PLoS ONE: Aktivering af c-Met og opregulering af CD44 Expression er forbundet med metastatisk Fænotype i Colorectal Cancer levermetastaser Model

Abstrakt

Baggrund

levermetastaser er den mest almindelige årsag til dødsfald hos patienter med colorectal cancer. Trods omfattende forskning i biologien af ​​cancer progression, er de molekylære mekanismer, som driver kolorektal cancer metastase ikke godt karakteriseret.

Metoder Salg

HT29 LM1, HT29 LM2, HT29 LM3 cellelinjer blev afledt fra den human kolorektal cancer cellelinje HT29 efter flere runder af

in vivo

udvalg i immunsvækkede mus.

Resultater

CD44 udtryk, et transmembrant glycoprotein involveret i celle-celle og celle- matrix sammenvoksninger, og cancerceller adhæsion til endothelceller blev forøget i alle

in vivo Salg udvalgte cellelinier, med maksimal CD44-ekspression og cancerceller adhæsion til endotelceller i meget metastatiske HT29 LM3 cellelinie. Aktivering af c-Met ved hepatocytvækstfaktor (HGF) stimulation i

in vivo

udvalgte cellelinjer er CD44 uafhængig.

In vitro

adskillelse af CD44 høje og lave ekspressionsniveauer celler fra HT29 LM3 cellelinje med FACS-sortering bekræftede, at c-Met-aktivering er CD44 uafhængig ved hepatocytvækstfaktor stimulation. Desuden

in vivo

evaluering af CD44 lav og høj udtrykker HT29 LM3 celler viste ingen forskel i levermetastaser penetrans.

Konklusioner

Tilsammen vores resultater viser, at den aggressive metastatisk fænotype af

in vivo

udvalgte cellelinjer er forbundet med overekspression af CD44 og aktivering af c-MET. Vi viser, at c-Met aktivering er CD44 uafhængig ved hepatocytvækstfaktor stimulation og bekræfter, at CD44-ekspression i HT29 LM3 cellelinje er ikke ansvarlig for stigningen i metastatisk penetrans i HT29 LM3 cellelinje

Henvisning:. Elliott VA , Rychahou P, Zaytseva YY, Evers BM (2014) Aktivering af c-Met og opregulering af CD44 Expression er forbundet med metastatisk Fænotype i Colorectal Cancer levermetastaser Model. PLoS ONE 9 (5): e97432. doi: 10,1371 /journal.pone.0097432

Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, Frankrig

Modtaget: Februar 17, 2014 Accepteret: April 18, 2014; Udgivet: 13. maj 2014

Copyright: © 2014 Elliott et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud R01DK048498 fra NIDDK og T32CA165990 fra NCI. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA [1]. Metastatisk eller recidiverende sygdom er den mest almindelige dødsårsag hos disse patienter. Prognosen for CRC er baseret på dannelsen af ​​fjerne metastaser, ikke den primære tumor selv. Selv med omfattende forskning i biologi kræft progression, er de molekylære mekanismer, der er involveret i den metastatiske kaskade ikke godt karakteriseret.

Mekanismerne i metastaser involverer en selektiv og sekventiel række trin, herunder adskillelse fra den primære tumor, invasion gennem omgivende væv, ibrugtagning kredsløbssygdomme, og oprettelse og spredning i en fjern sted [2]. To proteiner, der har vist sig at være involveret med flere trin i den metastatiske kaskade er CD44 og c-MET. CD44, et transmembrant glycoprotein, der tilhører en familie af celleadhæsionsmolekyler, er involveret i udvikling og metastaser af flere typer af cancer [3] – [6] og er blevet forbundet med en dårlig prognose i CRC patienter [3]. c-MET er et proto-onkogen, der koder for receptoren tyrosinkinase, også kendt som hepatocytvækstfaktor-receptoren [4]. Den eneste kendte ligand for c-MET er hepatocytvækstfaktor (HGF); både c-MET og HGF opreguleres i en række maligniteter og er forbundet med en dårlig prognose og en tidlig indikator for yderligere metastase [5]. Konkret er c-MET involveret i reguleringen af ​​spredning, motilitet, invasion og metastase via phosphorylering og aktivering af downstream signalveje [4].

