PLoS ONE: Mand Kimcelle-Specifik RNA bindende protein RBMY: en ny Oncogene Forklare Mand Overvægt i leverkræft

Abstrakt

Mand køn er en risikofaktor for udvikling af hepatocellulært carcinom (HCC), men de mekanismer er ikke fuldt forstået. RNA bindende motiv genet på Y kromosomet (RBMY), der koder for en mandlig kimcelle-specifik RNA splejsning regulator under spermatogenese, er aberrerende aktiveret i humane mandlige levercancere. Denne undersøgelse undersøgte

in vitro

onkogen effekt og den mulige mekanisme RBMY i human hepatoma HepG2 og dets

in vivo

virkning med hensyn til lever fra menneske og transgene mus. RBMY ekspression i HepG2-celler blev slået af RNA-interferens og cancercellen fænotypen blev karakteriseret ved blød-agar-kolonidannelse og følsomhed over for hydrogen-peroxid-induceret apoptose. Resultaterne viste, at RBMY knockdown reduceret transformationen og anti-apoptotiske effektivitet HepG2-celler. Ekspressionen af ​​RBMY, androgen receptor (AR) og dens inhiberende variant AR45, AR-målrettede gener insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1) og insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein 3 (IGFBP-3) blev analyseret ved kvantitativ RT -PCR. Opregulering af AR45 variant og reduktion af IGF-1 og IGFBP-3-ekspression blev kun fundet i RBMY knockdown celler. Desuden RBMY positive menneskelige mandlige HCC udtrykte lavere AR45 sammenlignet med RBMY negativ HCC væv. De onkogene egenskaber RBMY blev yderligere vurderet i en transgen musemodel. Lever-specifikke RBMY transgene mus udviklede hepatiske forstadier til kræft, adenom og HCC. RBMY også accelereret kemisk carcinogen-induceret hepatocarcinogenese i transgene mus. Kollektivt, disse resultater tyder på, at Y-kromosom-specifikke RBMY sandsynligvis er involveret i reguleringen af ​​androgen receptor aktivitet og bidrager til mandlige overvægt af HCC

Henvisning:. Tsuei DJ, Lee PH, Peng HY, Lu SL, Su DS, Jeng YM et al. (2011) Mand Kimcelle-Specifik RNA bindende protein RBMY: en ny Oncogene Forklare Mand Overvægt i leverkræft. PLoS ONE 6 (11): e26948. doi: 10,1371 /journal.pone.0026948

Redaktør: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: 27. juni, 2011; Accepteret: 6 oktober 2011; Udgivet: November 4, 2011

Copyright: © 2011 Tsuei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud NHRI-EX93-117BN, NHRI-EX95 (96, 97, 98) -9418BI fra National Health Research Institute of Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er en af ​​de førende kræftformer i [1] verden. De vigtigste identificerede risikofaktorer omfatter hepatitis B-virus (HBV) eller hepatitis C-virus (HCV) -infektion, eksponering for aflatoksiner, og hankøn [2]. Den mandlige-til-kvinde-forhold af HCC sigende gennemsnit 4-5:1 og er især højere i HBV-relateret HCC (5-11:1) [3]. Epidemiologiske undersøgelser viste, at et forhøjet niveau af serum testosteron var signifikant associeret med en øget risiko for HCC hos mandlige HBV-bærere [4]. Imidlertid er mandlig overvægt med et forhold på 3-4:1 også observeret i barndommen HCC med tidlig debut, så unge som 10 år før puberteten, og kan ikke forklares direkte af androgen effekt [5], [6] .

androgen receptor (AR) har vist sig at bidrage til den mandlige præference hepatocarcinogenese i HBV og HCV-bærere [7], [8]. AR protein medierer virkningen af ​​androgener og kan fremme udviklingen af ​​mandlige HCC i mus [9]. Efter binding til ligander, AR danner homodimerer og aktiverer transkriptionen af ​​målgener, såsom insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1) og insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein 3 (IGFBP-3) [10], [11]. AR-funktionen er reguleret af co-aktivatorer eller co-repressorer [12], den hæmmende isoform AR45 [13], og kortere CAG-gentagelser (som fører til højere AR aktivitet) i det første exon af AR-genet [14]. HBV X-proteinet er et velkendt AR co-aktivator [15], [16] og blev rapporteret at bidrage til mandlige dominans i HBV-relateret menneskelige mandlige HCC [17]. I ikke-HBV HCC har andre ukendte kønsspecifikke faktorer der fremmer HCC dannelse hos mænd blevet et stort problem.

