PLoS ONE: Distinct Expression Niveauer og Mønstre af Stem Cell Marker, aldehyddehydrogenase Isoform 1 (ALDH1), i Human epitelcancer

Abstrakt

Aldehyd dehydrogenase isoform 1 (ALDH1) har vist sig nyttig til identifikation af cancer stamceller. Men vores viden om udtryk og aktivitet ALDH1 i fælles epitelial kræft og deres tilsvarende normale væv er stadig stort set fraværende. Derfor kendetegnet vi ALDH1 ekspression i 24 typer af normale væv og en stor samling af epiteliale tumorprøver (seks cancertyper, n = 792) ved immunhistokemisk farvning. Brug af ALDEFUOR analysen blev ALDH1 aktivitet også undersøgt i 16 primære tumor prøver og 43 etablerede epiteliale kræftceller. Desuden blev en ovariecancer transgen musemodel og 7 murine ovarian cancer cellelinjer analyseret. Vi fandt, at ekspressionsniveauerne og mønstre af ALDH1 i epiteliale cancere er bemærkelsesværdigt udtalte, og de korrelerer med deres tilsvarende normale væv. ALDH1 proteinekspressionsniveauer er positivt korreleret med ALDH1 enzymatisk aktivitet målt ved ALDEFLUOR assay. Langsigtet

in vitro

kultur påvirker ikke signifikant ALDH1 aktivitet i epitel tumorceller. I overensstemmelse med forskning i andre kræftformer, fandt vi, at høj ALDH1 udtryk er signifikant associeret med dårlige kliniske resultater i serøse ovariecancerpatienter (n = 439, p = 0,0036). Endelig ALDH

br tumorceller udviser kræft stamcelle egenskaber og er resistente over for kemoterapi. Som en ny cancer stamceller markør, kan ALDH1 bruges til tumorer, hvis tilsvarende normale væv udtrykker ALDH1 i relativt begrænsede eller begrænsede niveauer såsom bryst-, lunge-, ovarie- eller coloncancer

Henvisning:. Deng S, Yang X , Lassus H, Liang S, Kaur S, Ye Q, et al. (2010) Særskilte Expression Niveauer og Mønstre af Stem Cell Marker, aldehyddehydrogenase Isoform 1 (ALDH1), i menneskelige epitelcancer. PLoS ONE 5 (4): e10277. doi: 10,1371 /journal.pone.0010277

Redaktør: Yihai Cao, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: December 1, 2009; Accepteret: 30 Marts 2010; Udgivet: 21 April, 2010

Copyright: © 2010 Deng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Breast Cancer Alliance (LZ), den æggestokkene Cancer Research Fundet (Liz Tilberis Scholar, LZ), Mary Kay Ash Charitable Foundation (LZ), National Cancer Institute (R01CA142776 og kræft i æggestokkene SPORE P50-CA83638-7951 projekt 3, LZ), og amerikanske forsvarsministerium (W81XWH-10-1-0082, LZ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forskning har ydet betydelig støtte til kræft stamceller hypotese, som foreslår, at en relativt sjælden subpopulation af tumorceller har den unikke evne til at igangsætte og forevige tumorvækst [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Disse celler, der kaldes cancer stamceller eller tumor-initierende celler, deler forskellige karakteristika med embryonale og somatiske stamceller, herunder selvfornyelse og multi-potent differentiering [11], [12], [13], [14], [15] [16], [17]. Cancer stamceller kan være meget modstandsdygtige over for stråling eller kemoterapi [18], [19], [20], således, udvikling af mere effektive lægemidler til behandling af kræft kræver effektiv målretning af denne cellepopulation [11], [12], [13 ], [14], [15], [16], [17]. Cancer stamceller kan identificeres og isoleres under anvendelse af markører specifikke for normal progenitor eller stamceller af samme organ [16], [21]. Adskillige markører har vist sig nyttig til isolering af delmængder beriget for epitel kræft stamceller, herunder CD44 /CD24 (HAS /pGP1) [3], CD133 (PROM1) [4], ATP-bindende kassette B5 (ABCB5) [22], CD90 (Thy1) [23], CD61 (β3 Integrin) [24], 26S proteasom aktivitet [25], samt Hoechst33342 udstødelse [6], [26], [27].