En omfattende forståelse af de mekanismer, der driver CRC metastase er vigtigt for udviklingen af ​​hidtil ukendte fremgangsmåder til behandling af denne cancer. Derfor er formålet med vores undersøgelse var at identificere de gener, der fremmer levermetastaser i CRC. Her har vi etableret tre stærkt metastatiske CRC cellelinier og viser, at deres mere aggressiv metastatisk fænotype er associeret med en stigning i CD44-ekspression og aktivering af c-MET. Endvidere viser vi, at aktiveringen af ​​c-MET var uafhængig af indholdet af CD44 til stede. Endelig har vi vise, at øget CD44-ekspression er ikke ansvarlig for stigningen i metastatisk penetrans den af ​​HT29 LM3 cellelinje. Vigtigere er det,

in vivo

udvælgelse og isolering af lever-tropisk CRC metastatiske celler tilladt os at studere de biologiske mekanismer i CRC kræft metastaser og identificere de mekanismer, der bidrager til levermetastaser i CRC.

Materialer og Metoder

cellelinier, transfektioner

HT29-celler og human lunge mikrovaskulære endotelceller (HMVEC-L) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), er tidligere godkendt i november 2011 af Genetica DNA Laboratories (Cincinnati, OH) blev dyrket i McCoys 5A-medium, indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) suppleret med 10% FBS og antibiotika-antimykotika. EGFP-N1 vektor blev købt fra Clontech (Mountain View, CA). GFP-udtrykkende celler blev selekteret med 500 ug /ml Geneticin (G418), indkøbt fra Life Technologies (Carlsbad, CA) og beriget af tre cyklusser af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Pre-made pGL3 ildflueluciferase (luc) lentivirale partikler blev købt fra Lentigen (Gaithersburg, MD). For lentiviral transduktion, /5000 celler brønd blev podet i 96-brønds vævskulturplader og inficeret den følgende dag med luc lentivirale partikler ved en MOI på 10 i nærværelse af 10 ug /ml polybren, indkøbt fra Santa-Cruz Biotechnology (Dallas, TX ).

levermetastaser Model og

i

vivo

Imaging

Mand athymiske NCR nøgne mus mellem 6-8 ugers alderen blev købt fra Taconic ( Hudson, NY). Boliger til disse dyr blev fastholdt i et HEPA-filtreret miljø i steriliserede bure med 12 timer lys /12 timer mørke cykler. Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse af og i overensstemmelse med University of Kentucky Institutional Animal Care og brug Udvalg; protokol # 2009-0529. For milten injektion af CRC-celler athymiske NCR nøgne mus blev bedøvet med isofluran (induktion 4%, vedligeholdelse 2%). En 1 cm kutan snit blev lavet i den venstre flanke og båret ned gennem bugvæggen. Milten blev omhyggeligt udsat for, og HT29 GFP-Luc celler (5 x 10

6 celler /100 pi) blev injiceret under milt kapsel ved hjælp af en 27-gauge kanyle. Levedygtigheden af ​​celler til inokulation var større end 95% som bestemt af Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Blide tryk blev påført podningsstedet indtil der ikke var synlige tegn på blødning. LIGACLIP ekstra enkelt klip ligere applier med titanium LIGACLIP ekstra ligaturklemmer, indkøbt fra Ethicon (San Angelo, TX), blev brugt til at klippe lienale og lieno-pancreas vener 5 min efter milt injektion af CRC celler; milten blev derefter fjernet. Musene blev aflivet efter 4 uger eller tidligere, hvis døende. Lever væv blev bevaret for histologisk undersøgelse af fiksering i 10% bufferet formalin efterfulgt af paraffin indlejring.

Alle bioluminiscerende billeder blev erhvervet med en IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), med scenen opvarmet til 37 ° C under levende celler. Billeder blev erhvervet 10 minutter efter i.p. injektion af D-Luciferin (150 mg /kg) under anvendelse af 15 sek eksponering. GFP-fluorescens billeddannelse blev udført ved anvendelse af en LT-9500 Illumatool /TLS (Lightools Research, Encinitas, CA), udstyret med en excitationskilde (470 nm) og filterpladen (515 nm).