dysregulering af Y-kromosom-specifikke gener er blevet fundet i mandlige HCC, men deres roller i den mandlige dominans af HCC hidtil ikke er blevet løst [18], [19]. RNA-bindende motiv genet på Y kromosomet (RBMY) er et mandligt kim cellespecifik ekspression gen indeholdende motiver RNA anerkendelse ved N-terminalen [20]. Dens udtryk er begrænset til kernerne i mandlige kønsceller og sletning kan forårsage anholdelsen af ​​kønsceller på den meiotiske fase af spermatogenesen [21]. RBMY fungerer som en mandlig kim cellespecifik splejsning regulator ved at modulere aktiviteten af ​​konstitutivt udtrykte splejsningsfaktorer [22], [23]. Dens afvigende aktivering detekteres i omkring 1/3 af mandlige HCC og hepatoblastoma tumorvæv, men ikke i parrede ikke-tumor levervæv, kvindelige HCC, eller andre typer af cancere [24]. Selvom RBMY kan interagere med AR co-aktivator Sam68 [25], [26], dens rolle i AR signalvejen er endnu ikke blevet rapporteret.

Den foreliggende undersøgelse har til formål at evaluere transformation og anti-apoptotisk effekt af RBMY i humane hepatomaceller, og hepatocarcinogent effekt af RBMY i transgene mus, og at undersøge de mulige underliggende molekylære mekanismer. Vores resultater

in vitro

,

in vivo

, og i klinisk menneskelige mandlige HCC væv tyder på, at RBMY kan øge AR aktivitet og hepatocarcinogenese ved at reducere ekspressionen af ​​AR hæmmende variant AR45.

Materialer og metoder

Menneskelig vævsprøver

Parret tumor og ikke-tumor levervæv blev indsamlet fra 66 kirurgiske HCC mandlige patienter (44 HBV-relateret, 10 HCV-relateret, 5 HBV /HCV-relateret, og 7 ikke-HBV /HCV-relateret) på National Taiwan University Hospital (NTUH) i 2007. Alle kliniske prøver blev opnået efter godkendelse af Research etiske komité for NTUH (NTUHREC godkendelse nr 9361701139) .

Cell kultur og transfektion

de humane hepatocellulært carcinom cellelinier HepG2 og Hep3B blev oprindeligt opnået fra Bioresource Indsamling og Research center (BCRC, Taiwan). HepG2, Hep3B og Huh7 (fra Dr. Hui-Lin Wu af NTUH Hepatitis Research Center) celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (HyClone, Logan, UT). Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol.

RNA-interferens

pSUPER-baserede strategi blev anvendt til at Knockdown RBMY ekspression. RBMY lille hårnåle-RNA (shRNA) blev genereret ved ligering af tre 19-nukleotidsekvenser specifikke for RBMY SRGY regionen (exoner 7-10) i vektoren (OligoEngine, Inc., Seattle, WA). Sekvenserne er vist i tabel S1. Cellerne blev dyrket til 80% konfluens til transfektion og transficerede celler blev selekteret med 300 ug /ml geneticin.

Semi-kvantitativ RT-PCR og kvantitativ PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Tyskland) og udsat for omvendt transkription under anvendelse af SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen). Primersekvenserne og reaktionsbetingelser er vist i tabel S1. Kvantitativ PCR blev udført under anvendelse af TaqMan Gene Expression Assay mix for target RBMY (Hs00359074_m1) eller endogen kontrol hypoxanthin phosphoribosyltransferase 1 (Hs99999909_m1) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kvantitativ PCR for AR, AR45, IGF-1, IGFBP-3, og endogen kontrol S26 blev udført under anvendelse af MasterMix Plus for SYBR Green (Applied Biosystems). Amplification signaler blev opdaget af en ABI prism7700 eller 7500 Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

blød agar og overlevelse analyser

For blød agar assay, 2500 brønd i vækstmedium indeholdende 0,35% agarose blev anbragt på plader med 6 brønde med 0,5% agarose base. Efter 14 dages inkubation blev kolonierne farvet med 0,005% krystalviolet ved stuetemperatur i 1 time og talt for hver plade.