Aldehyd dehydrogenase ( ALDH) katalyserer irreversibel oxidation af en række alifatiske og aromatiske aldehyder til deres tilsvarende carboxylsyrer [28]. Høj ALDH aktivitet detekteres i stamceller og stamceller af forskellige afstamninger, herunder hæmatopoietiske [29], [30], [31], mesenkymale [32], neurale [33], brystkirtler [34], [35] og prostata [36] . Den ALDEFLUOR assay blev oprindeligt udviklet til at påvise ALDH aktivitet i hæmatopoietiske væv; den fluorescerende ALDEFLUOR reaktionsproduktet akkumuleres i stamceller og korrelerer med ALDH aktivitet [29]. ALDH omdanner ALDH substrat, Baaa (BODIPY-aminoacetaldehyd), ind i den fluorescerende produkt BAA (BODIPY-aminoacetat), som fastholdes inde levedygtige celler. Celler, der udtrykker høje niveauer af ALDH bliver lyst fluorescerende (ALDH

br) og kan identificeret og talt under anvendelse af en standard flowcytometer eller isoleres ved cellesortering til yderligere oprensning og karakterisering. ALDECOUNT® er en FDA-godkendt

in vitro

diagnostisk produkt, som er baseret på ALDEFLUOR assay og anvendes til identifikation og tælling af stamceller til kliniske anvendelser. Senest har den ALDEFLUOR assayet med held været anvendt til at detektere progenitor og cancer stamceller i ikke-hæmatopoietiske væv, såsom brystkirtel og brystcancer [34]. Den ALDEFLUOR reagenset er kendt for at virke som et substrat for ALDH1. Vigtigt er det, kan et ALDH1 specifikke antistof anvendes til at detektere cancer stamceller i paraffinindlejrede kliniske prøver [34]. Flere uafhængige grupper har rapporteret, at ALDH1 ekspression kan anvendes som prognostisk markør for epitelcancer [34], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Derfor kan ALDEFLUOR assay og ALDH1 immunfarvning vise sig nyttig til påvisning og isolering af cancer stamceller i epiteliale tumorer, hvilket vil lette indførelsen af ​​kræft stamceller koncepter til klinisk praksis [34]. Men vores viden om udtryk og aktivitet ALDH1 i humane epiteliale kræft og deres tilsvarende normale væv, såvel som dens kliniske betydning, er stadig i sin vorden. At fremme vores viden på dette vigtige område, kendetegnet vi ALDH1 udtryk i 24 typer af normale humane væv samt en stor samling af paraffinindlejrede humane epiteliale tumor prøver (seks kræftformer, n = 792) af immunhistokemisk farvning. Brug af ALDEFUOR analysen blev ALDH1 aktivitet også undersøgt i 16 primære tumor prøver og 43 etablerede humane epiteliale kræftceller. Desuden blev en ovariecancer transgen musemodel og 7 murine ovarian cancer cellelinjer analyseret i vores undersøgelse.

Materialer og metoder

Frisk tumorprøver

Væv blev opnået efter patienternes skriftlige samtykke under en generel væv samling protokol godkendt af institutionens Institutional Review Board (IRB) fra University of Pennsylvania. Alle prøver blev indsamlet på tidspunktet for debulking kirurgi fra tidligere ubehandlede patienter med sen-fase kræft i æggestokkene. Erythrocytter blev lyseret med ammoniumchlorid opløsning. Encellede suspensioner blev fremstillet under anvendelse af en 40 um cellefilter. Døde celler blev fjernet ved hjælp af magnetiske perler (Dead Cell Removal kit, Miltenyi Biotec) og en MidiMACS separator

væv microarrays

Tissue-array netværk kohorte:.

