein translation på tidlige stadier af tumor udvikling

mTOR pathway regulerer protein oversættelse via eukaryote hæmning faktor 4E bindende protein 1 (eIF4E-BP1) phosphorylering og den 70-kDa ribosomal protein S6 kinase (p70S6K) og dermed påvirke tumorcelleproliferation. En betydelig stigning i eIF4E og p70S6K ekspression blev observeret i prøver fra 1- og 2-måneders HPD grupper i forhold til kontrolgruppen (figur 5). I modsætning hertil var niveauerne af begge proteiner reduceret efter 4 måneder i HPD gruppen sammenlignet med ND-gruppen. Disse data tyder på, at protein oversættelse forbigående blev stimuleret af Pi i de tidlige stadier af tumor udvikling.

udtryk for de i forbindelse med oversættelse proteiner p70S6K, eIF4E, p-4E-BP-1/2, og 4e BP-1/2 i lungevæv homogenater af K-ras

LA1 mus fodret en ND eller HPD for 1, 2, eller 4 måneder blev bestemt ved western blotting og kvantificeret ved densitometri (n = 6 pr gruppe) i forhold til ekspressionsniveau af actin. Resultaterne er gennemsnit ± standardafvigelse SD. Fejl bar repræsenterer SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

En hpd stimulerer celleproliferation og angiogenese ved tidlige stadier af tumor udvikling

Effekten af ​​Pi på tumor progression blev også undersøgt ved at evaluere celledeling og angiogenese i K-ras

LA1 mus. Ekspressionsniveauerne af PCNA og FGF-2-markører for proliferation og angiogenese-i lungerne hos mus i de 1- og 2-måneders HPD grupper blev øget sammenlignet med dem i de tilsvarende ND-grupper, som bestemt ved western blotting (fig 6A). I modsætning hertil blev et signifikant fald i disse proteiner observeret i 4 måneder HPD gruppe. Disse resultater blev også bekræftet ved immunhistokemi, som afslørede en større PCNA immunoreaktivitet i prøver fra de 1- og 2-måneders HPD grupper end i dem fra 4-måneders HPD gruppe (figur 6B). Disse resultater viser, at tumorcelleproliferation og angiogenese blev fremskyndet af Pi på tidlige stadier, men at disse effekter blev afskaffet med langvarig Pi forbrug.

spredning og angiogenese blev evalueret i lungerne hos K-ras

LA1 mus fodret en ND eller HPD for 1, 2, eller 4 måneder (n = 6 pr gruppe). (A) Ekspression af proteiner associeret med proliferation (PCNA) og angiogenese (FGF-2) i lungevæv homogenater blev evalueret ved Western blotting under anvendelse af actin som et loading kontrol. (B) PCNA-udtrykkende celler i tumoren regionen (øverste højre hjørne af hvert panel) blev visualiseret ved immunohistokemi. Scale bar: 20 pm. Resultaterne er gennemsnit ± standardafvigelse SD. Fejl bar repræsenterer SD. * P 0,05; ** P 0.01.

Pi reducerer mitokondrier-medieret apoptose i lungerne

Evasion af apoptose er en medvirkende faktor i carcinogenese, kræft progression, og erhvervelse af resistens over for behandlingen. For at undersøge om Pi forbrug påvirker mitochondrier-medieret apoptose, ekspressionsniveauerne af Bad, Bax, og cytochrom C-proteiner i lungen blev vurderet ved Western blotting. Alle tre proteiner blev nedreguleret i HPD-fodrede mus på alle tidspunkter (fig 7A). Desuden blev caspase-3-aktivitet i tumoren regionen også faldet ved 1, 2, og 4 måneder i HPD gruppen sammenlignet med ND-gruppen (fig 7B). Disse resultater indikerer, at en HPD kan reducere mitochondria-medieret apoptose i lungerne hos K-ras

LA1 mus.

Apoptose i lungerne blev analyseret i K-ras

LA1 mus fodret en ND eller HPD for 1, 2, eller 4 måneder (n = 6 pr gruppe). (A) Ekspressionen af ​​de mitochondriale apoptose-relaterede proteiner Bad, Bax, og cytochrom c blev evalueret ved Western blotting af lunge vævshomogenater, med actin anvendt som en loading kontrol. (B) Immunhistokemisk analyse af caspase-3-ekspression i tumoren region. Scale bar: 20 pm. Resultaterne er gennemsnit ± standardafvigelse SD. Fejl bar repræsenterer SD. * P 0,05; ** P 0.01.