I overlevelse assay HepG2 celler transfekteret med shRNA plasmider blev behandlet med 0,5 eller 0,75 mM hydrogenperoxid i 24 timer for at inducere apoptose. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af celleproliferation Kit I (MTT) (Roche Diagnostics, Tyskland). Absorbans blev målt ved 590/690 nm ved anvendelse af en MRX-mikropladelæser (Dynex Technologies, Inc., VA) og celleoverlevelse blev udtrykt som absorbans i forhold til den for ubehandlet kontrol.

Bestemmelse af androgenreceptor CAG-repeat længde i humane HCC væv

den genomiske region, der indeholder den CAG trinukleotid repeat var PCR-forstærket og mærket med FAM, udsat for ABI 3700 Genetic Analyzer, og scorede bruge GeneMapper software (Applied Biosystems). Standardkurven at beregne CAG repeat nummer var baseret på fire kontrolprøver med CAG repeat tal fra 17 til 35. Sekventering analyse blev udført på HCC væv fra 66 forsøgspersoner med CAG gentage numre ud af standardkurven.

Etablering af RBMY transgene mus og opfølgning histopatologi

RBMY kodende sekvens blev forstærket og sub-klonet ind i pBS-HCRHPI-en vektor med en lever-specifik α1-antitrypsin-promotor. Konstruktionen blev fordøjet med

Spel

at generere en transgen fragment til injektion i pro-kerner af befrugtede æg af FVB /N-mus. Den institutionelle Animal Care og brug Udvalg for College of Medicine og College of Public Health, National Taiwan University godkendt dyret pleje og eksperimentelle procedurer (IACUC godkendelse nr 20.060.217).

Musene blev aflivet 4-24 måneder gamle. Deres lever blev fikseret i 10% neutral-pufret formalin eller indlejret i OCT-forbindelse (Sakura Finetek, Torrance, CA). Paraffinsnit blev farvet med hematoxylin og eosin til histopatologisk undersøgelse, mens frosne snit blev farvet med olie rød O til påvisning ophobning fede dråbe. Sværhedsgraden af ​​steatose blev estimeret ved procentdelen af ​​positiv farvning hjælp af en morfologisk semikvantitativ metode og klassificeret i klasse 1 ( 33%), grad 2 (33-66%), eller grad 3 ( 66%) som tidligere beskrevet [27].

diethylnitrosamin behandling og histopatologi i mus

i den kemiske kræftfremkaldende model, 14 dage gamle RBMY transgene eller kontrol mus tilfældigt fik en enkelt intraperitoneal injektion af diethylnitrosamin ( DEN) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) ved 10 mg /kg legemsvægt eller saltvand opløsning af ens volumen, henholdsvis. Musene blev aflivet efter 26 og 34 uger efter behandling. Desuden blev tidligere aflivning 14 uger særligt er blevet vedtaget for hanmus, der var angiveligt meget modtagelige for DEN-induceret hepatocarcinogenese. Målinger af tumormasser synlige på leveren overflade blev registreret. Mikroskopiske læsioner blev talt fra to repræsentative sektioner (50 um afstand) af hver mus leveren.

Immuno-histokemi

Immuno-histokemisk farvning for RBMY antigen blev udført på frosne leversnit. Efter antigen hentning og quenching af endogen peroxidation blev kanin anti-SRGY antistof [24] inkuberet med sektioner på 1:400 fortynding natten over ved 4 ° C. HRP-DAB blev anvendt som et detektionssystem (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant, mens en

s

værdi mellem 0,05 og 0,1 blev betragtet som havende en tendens til forskel

Resultater

RBMY knockdown reduceret transformation og antiapoptotiske effektiviteten af ​​HepG2-celler