En FDA normalt menneske organvæv microarray blev anvendt til at karakterisere ALDH1 ekspression i normale organer. Dette væv vifte platform inkluderet 24 typer af normale menneskelige organer baseret på FDA retningslinjer, og hvert organ blev udtaget fra 3 normale individer. Seks typer af humane epitelial tumor væv microarrays blev anvendt til at karakterisere ALDH1 ekspression i epiteliale tumorer. Hver patient var repræsenteret med mindst to centrale vævsbiopsier.

Helsinki kohorte:

En æggestokkene kræftvæv microarray blev anvendt til at undersøge den prognostiske betydning af ALDH1 i kræft i æggestokkene. Den vifte omfattede patienter behandlet for primær serøs ovariecancer ved Helsinki University Central Hospital.

cellelinjer og Cell Culture

I alt 50 etablerede cancer cellelinjer blev anvendt i denne undersøgelse, herunder 15 menneske bryst, 18 menneskelige æggestokkene, 7 murine æggestokkene, og 10 humane colon. Alle cancercellelinier dyrkedes i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Tre uafhængige immortaliserede humane ovarie overflade epitelceller (IOSEs) blev generøst tilvejebragt af Dr. Auersperg og dyrket i en 01:01 blanding af medium 199 og MCDB 105 medium (Sigma) suppleret med 15% FBS. Murine æggestokkene overflade epitelceller (Moses) blev isoleret og dyrket som tidligere rapporteret [44].

transgene mus

dyreforsøg protokol blev gennemgået og godkendt af den institutionelle Dyrepleje og bruge udvalg ( IACUC) fra University of Pennsylvania. Den kræft i æggestokkene MISRII-SV40 transgene mus blev genereret af Dr. Denise Connolly laboratorium [45].

Immunhistokemi og Billedanalyse

Immunhistokemi (IHC) blev udført ved hjælp af Vectastain ABC Kit, som beskrevet af producenten (Vector). De følgende primære antistoffer blev anvendt i denne undersøgelse: muse-anti-human ALDH1 (klon: 44 /ALDH, 1:250, BD Pharmingen) [34], [39], [46]; muse-anti-humant Ki67 (1:100, DAKO) og kanin-anti-humant CD45 (1:200, Millipore). Antistoffer blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Immunreaktionen blev visualiseret med 3,3′-diaminobenzidin. Dobbelt immunfluorescensfarvning blev udført som tidligere beskrevet [47].

ALDEFLUOR Assay

ALDH aktivitet blev påvist under anvendelse af ALDEFLUOR assaykit (StemCell Technologies) som beskrevet af producenten. Kort fortalt dissocierede enkeltceller fra cellelinjer eller tumorprøver blev suspenderet i ALDEFLUOR assaybuffer indeholdende en ALDH substrat, BODIPY-aminoacetaldehyd (Baaa), ved 1,5 uM, og inkuberet i 1 time ved 37 ° C. En specifik inhibitor af ALDH, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), ved et 10-fold molært overskud, blev anvendt som negativ kontrol. Flowcytometri data blev analyseret ved BD FACSDiva software V6.1.3 (BD ​​Biosciences) eller FlowJo software (TreeStar).

Protein Isolation og Western blot

Dyrkede celler blev lyseret i 200 pi lysisbuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl og 1% Triton X-100. Proteiner blev separeret ved 10% SDS-PAGE under denaturerende betingelser og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner blev inkuberet med et anti-ALDH1 primære antistof (1:300, BD Pharmingen), efterfulgt af inkubation i anti-muse-sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (1:5,000; Amersham Biosciences). Immunoreaktive proteiner blev visualiseret ved hjælp af ECL Western Blotting Substrat (Thermo Scientific).