Diskussion og konklusion

Neoplastisk progression indebærer en forstyrrelse af den homeostatiske styring af celleproliferation, celledød, og DNA-reparation som følge af endogene faktorer eller udsættelse for eksogene kræftfremkaldende kemikalier [ ,,,0],11]. Pi virker som en global signalering molekyle, der regulerer genekspression i svampe, bakterier og planter, samt forskellige celletyper i dyr [12] i processer, såsom mineralske eller intermediær metabolisme og energioverførsel. Desuden Pi er en vigtig bestanddel af phospholipider og nukleotider, og er nødvendig for protein fosforylering [13]

Hæmning af Na-phosphat-co-transporter 2b undertrykt lungekræft vækst.; proteinet viste sig også at være højt udtrykt i fase I og III lungekræft humane vævsprøver [14]. I en musemodel for lungekræft, har høj Pi indtag blevet forbundet med øget cap-afhængig translation samt tumorigenese via Akt signalvejen i hjernen, lunger og lever [6,15-17]. Men virkningerne af langvarig høj Pi forbrug på pulmonal cancer progression er ikke tidligere blevet rapporteret; dette blev undersøgt i den foreliggende undersøgelse i K-ras

LA1 mus fodret en HPD over en periode på 1, 2, eller 4 måneder.

Musene forbrugt en modificeret version af AIN-93 kost, som mangler Ca og P. sammensætningen af ​​pellets blev ændret baseret på AIN-93G kost ved at erstatte de manglende elementer (fx ved tilsætning af natriumfosfat for P) for at opfylde ND (0,5% Ca, 0,3% P) og HPD (0,5% Ca, 1% P) betingelser. Det daglige forbrug af Pi blev øget, mens daglige fødeindtagelse var uændret (tabel 3). Desuden var der ingen forskel i kropsvægt mellem ND og HPD grupper (S1 Fig). Ikke desto mindre markante ændringer i niveauerne af forskellige ioner, herunder P, blev observeret i 4 måneder HPD gruppe, i forhold til ND-gruppen (tabel 5).

Leveren er et vigtigt organ for fordøjelsen samt som xenobiotisk metabolisme. Blod forlader mave og tarme passerer gennem leveren, som nedbryder de næringsstoffer komponenter [18]. Da denne proces involverer ændringer i ion-niveauer blev en kvantitativ analyse udført for at vurdere ændringerne i koncentrationerne af forskellige ioner i mus fodret en HPD. En analyse af Fe-S Rieske kompleks ved LA-ICP-MS afslørede højere Fe og S-niveauer i leverne af HPD-fodrede mus end kontrolmus, der var sandsynligvis på grund af forøget cellulær metabolisme. P-niveau blev også øget i alle HPD grupper. Et højere indtag metalion øger risikoen for cancer ved at stimulere celleproliferation eller inhibering tumorsuppressorer såsom p53. For eksempel cytoplasmatiske Ca

2 + virker som et mitogen [19]. Cancer forekomst har også været forbundet med øget optagelse og reduceret udstrømning af Fe [20]. Endvidere er en høj Fe

3+ niveau aktiverer Fe

3 + -afhængige proteiner, der forbedrer celleproliferation [21]. Makrofager i tumormikromiljøet kan accelerere tumorvækst delvis ved tilvejebringelse tumorceller med Fe [22], mens forhøjet Fe

3+ niveauer kan øge risikoen for kræft. High Zn

2 + niveauer kan inducere tabet af mitokondriepotentiale og resulterer i nedbrydningen af ​​Bcl-2 [23]; Zn

2+ spiller en central rolle i nedregulering apoptose-gener såsom

Bax

,

Bcl-2

, og

survivin

, hvilket fører til tumorigenese [ ,,,0],24]. Skader på Bcl-2 er en kausal faktor i forskellige cancerformer, herunder melanom, bryst-, lunge- og prostatakræft, og kronisk lymfatisk leukæmi [25]. Disse resultater sammen med resultaterne af den foreliggende undersøgelse viser, at høje Pi forbrug over en lang sigt ændrer niveauerne af specifikke metalioner og kan inducere tumorigenese. Yderligere arbejde i øjeblikket på at bestemme den præcise rolle af disse ioner i kræft udvikling og progression.