Enzymatisk Isolering af CRC Cells fra levermetastaser

Liberase DH Research Grade (05401054001; Roche Applied Science) blev resuspenderet i sterilt vand til 2,5 mg /ml koncentration og opbevares i single-brug 100 pi prøver at-80 ° C. Collagenase /hyaluronidase (07912; StemCell Technologies) blev opdelt i alikvoter i engangsbrug 250 pi alikvoter og opbevaret ved -80 ° C. Ved afhentning blev metastatiske tumorer placeret i fuldstændig celledyrkningsmedier suppleret med 1X Gibco Antibiotika-antimykotikum (15240-062, Life Technologies) til transport. Metastatiske tumor-fragmenter blev hakket i 2 mm terninger med en saks og fordøjet i 50 ug /ml Liberase DH (100 pi) og 0,5X Collagenase /hyaluronidase (250 pi), fortyndet i 5 ml McCoy5A serumfrit medium i 4 timer ved 37 ° C under forsigtig omrøring ved magnetisk omrøringsstang. Ingen ufordøjet væv blev observeret. Fordøjede celler blev vasket to gange med komplet celledyrkningsmedier og overført til 10% FBS McCoy5A medium suppleret med 1X Gibco Antibiotikum-antimykotisk og 100 ug /ml Primocin (ant-pm-1; InvivoGen).

Western blot-analyse og antistoffer

Total proteinlysater (20 ug) blev opløst på en 4-12% bis-Tris gel og overført til Immobilon PVDF overføringsmembraner. Membraner blev inkuberet i 40 minutter ved stuetemperatur i blokeringsopløsning (TRIS-bufret saltvand indeholdende 5% fedtfri tørmælk og 0,1% Tween 20), efterfulgt af inkubation natten over i primære antistoffer ved 4 ° C. Membraner blev derefter vasket 3 gange og inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer i 1 time. Efter 3 yderligere vaske blev immunkomplekserne på membranerne visualiseret ved ECL påvisning

Følgende antistoffer blev købt og anvendt i vores undersøgelse:. Cell Signaling (Danvers, MA): phospho-AKT (# 4058), total AKT (# 2920), AKT2 (# 3063), phospho-ERK 1/2 (# 4695), total ERK ½ (# 9107), PTEN (# 9559), phospho-mTOR (# 2971), total mTOR (# 2972), phospho-MET (# 3129 for western blotting og # 3077 for IHC), c-MET (# 3148), CD44 (# 3570), phospho-beta catenin (# 4176), phospho-FAK (# 8556), og total FAK (# 3285). Santa Cruz (Dallas, TX): AKT 1 (# 5298). BD (San Jose, Californien): Beta catenin (# 610.154) og E-cadherin (# 610.404). Abcam (Cambridge, MA): KRAS (# 55.391). Millipore (Billerica, MA): p85α (# 05-212). Alle antistoffer blev anvendt i en koncentration på 1:1,000.

siRNA Transfektioner og HGF Cell Behandling

I HGF, behandling celler blev podet i en koncentration på 800.000 celler /brønd i en plade med seks . Efter 24 timer blev cellemediet ændret til serumfrit medium i yderligere 24 timer. Rekombinant humant HGF (PeproTech # 100-39) blev derefter tilsat til brøndene i en koncentration på 50 ng /ml i 5 min. siRNA transfektioner: ON-TARGET plus CD44 siRNAs (LU-00.999.907, LU-00.999.908) og styre siRNA (D-001.810-10) blev købt fra Dharmacon (Lafayette, CO) og anvendes i en koncentration på 100 uM

Immunhistokemi

Immunhistokemi (IHC) blev udført som tidligere beskrevet [6]. De paraffin-sektioner blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i faldende ethanol serien. Proteinfarvning blev udført under anvendelse DAKO EnVision Kit, indkøbt fra Dako Corp. (Carpinteria, CA). CD44 og p-Met antistoffer blev anvendt i en koncentration på 1:100 i DAKO antistoffortynder. Alle snit blev modfarvet med hematoxylin og observeret ved lysmikroskopi.