Mammosphere kultur

Mammosphere kulturer blev udført som beskrevet af Dontu

et al

[48]. Kort fortalt blev enkelte celler udpladet i ultralave fastgørelse plader med 24 brønde (Corning) ved en densitet på 20.000 levedygtige celler /ml og 5000 celler /ml i efterfølgende passager. Celler blev dyrket i et serumfrit mammosphere dyrkningsmedium (MammoCult, StemCell Technologies) suppleret med MammoCult Spredning Supplements. Mammospheres blev indsamlet ved forsigtig centrifugering (800 rpm) efter 7-10 dage og adskilt både mekanisk og enzymatisk (10 min i 0,05% trypsin, 0,53 mM EDTA-4Na).

In vivo

tumorigen assay

undersøgelsen protokol dyr blev gennemgået og godkendt af den institutionelle dyr pleje og brug udvalg (IACUC) fra University of Pennsylvania. Seks til otte uger gamle hun immune deficiente mus blev anvendt i disse undersøgelser. ALDH

lav og ALDH

br (ALDH

lyse) celler blev isoleret ved FACS sortering. Celler blev suspenderet i phosphatpufret saltvand blandet med et tilsvarende volumen af ​​Matrigel (BD Biosciences) ved 10 mg /ml. Et samlet volumen på 0,3 ml, indeholdende 500; 5.000 eller 50.000 celler blev injiceret subkutant (ovarieektomiseret og østrogen-pellet suppleret mus).

MTT assay

MTT-assays blev udført i plader med 96 brønde under anvendelse af celleproliferation Kit (I) ( Roche) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS og StatView statistisk softwarepakker.

Resultater

Expression og distribution af ALDH1 protein i normale humane væv

Som stamcelle markering, ALDH1 er blevet anvendt til at detektere cancer stamceller i flere typer af humane epiteliale tumorer under anvendelse immunhistokemisk farvning; imidlertid sit udtryk og distributionsmønstre i normale humane væv er stadig ukendte. For at løse dette vigtige spørgsmål, vi kendetegnet ekspressionsmønsteret for ALDH1 i normale humane væv ved immunhistokemisk farvning. En FDA-godkendt normalt humant organvæv mikroarray blev anvendt i denne undersøgelse. Her blev 24 typer af normale menneskelige organer inkluderet baseret på FDA retningslinjer, hvor hvert organ blev taget fra 3 normale menneskelige individer. Muse anti-human ALDH1 antistof (klon: 44 /ALDH) [34], [39], [46] blev anvendt til at detektere ALDH1 ekspression. Som vist i figur 1A, blev ALDH1 positiv farvning detekteret hovedsagelig i cytoplasmaet, og var bredt udtrykt i fordøjelsessystemet (herunder epitelet af spiserøret, maven, tarmen og colon, såvel som leveren og pancreas), det endokrine system (herunder binyrerne, hypofysen, skjoldbruskkirtlen og spytkirtel), og det reproduktive system (æggestok og testikler). Der var ingen påviselige ALDH1 positive celler i cerebrum og cerebellum (figur 1A). I andre organer blev ALDH1 distribueret i visse områder og i særlige celletyper. For eksempel i milten, ALDH1 positive celler blev primært fundet i leukocytter i de røde pulp regioner, men ikke i den hvide pulp (figur 1A). Vigtigere er det, i overensstemmelse med andre rapporter [34], [46], [49], stærkt ALDH1 positive celler blev fundet i de områder, hvor epitelial stamceller /progenitorceller blev formodet placeret i bryst-, tyktarms- og mave (figur 1B). I normalt bryst blev ALDH1 positive celler hovedsageligt placeret i luminale region (figur 1B), og de var en relativt sjælden population (1-2% af luminale epitelceller). Små ALDH1 positive celler blev også fundet i normalt bryst stroma (figur 1B). Dobbelt immunhistokemisk farvning viste, at de fleste af disse celler ( 90%) var CD45-positive leukocytter (data ikke vist). I den normale colon, selv svagt ALDH1 positive celler kunne findes i næsten alle normale krypter, antallet af stærkt positive ALDH1 celler var ret begrænset (figur 1B). Disse stærkt positive celler blev hovedsageligt placeret i grundlaget for de krypter (Figur 1B). Lignende farvede mønstre ses også i maven (figur 1B).