indbygget udtrykte RBMY i human hepatoma HepG2 blev forstyrret af shRNA specifikt rettet til SRGY domæne RBMY. Kvantitativ RT-PCR viste, at 95% af RBMY transkripter blev inhiberet i pSUPER-680 og pSUPER-914 transficerede HepG2-celler, hvorimod pSUPER-778 havde nogen knockdown virkning sammenlignet med vektor transficerede celler (figur 1A.). Immuno-histokemi analyse bekræftede yderligere effektiv knockdown af RBMY i pSUPER-680 og pSUPER-914 transficerede celler (fig. 1B). De vektorbaserede kun transfektanter udtrykte tilsvarende niveauer af RBMY forhold til forældrenes HepG2-celler og blev derfor anvendt som kontrol for

in vitro

celle eksperimenter.

(A) Kvantitativ RT-PCR-analyse af RBMY i parental (G2), vektorplasmid (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, og pSUPER-914 plasmider transficeret HepG2-celler. (B) immunhistokemisk farvning af HepG2 og de tilsvarende transfektanter for RBMY protein. (C) Colony dannelse af forældre eller transfekterede HepG2 celler på blød agar. (D) Procentdel af cellelevedygtighed ved MTT assay indlæg 0,5 eller 0,75 mM hydrogenperoxid (H

2O

2) behandling. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD i fire uafhængige forsøg. *

s

0,05; **

s

. 0,01

forankring uafhængighed assay viste, at RBMY-udtrykkende HepG2-celler havde stærkere klonogene evne i forhold til RBMY Knockdown celler (

s

0,0001, en-vejs ANOVA). The Colony antal pSUPER-680 og pSUPER-914 transficerede celler på blød agar blev reduceret med 45% og 40%, sammenlignet med tomme vektor transfektanter (Fig. 1C). Colony dannelsen af ​​RBMY udtrykker pSUPER-778 transfektanter var også signifikant højere end Knockdown transfektanter (680 vs. 778,

s

0,0001; 914 vs. 778,

s

= 0,001).

anti-apoptotiske evner RBMY-udtrykkende og knockdown HepG2 transfektanter blev analyseret ved overlevelse assay efter hydrogenperoxidbehandling. Sammenlignet med tomme vektor transfektanter blev levedygtigheden af ​​pSUPER-680 shRNA transfektanterne med 0,5 eller 0,75 mM hydrogenperoxid behandling reduceret med 46% og 53% (

s

0,05), henholdsvis og de af pSUPER- 914 transfektanter blev reduceret med 34% og 54% (

s

0,05), (fig 1D.). Levedygtighed RBMY-udtrykkende transfektanter pSUPER-778 var 16-19% lavere end for vektor transfektanter (

s

= 0,5).

RBMY knockdown forøget ekspression af hæmmende androgen receptor variant AR45 og nedsat AR trans-aktivering aktivitet, mens RBMY overekspression undertrykt AR45 niveauer Salg

Det er blevet rapporteret, at Sam68, som et alternativ splejsning regulator og interagerende protein af RBMY, kan modulere AR-reguleret transkriptionel aktivitet i prostatacancerceller [ ,,,0],25]. For at undersøge, om udtrykket forholdet mellem AR og dens hæmmende isoform AR45 blev ramt af RBMY blev semi-kvantitativ RT-PCR udført for RBMY-udtrykkende eller knockdown HepG2-celler. Densitometri analyse viste en tredobling af AR45 niveauer i RBMY knockdown transfektanter (pSUPER-680 og pSUPER-914) i forhold til vektor-kun (VC) transfektanter (

s

0,05) (. Fig 2A) . AR45 niveauer i parentale HepG2-celler og pSUPER-778 transfektanter svarede til dem i vektor transfektanter. Der var ingen signifikant ændring i AR niveauer mellem RBMY-udtrykkende og knockdown-celler. De AR /AR45 nøgletal i RBMY knockdown transfektanter (pSUPER-680 og pSUPER-914) blev reduceret med 2 til 2,5 gange i forhold til vektor-kun (VC) transfektanter (fig. 2A).