proliferationsassav

Parental HT29 og HT29 Lm3 celler blev udpladet i 24-brønds plader ved en densitet på 25.000 celler per brønd. Proliferation blev vurderet ved celletælling ved 24, 48 og 72 h, under anvendelse af en Beckman-Coulter Vi Cell XR cellernes levedygtighed analysator (Fullerton, CA).

endotelcelleadhæsion Assay

humane mikrovaskulære endotelceller fra lungerne (HMVEC-L) blev aktiveret med 15 ng /ml TNFa i 4 timer. Parental HT29 og HT29 Lm3 celler blev mærket med calcein AM (2,5 mg /ml slutkoncentration) i 30 min ved 37 ° C, vasket og tilsat oven på monolag af aktiverede HMVEC-L-celler i 30 minutter. Fastgjorte celler blev fjernet ved vask med PBS (5x) og tre GFP billeder blev taget per brønd for at tælle de vedhæftede celler.

flowcytometrianalyse og Celle Sortering

HT29 LM3 celler blev mærket med CD44 – Alexa Fluor 647-antistof (Biolegend) i en koncentration på 2,5 ug /mL per 10

7-celler i 30 minutter. Cellerne blev vasket og resuspenderet i sortering puffer (1X phosphatpufret saltopløsning, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% varmeinaktiveret føtalt bovint serum). Inden for en prøve af HT29 Lm3 celler, vi sorteret to populationer af celler: 10% af cellerne med en høj ekspression af CD44 (forkortet HT29 LM3 CD44 +), og celler, som ikke udtrykker CD44 (forkortet HT29 LM3 CD44-). Ufarvede HT29 LM3 celler blev anvendt som en negativ kontrol. Efter cellesortering blev cellerne ekspanderet i cellekultur. Den britiske flowcytometri Servicecenter foretaget celle analyse og cellesortering.

Resultater

In vivo

Udvælgelsesprocessen af ​​Lever-tropisk CRC metastatiske celler

CRC levermetastaser er en flertrins proces, hvor maligne celler spredes fra en primær tumor til at kolonisere leveren. Maligne celler er invasiv og metastatisk; imidlertid kun en begrænset del af cellerne i en primær tumor anses for meget metastatisk.

In vivo

udvælgelsesmetoder, med primære cancer cellelinjer og sammenligning mellem rene klonale populationer af isolerede lever-tropiske metastatiske celler er en nyttig videnskabelig tilgang til identifikation af biologiske mekanismer forbedret i løbet af CRC levermetastaser.

i denne undersøgelse, vi manipuleret den HT29 CRC cellelinje til at udtrykke reporter plasmider, GFP og ildflueluciferase der tillader fluorescens og bioluminescens billeddannelse i en enkelt eksperimentel model, og udførte

i

vivo

udvælgelse af HT29-celler, der metastaseret til leveren. Kort fortalt blev HT29-celler injiceret i milten af ​​athymiske nøgne mus; splenektomi blev udført 5 minutter efter injektion af milten CRC-celler for at undgå re-metastase. Eksperimentel levermetastaser (LM; 30-40 metastatiske læsioner) blev høstet, etableret i vævskultur, og udpeget som den HT29 LM cellelinjer. Celler høstet fra disse kulturer blev injiceret i milten fra et andet sæt af nøgne mus. Sekvensen af ​​

i

vivo

valg vises i figur 1A. HT29LM1 og HT29 LM3 varierer voldsomt med hensyn til deres metastatiske potentiale. Bioluminescerende billeddannelse af mus injiceret med HT29 LM2 demonstrerede en 2,5 gange stigning i penetrans sammenlignet med parentale cellelinje (~3.5 wks med -100% penetrans vs. -4 wks med ~ 40% penetrans) (figur 1B). Således

i

vivo

udvalg af HT29 cellelinjer forudsat meget metastatiske celler til sammenligning med forældrenes celler under isogene baggrund.