A. Et FDA normalt humant organvæv microarray blev anvendt til at karakterisere ekspressionen og fordelingen af ​​ALDH1 i 24 væv. B. Stærkt positive ALDH1 celler blev fundet i de områder, hvor epitelial stamceller /progenitorceller blev formodet placeret i bryst-, tyktarms- og mave.

Expression og distribution af ALDH1 protein i humane epiteliale tumorer

Dernæst undersøgte vi ALDH1 udtryk i humane epiteliale tumorer ved hjælp tissue arrays. Som vist ovenfor, mønstre og niveauer af ekspression af ALDH1 i normale humane væv er bemærkelsesværdigt anderledes og kan inddeles i tre typer: 1) væv med fraværende eller begrænset ALDH1 udtryk, såsom bryst eller lunge; 2) væv med relativ svag ALDH1 ekspression, såsom colon eller gastrisk epitel; og 3) væv med omfattende og høj ekspression af ALDH1 sådan, som lever eller bugspytkirtel (figur 1A). Vi valgte derfor seks typer (bryst, n = 69; lunge, n = 66; æggestokkene, n = 65; kolon, n = 67; leveren, n = 67; og pancreascancer, n = 19) af epiteliale cancere, hvis tilsvarende normale epitheliums var repræsentant for hver undertype. I alle seks tumortyper, blev et stort antal ALDH1 positive tumorinfiltrerende stromaceller fundet (figur 2B). Dobbelt immunfarvning viste, at de fleste af disse var CD45 positive celler. Andelen af ​​ALDH1 positive tumorceller i tumor holme blev uafhængigt kvantificeret ved to efterforskere med patologisk uddannelse. Stromal ALDH1 positive celler blev udelukket fra denne analyse. Vi fandt, at ALDH1 udtryk var negativ i 79,7% (55/69) af brystkræft, 18,2% (12/66) af lunge og 23,1% (15/65) af ovariecancer. Tværtimod kun 6,0% (4/67) af tyktarmen og 5,3% (1/19) af pancreascancer var ALDH1 negative, og alle leverkræft prøver var ALDH1 positive. Endvidere for disse ALDH positive tumorer, blev også analyseret procentdelen af ​​tumorceller, der udtrykker ALDH1. Den detaljerede procentdel af ALDH1 positive cancerceller er opsummeret i figur 2C. Undtagen i tilfælde af brystcancer (4,3%), en høj procentdel af ALDH1 ekspression (mellem 75 til 100% af tumorcellerne) er fundet i hver af de andre fem kræfttyper (ovarie: 29,2%, colon: 38,8%, lunge : 43,9%, pancreas 78,9% og lever: 97,0%). Tilsammen var der en klar korrelation mellem ALDH1 ekspression mellem tumorer og tilsvarende normale væv. For eksempel i de typer cancer, hvor ALDH1 var stærkt udtrykt i de tilsvarende normale epitheliums, såsom lever- og pancreascancer, blev ALDH1 udtrykt i de fleste tumorprøver ved bemærkelsesværdigt høje niveauer.

Tissue microarrays blev anvendt til at karakterisere udtryk og distribution af ALDH1 i kræft (n = 353). A. Ekspression af ALDH1 i de tilsvarende normale væv. B. ALDH1 + tumorinfiltrerende celler blev detekteret i stroma. C. Ekspression af ALDH1 i epiteliale tumorer. Procentdel af ALDH1 + tumorceller blev samlet. D. Høj procentdel af ALDH1 + celler var forbundet med dårlige kliniske resultater i serøs kræft i æggestokkene.