(A ) Semi-kvantitativ RT-PCR og densitometrisk analyse af RBMY, AR og AR45 i parental (G2), vektorplasmid (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, og pSUPER-914 plasmider transficeret HepG2-celler. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse af RBMY, AR45, IGF-1 og IGFBP-3 i RBMY knockdown transfektanter (680 og 914) og ikke-knockdown transfektanter (VC og 778). Værdier blev normaliseret mod den interne kontrol S26. Dataene er middelværdier ± SD foldes over vektor kontrol (VC). (C) Kvantitativ RT-PCR-analyse af AR og AR45 i vektor kontrol eller RBMY transficerede Hep3B og Huh7 celler. Dataene er middelværdier ± SD foldes over vektor kontrol (VC). (D) Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse af RBMY i tumoren (T) og ikke-tumor (N) dele af humane mandlige HCCs. S26 er en intern kontrol og Alfaføtoprotein (AFP) som en tumor markør. (E) immunhistokemisk farvning af nuklear RBMY protein i HCC væv kun (× 400). (F) AR og AR45 mRNA-ekspression i 7 RBMY-udtrykkende og 5 ikke-udtrykkende humane mandlige HCC væv. Resultaterne var gennemsnittet af tre forskellige eksperimenter. *

s

0,05; **

s

. 0,01

Som AR45 blev rapporteret at undertrykke AR trans-aktivering aktivitet [13], udtryk for AR målgener IGF-1 og IGFBP-3 blev vurderet og sammenlignet mellem RBMY-udtrykke og knockdown HepG2-celler. Kvantitativ RT-PCR-analyse afslørede, at RBMY knockdown celler udtrykte høje niveauer af AR45 men signifikant reduceret IGF-1 (

p Salg 0,05) og IGFBP-3 (

p

0,01) niveauer (fig. 2B), der viser, at RBMY knockdown korreleret med øget AR45 udtryk og undertrykt AR aktivitet.

desuden undertrykkelse af AR45 udtryk ved overekspression RBMY også blev demonstreret i Hep3B og Huh7 celler. AR45 niveauer blev reduceret til 42% i RBMY transficerede Hep3B og 60% i Huh7 celler (

s

0,05) (. Figur 2C). Der var ingen signifikant ændring i AR niveauer mellem RBMY-transficeret og vektor-transficerede celler.

RBMY udtryk korreleret med reducerede AR45 niveauer og kortere AR-CAG-gentagelser i menneskelig mandlige HCC væv

Baseret på de ovennævnte resultater viser, at RBMY ekspression blev forbundet med lavere AR45 niveauer i HepG2-celler, blev AR og AR45 udtryk yderligere sammenlignet i RBMY-udtrykkende og ikke-udtrykkende humane mandlige HCC væv. Semi-kvantitativ RT-PCR viste, at RBMY blev påvist i 35% (23/66) mandlige HCC tumorvæv, som blev bekræftet af ekspression af tumor markør Alfaføtoprotein (fig. 2D). Immunhistokemisk farvning bekræftede nukleare ekspression af RBMY kun i HCC tumorvæv (fig. 2E) .Den positive rate af RBMY transkripter var 36% (16/44) i HBV-relateret HCC, 40% (4/10) i HCV -relaterede HCC, 20% (1/5) i HBV /HCV-relaterede HCC, og 29% (2/7) ikke-viral relateret HCC. Der var ingen påviselige RBMY udskrifter eller proteiner i ikke-tumor dele af de 66 HCC levervæv.

udtryk for AR og AR45 variant i syv RBMY-udtrykke og fem ikke-udtrykkende mandlige menneskelige HCC væv blev bestemt ved 2exp

(- ΔΔCt) metode til relativ kvantificering. De mRNA niveauer i HCC væv blev normaliseret mod den interne kontrol S26 og sammenlignet med niveauerne i vektor-only HepG2 transfektanter. Markant lavere niveauer af AR45 blev påvist i RBMY udtrykker mandlig HCC sammenlignet med ikke-RBMY udtrykker HCC væv (

s

0,05) (fig 2F.), Hvilket afspejler RBMY undertrykkelse på AR45 transskription. Der var ingen signifikant forskel på AR niveauer mellem RBMY-udtrykkende og ikke-udtrykkende HCC væv.