(A) Illustration af metastaserende CRC

i

vivo

udvælgelsesprocessen. Eksperimentelle levermetastaser blev høstet, etableret i kultur og betegnet HT29 LM1, LM2, og LM3 cellelinier. (B) Bioluminescent billeder af mus 4 uger efter milten injektion af forældrenes HT29 og HT29 LM2 cellelinjer.

c-MET Pathway opreguleres i HT29 Afledt cellelinier

Molekylær analyse af cancerceller i forskellige stadier af progression har afsløret, at ændringer i tumorsuppressorgener og onkogener ophobes under tumorprogression og korrelerer med den kliniske aggressivitet af cancer. Dernæst udførte vi komparativ analyse af flere onkogener og tumor suppressor genekspressionsprofiler i HT29 LM cellelinjer ved Western blot. Figur 2 viser, at phosphorylering af c-MET dramatisk blev forøget i HT29 LM1 og HT29 LM2 cellelinjer, med den højeste aktivering i HT29 LM3 cellelinie, sammenlignet med de parentale HT29-celler. Vi observerede en lille stigning i den samlede C-MET protein samt. Disse ændringer blev noteret, når celler blev dyrket i normale eller serumfrie betingelser (separate eksperimenter). Western blot analyse af protein ekstrakter fra HT29 LM cellelinier viste ingen ændringer i Pakt (Ser473), Akt, p85α, PTEN, pERK (Tyr 1234/1235), ERK, k-Ras proteinekspression (data ikke vist). Tilsammen tyder disse resultater på, at en stigning i metastatiske potentiale HT29 afledt cellelinjer er associeret med aktivering af c-MET-vejen.

HT29 LM1, LM2, LM3 og parentale cellelinje blev dyrket i normalt medium for 24 (første 4 baner). I et andet forsøg blev celler dyrket i serumfrit medium i 24 timer og stimuleret med komplet medium i 10 min (resterende 4 baner). Proteinekspression profiler blev analyseret ved Western-blot. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Ekspression af CD44 Protein signifikant forøget i HT29 cellelinier

Ekspressionen af ​​centrale proteiner i CD44, β-catenin , og FAK veje, som spiller en vigtig rolle i CRC metastaser [7] – [9] blev analyseret næste. Vi observerede en gradvis forøgelse af høj molekylvægt CD44-ekspression observeret ved -150 kDa i HT29 LM cellelinjer, med maksimal CD44 ekspression i HT29 LM3 sammenlignet med den parentale HT29 cellelinje (figur 3A). Western blot analyse af proteinekstrakter fra HT29 LM cellelinier viste ingen ændringer i p-β-Catenin (S675), β-catenin p-FAK (Tyr397) og FAK-protein-ekspression (data ikke vist). For yderligere at bekræfte vores

i

vitro

resultater, vi analyserede forældrenes HT29 og HT29 LM3 levermetastaser vævssnit ved IHC. I overensstemmelse med Western blot-analyse, ekspression af både p-MET og CD44 blev signifikant forøget i HT29 LM3 sammenlignet med HT29 LM1 (figur 3B). CD44 celleoverflade flowcytometrianalyse også demonstreret højere CD44-ekspression på overfladen af ​​HT29 Lm3 celler sammenlignet med parentale HT29-celler (figur 3C). Sammen antyder disse data, at øget metastatisk potentiale HT29 LM cellelinjer er forbundet med en stigning i CD44-ekspression.

(A) HT29 LM1, LM2, LM3 og parentale cellelinje blev dyrket i normalt medium i 24 h. Proteinekspression profiler blev analyseret ved Western-blot. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) IHC-analyse af CD44 og p-MET-ekspression i HT29 LM1 og HT29 Lm3 levermetastaser vævssnit. (C) Flowcytometrianalyse af CD44 geometriske gennemsnit fluorescensintensiteten i forældrenes HT29 og HT29 LM3 celler.