Det er blevet rapporteret af selvstændige grupper, at en høj procentdel af ALDH1 positive tumorceller er forbundet med kortere overlevelsestid i bryst [34], [37], [42], lunge [38], pancreas [40], blære [41] og prostata [43] kræftpatienter. Vi testede den prognostiske værdi af ALDH1 anvendelse af en væv array af serøse ovariecancere, den mest almindelige histotype af human epithelial ovariecancer. Prøverne blev indsamlet fra Institut for Gynækologi og Obstetrik på Helsinki University Central Hospital. Den mediane follow-up tid af patienter i live ved slutningen af ​​undersøgelsesperioden var 101 måneder, der spænder fra 4 til 475 måneder. Patienterne blev delt i to grupper baseret på ALDH1 immunfarvning: ALDH1 lav ( 10% tumorceller var ALDH1 positiv) og ALDH1 høj (≥10% tumorceller var ALDH1 positive). I overensstemmelse med resultaterne fra bryst [34], [37], [42], lunge [38], pancreas [40], blære [41] og prostata [43] kræftpatienter, vi fandt, at patienter med høj ALDH1 havde kortere sygdom frie og samlet overlevelse gange i forhold til dem med lav ALDH1 (p = 0,0036 og p = 0,023, henholdsvis figur 2D).

ALDH1 enzymatisk aktivitet i epitel tumorceller

ALDEFLUOR reagens, der oprindeligt udviklet til at detektere ALDH aktivitet i hæmatopoietiske væv [29], er kendt for at virke som et substrat for ALDH1. For nylig er ALDEFLUOR assayet med held været anvendt til påvisning ALDH

br i cancer stamceller fra ikke-hæmatopoietiske tumorer [34]. I den foreliggende undersøgelse, vi udnyttet denne analyse til at undersøge ALDH1 enzymatisk aktivitet i epitel tumorceller

in vitro

. Dels at validere resultaterne af vævet array, vi valgte cellelinjer fra tre epitheliale tumortyper herunder bryst- (n = 15), ovarie (n = 18) og kolon (n = 10). Som vist i figur 2, procentdelen af ​​tumorer med en høj frekvens af ALDH1 positive celler var større i tyktarmskræft sammenlignet med bryst- eller ovarie-cancer. I overensstemmelse med dette fund, fandt vi, at procentdelen af ​​ALDH

br celler i colon cancer cellelinjer (15,5 ± 11,5%) var bemærkelsesværdigt højere end i bryst (3,5 ± 4,8%) eller ovarie (6,2 ± 13,5%) cancercelle linier (figur 3B og tabel S1). For yderligere at bekræfte dette resultat, opdaget vi ALDH1 proteinekspression ved western blots i disse cellelinjer. Som forventet blev ALDH1 protein ekspressionsniveauerne positivt korreleret med den procentdel af ALDH

br celler i cellelinier (figur 3C og Figur S3). Selv om der var en klar positiv sammenhæng mellem

in situ

immunfarvning og ALDEFLUOR analyseresultater i disse tre tumortyper, procentdelen af ​​celler, der udviser ALDH1 enzymatisk aktivitet ved flowcytometri var mindre end den procentdel af ALDH1 positive celler ved immunfarvning . For eksempel, 4,3%, 29,2% og 38,8% af bryst-, ovarie- og coloncancer prøver højt udtrykte ALDH1 (mellem 75 til 100% af tumorceller var ALDH1 positive, figur 2C), men ingen af ​​de tumorcellelinier var sammensat af større end 75% af ALDH