Til yderligere vurdering associationen mellem RBMY og AR-aktivitet, det CAG-repeat længde af AR-genet, en AR aktivitets- associeret faktor, blev bestemt i RBMY-udtrykkende eller ikke-udtrykkende mandlige humane HCC væv. Den gennemsnitlige CAG-repeat længde i 49 HBV-relaterede mandlige HCC væv (RBMY positiv /negativ = 17/32) var signifikant kortere hos patienter med end i dem uden RBMY udtryk (21,0 ± 2,8 vs. 22,9 ± 2,8,

s

0,05). Foreningen af ​​CAG-repeat længde og RBMY udtryk viste en tendens til forskel (21,4 ± 2,54 vs. 22,7 ± 2,75,

s

= 0,064), når ikke-HBV HCC væv blev inkluderet (RBMY positiv /negativ = 23 /43).

RBMY transgene mus udviklede hepatisk fede forandring og neoplastiske læsioner

transgene mus med lever-specifikke udtryk for RBMY blev oprettet (fig. 3A). Western blot viste lav RBMY udtryk i transgene grundlæggerne RF1 og RF2, men højt RBMY niveau i RF4 og RF6 (fig. 3B). Der var ingen transgene RBMY detekteret i hjerne, hjerte, nyre, lunge, milt, mave, eller testis ved RT-PCR (fig. 3C), hvilket indikerer en lever-specifik ekspression af RBMY i transgene mus. Kvantitativ RT-PCR-resultater yderligere understøttet RF4 som en høj ekspression stifter (fig. 3D). IHC-farvning viste, at RBMY hovedsagelig var placeret i kernen af ​​transgene mus levervæv (fig. 3E).

(A) Genetisk kort over 4,2 kb RBMY transgen, herunder en hepatisk locus kontrolregion fra apolipoprotein E gen (ApoE-HCR), lever-specifik α1-antitrypsin-promotoren (hAAT-Pr), trunkeret faktor IX intron (hFIX-IA), og bovint væksthormon-polyadenyleringssignal (BGHpA). (B) Western blot analyse af RBMY fremstilles af levere individuelle transgene (RF1-6, RF2-265, RF4-89, RF6) og kontrol (NT1, NT2) mus. (C) Lever-specifikt udtryk for RBMY i transgene mus ved RT-PCR ved hjælp GAPDH som en intern kontrol. Uden template RNA (RTC) eller cDNA (NTC) var negative kontroller. (D) Ekspression af RBMY i transgen (RF1-176, RF1-278, RF2-62, RF2-390, RF4-19, RF4-21) og kontrol (NT1, NT2) mus ved kvantitativ RT-PCR. (E) immunhistokemisk farvning af transgene (RF4-89) og kontrol (NT) mus levervæv for RBMY. Transgen mus viste nuklear farvning for RBMY (× 400). (F) Olie rød farvning viste nedsat fede ændringer i kontrol mus (NT1 og NT2), lav RBMY (RF2-62 og RF2-390) og høj RBMY (RF4-19 og RF4-21) transgene mus (× 400).

Hepatocellulære ændringer blev analyseret fra leveren sektioner af 79 transgene mus og 30 kontrol FVB /N-mus. Høje RBMY-udtrykkende RF4 stiftere (RF4-19 og RF4-21) vises mere alvorlig fede indskud end lave RBMY-udtrykkende RF2 stiftere (RF2-62 og RF2-390) (fig. 3F). I RBMY transgene mus, forekomsten af ​​udvikling af moderat til svær leversteatose var 60-89% (gennemsnit 73%), som var ~2.5 gange højere end den for kontrolgruppen (gennemsnitlig 30%,

p

0,001) (tabel 1). RBMY udtryk steg ikke fibrose eller cirrose i transgene mus model.

Blandt de 45 transgene mus, der var ældre end 15 måneder, tre af dem udviklede hepatiske kræft (tabel 1). En knude (1 mm i diameter) blev fundet i den højre lap af RF1-278 mus (15 måneder) og histologisk undersøgelse afslørede en præ-neoplastisk læsion (fig. 4A-C). Den RF4-21 mus (24 måneder) havde en adenom knude (4 mm i diameter) i højre lap (fig. 4D-F), mens RF2-390 (21 måneder) moderat havde differentieret HCC (6 mm i diameter) i median lobe (fig. 4G-I). blev observeret Medium-til-svær fede ændringer i tumor dele af de tre mus. Ingen af ​​17 kontrolmus ældre end 15 måneder udviklede hepatiske kræft.