High Level af c-MET Aktivering i HT29 LM3 er uafhængig af CD44 Expression

Met er et væsentligt receptortyrosinkinase (RTK), der inducerer cancerceller proliferation, differentiering, migration og overlevelse [10]. Met er forbigående aktiveres efter HGF induktion og kræver specifikke CD44 isoformer for sin aktivering i forskellige kræftformer [11], [12]. For bedre at forstå interaktionen mellem MET aktivering og CD44 i den parentale HT29 og HT29 Lm3 celler, analyserede vi virkningerne af HGF-stimulering i begge cellelinier. Som vist i figur 4A, HGF-behandling forøger aktivering af c-MET i både parentale HT29 og HT29 LM3, med lidt højere aktivering i HT29 LM3 cellelinien sammenlignet med den parentale HT29-cellelinien. Vi næste transficerede HT29 Lm3 celler med siRNA mod alle CD44-isoformer og derefter behandlet disse celler med HGF. Figur 4B viser tilsvarende niveauer af c-MET-phosphorylering i nærvær eller fravær af HGF, hvilket antyder, at aktivering af c-MET-vejen i HT29 Lm3 celler er uafhængig af CD44-ekspression.

(A) Analyse af CD44, p-MET, c-MET, p-AKT og AKT ekspression i parental HT29 og HT29 LM3 efter HGF-stimulering (50 ng /ml; 5 min) ved Western blot. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) HT29 LM3 celler blev transficeret med CD44 siRNA og stimuleret med HGF (50 ng /ml; 5 min) 24 timer efter siRNA transfektion. (C) CD44-ekspression i HT29 LM3 og parentale HT29 levermetastaser vævssnit blev analyseret ved IHC. (D) HT29 Lm3 celler blev sorteret til høj og lav CD44-ekspression. Celler blev gated og sorteret for at indsamle 10% af cellerne med høj CD44-ekspression, og celler med lav CD44-ekspression. (E) Analyse af CD44, p-MET, og c-MET udtryk i forældrenes HT29, HT29 LM3 CD44-, og HT29 LM3 CD44 + celler. (F) Analyse af p-MET, c-MET, CD44, p-AKT, og AKT udtryk i forældrenes HT29, HT29 LM3 CD44-, og HT29 LM3 CD44 + celler efter HGF (50 ng /ml; 5 min). Stimulering

IHC-analyse af CD44 i HT29 LM3 vævssnit viste variabel CD44-ekspression i levermetastaser; klynger af levermetastaser med høj ekspression af CD44 ved siden af ​​metastaser med lav CD44-ekspression (figur 4C). For yderligere at analysere dette fænomen, brugte vi flowcytometri og cellesortering at isolere to populationer af celler baseret på celleoverfladen CD44 udtryk. To cellelinier med høj CD44-ekspression (HT29 LM3 CD44 +) og lav CD44-ekspression (HT29 LM3 CD44-) blev fastsat (figur 4D). CD44-ekspression i disse cellelinier blev bekræftet ved Western blot analyse. Både CD44 + og CD44- cellelinjer havde højere aktivering af c-Met sammenlignet med den parentale cellelinje (figur 4E).

For yderligere at bekræfte at aktivering af c-MET er uafhængig af CD44-ekspression i HT29 LM3 celle line, blev CD44 + og CD44- cellepopulationer stimuleret med HGF og analyseret ved Western-blot. Som vist i figur 4F, et tilsvarende niveau af c-MET-aktivering i CD44 + og CD44- celler blev observeret. Derfor viser vi, at niveauet af CD44-ekspression i

i

vivo

uddannet HT29 LM3 celler ikke korrelerer med c-Met aktivering niveauer ved dens naturlige ligand, HGF, yderligere bekræfter, at c- MET handler uafhængigt af CD44 i HT29 LM3 cellelinje.

Aggressiv Metastatisk Behavior af HT29 LM3 er forbundet med en øget evne til at klæbe til endotelceller, men er ikke Drevet af CD44 Expression

Kræft celle adhæsion til endotelceller er et vigtigt skridt i metastase og er kendt at være reguleret af CD44 i mange cancerceller [13]. HT29 LM3 og forældre HT29 cellelinjer blev mærket med Calcein AM og HT29 LM3 bindende evne til endotelceller blev evalueret med

i

vitro

vedhæftning assay. Vi viste, at HT29 Lm3 celler havde en forøget evne til at vedhæfte til endotelceller, sammenlignet med parentale HT29-celler (figur 5A). Disse resultater antyder, at den mere aggressive metastatiske fænotype af HT29 Lm3 celler er kan være resultatet af forøget cellulær adhæsion til endotelceller.