br celler (tabel S1). Dernæst valgte vi ovariecancer som et eksempel til at undersøge ALDH enzymatiske aktivitet i primære tumorceller. Seksten sene stadie ovariecancer prøver blev undersøgt. Da vi fandt, at tumor-infiltrerende leukocytter udtrykte høje niveauer af ALDH1 (figur 2B), vi først adskilt ascites celler ved CD326 (EpCAM, et epitel markør til gate tumorcellen befolkning) eller CD45 (en lymfocyt maker til gate lymfocytpopulation) efter fjerne døde celler ved anvendelse af magnetiske perler. Den ALDEFLUOR assay blev anvendt til påvisning af celler med ALDH aktivitet i hver af de ovennævnte population (figur 4A). Vi fandt, at 2,6 ± 3,1% (0,1 til 11,3%) af CD45-positive celler var ALDH

br (figur 4B). Overensstemmelse med den cellelinje undersøgelsen, 1,1 ± 1,9% (0,1 til 7,0%) af CD326-positive tumorceller var ALDH

br (figur 4B), en lavere procentdel end i Immunofarvningen resultater.

A. ALDH1 enzymatisk aktivitet blev påvist under anvendelse af ALDEFLUOR assay. DEAB blev anvendt til at inhibere reaktionen af ​​ALDH med ALDEFLUOR reagens, hvilket giver en negativ kontrol. B. Sammendrag af ALDH1 enzymatisk aktivitet i etablerede bryst (n = 15), ovarie (n = 18) og kolon (n = 10) cancercellelinjer. C. ALDH1 proteinekspression blev opdaget af Western blotting. Der var en positiv korrelation mellem ALDH1 proteinekspression og ALDH1 enzymatisk aktivitet. blotting fuld længde er præsenteret i Supplemental Figur S3.

A. ALDH1 enzymatisk aktivitet i celler isoleret fra en kræft i æggestokkene prøve. Døde celler blev fjernet under anvendelse af magnetiske perler og et MidiMACS separator. For immunfænotypebestemmelse af ALDH

br ascitesceller, APC-CD45 eller APC-CD326 blev anvendt til kontrafarvning. DEAB blev anvendt til at inhibere reaktionen af ​​ALDH med ALDEFLUOR reagens, hvilket giver en negativ kontrol. B. Resumé af de procentdele af ALDH

br i hver celle population fra 16 sene ovariecancer patienter.

For at løse spørgsmålet om, hvorvidt langsigtede

in vitro

kultur vil væsentligt påvirke ALDH aktivitet i cancer-cellelinjer, valgte vi en ovariecancer transgen musemodel, hvori et onkogen (den transformerende region SV40) blev overudtrykt af æggestokkene overflade specifikke mullerian inhiberende stof type II receptor (MISRII) promotor (figur S1A). Den ALDEFLUOR assay blev udført på både primære isolerede tumorceller og to langsigtede kulturer af tumorcellelinier (mere end 40 passager), der blev isoleret fra den samme model. Vi fandt, at der ikke var nogen signifikant forskel i andelen af ​​ALDH

br celler mellem primære tumorer (9,5 ± 7,6%, n = 5) og langsigtede cellekulturer (6,8 ± 4,9%, n = 2, P 0,05 , Figur S1B). Da kun et begrænset antal cellelinjer blev analyseret i den foreliggende undersøgelse, behøver denne konklusion yderligere at validere i andre modeller.

Endelig har vi sammenlignet ALDH aktivitet i æggestokkene cancerceller og deres tilsvarende normale epitheliums, æggestokkene overflade epitelceller. Tre immortaliserede humane ovarie overflade epiteliale cellelinjer blev sammenlignet med 18 humane ovarie cancercellelinjer, og primære isolerede murine ovarian overflade celler blev sammenlignet med 7 murine ovarian cancer cellelinjer (herunder to linjer fra MISIIR-SV40 transgene mus). Vi fandt, at andelen af ​​ALDH

br celler var relativt højere i normale ovariale overflade epithelceller (human: 13,1 ± 6,72%, n = 3; murine: 7,6%, n = 1) sammenlignet med ovariecancerceller (human: 6,2 ± 13,5%, n = 18; murine: 3,8 ± 2,92%, figur S2). Ligeledes er andelen af ​​ALDH

br celler var relativt højere i normale mammaepitelceller (8,18 ± 4,31%, n = 14) [34] sammenlignet med brystcancerceller (3,5 ± 4,8%, n = 15, figur 3) .