TCA cyklus er en energi-genererende metabolisk vej, der begynder med overførslen af ​​en to-carbon acetylgruppe fra acetyl- CoA til oxalacetat [26]. Komplekser I-IV spiller en vigtig rolle i cellulær respiration og ATP produktion [27]. Vi fandt, at den basale stofskifte var højere i HPD end i ND-gruppen, hvilket antyder, at Pi aktiveret TCA cyklus i leveren gennem hurtig forbrug af acetyl-CoA. Faktisk en HPD inducerede opregulering af elektrontransportkæden-associerede proteiner såsom SDHA, cytochrom c, COX-IV, og Rieske (figur 3). De fleste primære og metastatiske cancere er karakteriseret ved øget glycolyse, hvilket fører til øget forbrug af glucose [28]. Glykolyse mellemprodukter anvendes til biosyntese af kræftceller, som derfor kræver mere ATP end ikke-delende celler [29]; cancerceller kan også bruge aerobe glycolyse til at metabolisere glucose, et fænomen kendt som Warburg virkning [28]. En nylig undersøgelse rapporterede, at det endoplasmatiske retikulum enzym ectonucleoside triphosphat diphosphohydrolase 5 stimulerer ATP forbrug og begunstiger aerob glycolyse og dermed fremme cancercelleoverlevelse [30]. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse viser, at høj Pi udløser cellulær metabolisme og fører til større ATP-produktion.

Autophagy aktivering observeres under både sult og hypoxiske betingelser i tumormikromiljøet [31]. Autophagy fremmer celleoverlevelse under transient næringsstofudsultning og vækstfaktor tilbagetrækning [32] som reaktion på lav glucoseoptagelse og glycolyse, hvilket fører til et fald i hastigheden for protein translation [33]. Under hypoxiske betingelser, cancerceller viser ændrede metaboliske egenskaber såsom en opregulering af glykolyse og oxidativ stress respons. Kontinuerlig biosyntese af laktat fra glukose under aerobe betingelser udgør en tilpasning til sporadiske hypoxiske forhold i præmaligne læsioner og fremmer kræft celle vækstdvale [34], hvor celler i tumoren interiør indtaste en tilstand af hvile udløst af lav ledighed næringsstof og hypoxi. Autophagic aktivitet, som det fremgår af LC3-II-ekspression, induceres som et adaptivt respons [35], mens ekspressionen af ​​specifikke EMT-proteiner er korreleret med tumor aggressivitet [36]. I den foreliggende undersøgelse blev det antaget, at tumorer tilpasset de høje niveauer af Pi, som forlængede den lavenergi-metaboliske tilstand, hvilket således resulterer i tumorcelle hvile i mus i 4-måneders HPD gruppe. Under metabolisk tilpasning til høj Pi koncentration, kan kræftceller også udvikle lægemiddelresistens og blive mere aggressive [37]. Her blev det observeret, at ekspressionen af ​​autofagi markører LC3-II og ATG5 samt den for EMT markør N-cadherin var forhøjet i lungerne hos mus i 4 måneder HPD gruppe (figur 4C); dette fund er i overensstemmelse med de seneste undersøgelser, der har vist, at aktiveringen af ​​autofagi er korreleret med tumor tilpasning og en deraf følgende stigning i kræft aggressivitet [38].

En anden nylig undersøgelse viste, at mTOR-Akt pathway var aktiveret i ca. 90% af ikke-småcellet lungekræft celler, som tillægges overlevelse og modstand mod behandling [39]. Det ribosomale protein p70S6K regulerer proteintranslation via mTOR pathway, og dens inaktivering undertrykker cellevækst [40]. Derudover oversættelse og phosphorylering af 4E-BP1, som udtrykkes i en række forskellige maligniteter, er tæt forbundet med tumorudvikling. Oversættelse initiering hæmmes af bindingen af ​​4E-BP1 og eIF4E, hvilket fører til rekruttering af oversættelsen komplekse til mRNA [41]. Samlingen af ​​eIF4F komplekset er afsluttet ved udgivelsen af ​​hyperphosphoryleret 4E-BP1 fra eIF4E, som giver oversættelse for at fortsætte [42]. Oversættelse indvielse er det hastighedsbegrænsende trin i proteinsyntese, og oversættelse satser bestemmes af eIF4E protein niveauer [43]. I den foreliggende undersøgelse blev pP70S6K og eIF4E højt udtrykt i lungerne af mus i de 1- og 2-måneders HPD grupper, hvilket tyder på, at protein omsætning og tumorprogression i disse mus var højere end i mus forbrugende høj Pi over en længere periode