(A) Adhæsion af parental HT29 og HT29 Lm3 celler til HMVEC-L-celler blev vurderet som beskrevet i Materialer og Metoder. Data, der er vist som betyder fold ændringer i antallet af forældrenes HT29-celler knyttet til HMVEC-L-celler versus HT29 LM3 celler (* p 0,001). Repræsentative billeder viser vedhæftning af forældrenes HT29 og HT29 LM3 celler til HMVEC-L-celler. (B) Fluorescerende GFP billeddannelse af levermetastaser 4 uger efter milten injektion af HT29 LM3 CD44 + og HT29 LM3 CD44- celler (5 x 10

6; 100 pi PBS). IHC-analyse af CD44-ekspression i CD44 høj og CD44 lav CRC levermetastaser.

Vores

i

vitro

analyse af

i

vivo Salg valgt HT29 cellelinier identificeret en stigning i CD44-ekspression og c-Met-aktivering. Da adhæsion til endotelceller er et første afgørende hastighedsbegrænsende trin af hæmatogen CRC levermetastaser efter milten injektion og CD44-receptoren er kendt for at regulere cancerceller adhæsion [7], [12], vi næste evalueret rolle CD44 på CRC metastase

i

vivo

. HT29 LM3 CD44 + og HT29 LM3 CD44- celler blev injiceret i miltene af athymiske nøgne mus. Fire wks efter injektion, var fluorescerende GFP billeddannelse af CRC levermetastaser udført. Som vist i figur 5B, har niveauet af CD44-ekspression ikke have nogen væsentlig indvirkning på CRC levermetastaser. CD44-ekspression niveau i CD44 + og CD44- levermetastaser blev bekræftet med IHC farvning. Kollektivt, disse resultater tyder på, at overekspression af CD44 alene ikke er tilstrækkelig til at forbedre CRC levermetastaser og at andre veje sandsynligvis involveret.

Diskussion

Det mest ødelæggende aspekt af CRC er fremkomsten af ​​leveren metastaser, der er ansvarlig for hovedparten af ​​dødsfald som følge af denne sygdom. For således at forstå de molekylære mekanismer i metastase er en af ​​de vigtigste spørgsmål i cancerforskning. Ifølge begrebet tumor celle heterogenitet, meget metastatiske celler er til stede som en sub-population i en primær tumor [14]. På nuværende tidspunkt er det umuligt at identificere metastatisk og ikke-metastatiske celler i den primære tumor. I denne undersøgelse, vi udnyttet en

I

vivo

udvælgelse model til at identificere molekylære markører til forudsigelse af metastatisk potentiale CRC celler. Denne model af intravenøs kræftceller i milten, høste levermetastaser, og re-injektion i milten, skaber meget metastatiske cellelinier som bekræftet ved et større antal lymfeknuder og levermetastaser [15]. Ligeledes vores undersøgelse viste, at cellerne skabt gennem

i

vivo

valg cyklus gav omfattende levermetastaser og at aggressiv adfærd af disse celler er forbundet med ændringer i CD44-ekspression, c-MET aktivitet og øget evne CRC-celler til at adhærere til endotelceller. Derfor kan modellen af ​​

i

vivo

udvælgelse for metastatiske celler være et nyttigt redskab til at studere genetiske forandringer i celler, når de erhverver den metastatiske fænotype. Desuden udnyttelsen af ​​denne model giver mulighed for en bedre forståelse af de mekanismer, der driver kræft progression og kan bruges som et redskab til at opdage og udvikle potentielle terapeutiske mål for CRC metastaser.