(A-C) Pre-neoplastisk læsion i en 15-måneder gamle hanmus RF1-278. (D-F) Adenom (AD) i en 24-måneder gammel hunmus RF4-21. (G-I) HCC i en 21-måneder gammel hanmus RF2-390. Forstørrelse: B, E, H, × 50; C, F, I, × 200.

RBMY accelereret diethyl nitrosamin-induceret hepatocarcinogenese

De tumorfremmende effekter af RBMY blev yderligere vurderet i den kemiske carcinogenese model. På grund af den høje følsomhed over hanmus til DEN blev mandlige grupper aflivet 14 uger efter behandling. En højere forekomst af kræft blev observeret i transgene hanmus sammenlignet med den i kontrolgruppen (12/14 vs. 5/12,

s Restaurant 0,05). På 34 uger efter behandling, mandlig RBMY transgene mus udviklede flere tumorer med diameter 3 mm i forhold til kontrolgruppen (52 vs. 19,

s

0,05) (Tabel 2). Der var også en højere forekomst af trabekulær kræft i kvindelige transgene mus sammenlignet med kontrolgruppen efter 26 uger (7/9 versus 1/10,

s Restaurant 0,01) og 34 uger (9/10 vs. 3/13,

s

. 0,01) indlæg DEN behandling (tabel 2)

diskussion

RBMY betragtes som en testikel-specifik splejsning faktor i spermatogenese [22], [23]. Det er blevet rapporteret at blive udtrykt i mere end en tredjedel af humane mandlige HCC væv [24]. Denne undersøgelse viser endvidere, at RBMY knockdown korrelerer med øget AR45 variant ekspression og reduceret forankringsuafhængig vækst og anti-apoptotiske evner human hepatoma HepG2. AR45 isoform er rapporteret at virke som en dominant negativ inhibitor af AR funktion gennem dannelsen af ​​AR-AR45 heterodimerer [13]. Vi viser også, at RBMY knockdown reducerer AR trans-aktivering aktivitet i HepG2-celler. Derfor kan RBMY fungere som en han-specifik onkogen og øge risikoen for menneskelige mandlige hepatocarcinogenese gennem regulering af AR genekspression og aktivitet.

AR-genet i stedet for androgen, har vist sig at spille en nøglerolle i den mandlige overvægt af HCC i en transgen HBV musemodel [17]. Humant AR er sammensat af N-terminale transaktiveringsdomæne, en centrale DNA-bindende domæne, og en C-terminal ligandbindende domæne. AR45, en naturligt forekommende variant af human androgenreceptor, mangler det N-terminale domæne er nødvendig for fuld ligand aktiveret transkriptionel aktivitet [13]. Den inverse sammenslutning af AR og AR45 udtryk er blevet observeret i humane hjerte og muskelvæv med de højeste niveauer af AR45 og de laveste niveauer af AR [13]. I denne undersøgelse RBMY knockdown stiger ekspression af AR45 i human hepatoma HepG2-cellelinje, mens RBMY overekspression reducerer AR45 niveauer i Hep3B og Huh7 cellelinier. Endvidere RBMY-positive humane mandlige HCC væv udtrykker lavere AR45 niveau sammenlignet med RBMY-negative HCC. Nedreguleringen af ​​AR målgener IGF-1 og IGFBP-3 i RBMY knockdown HepG2-celler illustrerer yderligere forstærkende virkning af RBMY på AR trans-aktivering aktivitet. HBV X-proteinet er blevet rapporteret at fungere som en virus-kodende AR co-aktivator, der væsentligt bidrager til den mandlige dominans af HBV-relateret humant HCC [16]. Det kan dog ikke forklare ulighederne mellem kønnene ikke-HBV-relateret HCC. Tilsvarende forhold mellem RBMY ekspression i HBV-relateret, HCV-relaterede, og non-viral-relaterede mandlige HCCs antyder, at RBMY kan være en fælles risikofaktor stigende mandlige modtagelighed for leverkræft. Vores resultater tilvejebringe en hidtil ukendt mekanisme fortolke den mandlige dominans i alle typer af levercancere gennem Y-kromosomet-specifikke RBMY genet.