c-MET og CD44 er co -expressed i en række cancere, såsom pankreascancer og CRC [16], [17]. Kræft i bugspytkirtlen celler med en høj ekspression af både c-MET og CD44 blev vist at have en større tumorigent potentiale [17]. Endvidere ekspression af begge proteiner er blevet korreleret med en kortere patientoverlevelse periode i CRC [3], og en nylig undersøgelse fra vort laboratorium viste, at CD44 og c-MET-aktivering er forbundet med en stigning i CRC metastase [18]. I overensstemmelse med disse resultater, at resultaterne af vores aktuelle undersøgelse viser, at en stigning i både ekspressionen af ​​CD44 og aktiveringen af ​​c-MET korrelerer med en stigning i den metastatiske potentiale af HT29 LM3 cellelinie. CD44 og c-MET samarbejde, og deres interaktioner på plasmamembranen, føre til aktivering af downstream signalveje, der fremmer udviklingen af ​​kræft [19] – [21]. På den anden side har adskillige undersøgelser vist, at aktiveringen af ​​c-MET er uafhængig af CD44 [22], [23]. Vores resultater antyder, at i HT29 LM3 cellelinien, CD44 og c-MET handle uafhængigt i nærvær eller fravær af HGF, en c-MET ligand. Uoverensstemmelser mellem undersøgelser kunne forklares ved forskelle i cellelinjer brugt og viser, at omfanget af samspillet mellem CD44 og c-Met kan celletype specifik. Da begge proteiner er blevet associeret med en dårlig prognose i et væld af cancere, den yderligere undersøgelse af deres interaktion i metastatiske cellelinier er kritisk vigtigt og kan føre til nye terapeutiske mål.

For bedre at forstå den rolle, CD44 vi udnyttede to populationer af HT29 afledte celler, CD44 + og CD44-. Interessant nok vores data antyder, at CD44 er ikke nøglen protein driver HT29 afledte celler til at blive mere metastatiske og at de fleste sandsynligvis, c-Met aktivering eller andre veje forbedre CRC levermetastaser. I vores model, CD44 og c-MET signal uafhængigt, hvilket indikerer, at c-MET signalering ikke forringes CD44- celler og fortsætter med at drive metastaser. Derudover er der mange isoformer af CD44, på grund af alternativ splejsning, der spiller forskellige roller i metastaser, hvilket kan forklare forskellen mellem de roller CD44 i metastaser. Hver isoform spiller en anden rolle i cancerceller og visse kræftformer kun udtrykker en af ​​isoformerne, mens andre udtrykker multiple isoformer [7]. Derfor bestemme den nøjagtige funktion, CD44 spiller i hver kræft cellelinje bliver stadig vigtigere for udnyttelsen af ​​CD44 som et terapeutisk mål.

Konklusioner

En grundig forståelse af de genetiske mekanismer, der initierer metastatisk kaskade og fremme CRC metastase progression i leveren er vigtig for udviklingen af ​​hidtil ukendte anticancer- behandling. Pure klonale populationer af isolerede lever-tropiske metastatiske celler tilladt os at selektivt og sammenligne biologiske mekanismer medierer CRC metastase til leveren. Tilsammen vores resultater viser, at den aggressive metastatisk fænotype af

i

vivo

valgt HT29 cellelinie er forbundet med overekspression af CD44 og aktivering af c-MET. Vi viser, at c-Met aktivering er CD44 uafhængig på HGF stimulering og bekræfter, at CD44-ekspression i HT29 LM3 cellelinje er ikke ansvarlig for stigningen i metastatisk penetrans i HT29 LM3 cellelinje. Vigtigt er det, vi viser, at modellen af ​​

i

vivo

udvælgelse for CRC metastatiske celler udgør et værdifuldt redskab til at identificere de mekanismer, der bidrager til levermetastaser i CRC og identificere molekylære veje for en målrettet terapi af CRC levermetastaser.

tak

forfatterne takker Donna Gilbreath og Heather Russell-Simmons om hjælp med manuskriptet forberedelse, Jennifer Strange og Greg Bauman for hjælp med FACS, og Dana Napier for hendes arbejde med den Markey Biospecimen og Tissue indkøb Shared Resource Facility.