AR45-specifikke exon 1B ligger mellem den første og den anden exon af AR-genet. Der er foreslået to hypotetiske reguleringsmekanismer for AR45 syntese, herunder en transkriptionel kontrol ved en hidtil ukendt promotor opstrøms for exon 1B eller en alternativ splejsning begivenhed [13]. RBMY fungerer som et testis-specifik splejsning regulator og angiveligt interagerer med RNA-bindende protein Sam68 i testiklerne [26]. Sam68 er et allestedsnærværende splejsning regulator og også en nedstrøms mål af Src signalvejen [28], [29]. Det er således langt uklart, om eller ikke RBMY enten direkte regulerer AR45 transskription /splejsning eller via interaktion med Sam68. Desuden er Sam68 betragtes som en AR co-aktivator, som det kan modulere AR transkriptionsaktivitet i prostatacancere [25]. Src-signalvejen også har vist sig at være kritisk for HBV X-protein-medieret forøgelse af AR funktion [30]. Hvorvidt RBMY er involveret i Sam68-medierede Src signalvejen er et interessant spørgsmål, der skal undersøges i fremtiden.

onkogenicitetsstudie af RBMY er blevet vist ved transformationen af ​​musen fibroblast cellelinje NIH3T3 [24]. Denne undersøgelse viser endvidere, at RBMY forbedrer leveren carcinogenese

in vivo

i en transgen musemodel. De rapporterede spontan lever tumor vækstrater er 3% og 0% i 24 måneder gamle mandlige og kvindelige vildtype FVB /N-mus, henholdsvis [31]. RBMY transgene mus udviklede levertumorer i 8,7% (2/23) af mandlige og 4,5% (1/22) af hunmus ældre end 15 måneder, som er mere end to gange højere end de spontane lever tumor hændelser.

i modellen af ​​dEN-induceret hepatocarcinogenese, er betydningen af ​​RBMY forstærkende virkning på kræft læsion dannelse observeret så tidligt som 14 uger efter behandlingen i mandlige transgene mus. Desuden større tumorer (diameter ≥3 mm) udviklet i transgene hanmus på 34 uger, hvilket indikerer RBMY enhancement på DEN-induceret hepatocarcinogenese. Selv kvindelige RBMY transgene mus har også signifikant øget forekomst af kræft i både 26 og 34 uger efter behandling. Selvom vildtype hunmus er resistente til DEN carcinogenese på grund af den beskyttende virkning af østrogen-medieret inhibering af IL-6-produktion af Kupffer-celler [32], [33], resultaterne her demonstrere levering og aktivering af en han-specifik RBMY gen accelereret leverkræft udvikling selv i kvindelige transgene mus.

Som konklusion, RBMY knockdown fremkalder hæmmende på transformation og antiapoptotiske evner af menneskelige hepatoma HepG2. Den inhiberende virkning af RBMY på AR45 niveauer demonstreres i RBMY knockdown HepG2 celler og RBMY over-udtrykkende Hep3B og Huh7 celler. Derfor kan den onkogene mekanisme RBMY være knyttet til dens regulering af AR trans-aktivering aktivitet ved forøgelsen af ​​AR45 variant, inhibitoren af ​​AR. AR45 ekspression påvist i RBMY-udtrykkende human mandlig HCC er også betydeligt lavere sammenlignet med ikke-udtrykkende HCC væv. Endvidere RBMY udviser tumor-fremmende aktivitet

in vivo

i en transgen musemodel og accelererer udviklingen af ​​neoplastiske læsioner i en diethylnitrosamin-induceret hepatocarcinogenese dyremodel. Den kræftfremkaldende effekt i hepatoma cellelinje og menneskelige HCC væv, sammen med

in vivo

tumorpromotion i de transgene mus, en hidtil ukendt rolle RBMY som en mandlig-specifikke onkogen at forklare den mandlige overvægt af leverkræft.

Støtte oplysninger

tabel S1.