ALDH

br tumorceller har kræft stamceller egenskaber og modstod til kemoterapi

Det er blevet påvist, at ALDH

br tumorceller isoleret fra primære humane tumorer eller fra kort -term passager af celler fra NOD /SCID-mus har kræft stamceller egenskaber [34] og er resistente over for kemoterapi [50], [51]. For at undersøge de kræft stamceller egenskaber ALDH

br celler isoleret fra etablerede langsigtede dyrkede cellelinjer, ALDH

lav og ALDH

br tumorceller blev isoleret fra etableret human bryst- og æggestokkræft cellelinier ved FACS sortering. Først blev deres selvfornyelse evne undersøgt under anvendelse af mammosphere assayet [48] i fire brystcancerceller. Antallet af mammospheres dannet af ALDH

br tumorceller var signifikant højere end ved ALDH

lave tumorceller (figur 5A). ALDH

lave celler fra T47-D og ZR-75-1 cellelinjer manglede evnen til at danne mammospheres i suspension kultur. Dernæst undersøgte vi deres

in vitro

tumorvæksthastigheder kapaciteter ved hjælp af kolonidannelse assayet i 5 brystcancercellelinier. ALDH

br tumorceller dannet synligt større kolonier sammenlignet med ALDH

lave tumorceller (figur 5B). Desuden koloni numre fra ALDH

br tumorceller var signifikant højere end fra ALDH

Lav tumorceller (figur 5B). Endelig

in vivo

tumorigen evne ALDH

lav og ALDH

br tumorceller blev undersøgt under anvendelse tumorceller, som blev graft-transplanterede (500, 5000, eller 50.000) til immun-deficiente mus . Vi fandt, at 500 ALDH

br men ikke ALDH

lave tumorceller var i stand til at generere xenotransplantattumorer

in vivo

(figur 5C). Histologi af tre xenotransplantattumorer blev undersøgt af HE farvning. I MCF-7 og SKBR-3-cellelinjer, der var ingen signifikant histologisk forskel mellem ALDH

br og ALDH

lave tumorer. Men i BT-474 tumorer, der var begrænset stromale celler i ALDH

br tumorer sammenlignet med ALDH

lave tumorer (figur 5D).

In vivo

celledeling blev også undersøgt ved hjælp af Ki-67 farvning. Vi fandt ingen signifikant forskel i spredning indeks (procentdel af Ki-67 positive celler) mellem ALDH

br og ALDH

lave tumorer i alle tre cellelinjer (figur 5E).

EN. ALDH

br cellepopulationer (Blå) genererede væsentligt højere antal mammospheres forhold til ALDH

tyndt befolkede (gul). B. Tumorigenicitet af ALDH

br og ALDH

lave celler blev undersøgt

in vitro

hjælp kolonidannelse analyser. C. Tumorigenicitet af ALDH

br og ALDH

lave celler blev undersøgt

in vivo

. D. Histologi af ALDH

br og ALDH

lave BT-474 tumorer blev undersøgt af HE farvning. E. Proliferation af ALDH

br og ALDH

lave BT-474 tumorer blev undersøgt af Ki-67 immunfarvning.

Hurtigt akkumulere tyder på, at cancer stamceller kan være meget modstandsdygtige over for stråling eller kemoterapi [18], [19], [20]. I overensstemmelse med disse resultater, fandt vi, at ALDH

br cellepopulation udvides i et sæt af platin-resistente æggestokkene kræft cellelinjer, A2780 /CP70, A2780 /C200 og A2780 /C30, i forhold til deres forældres platin følsomme linje, A2780 /WT (Figur 6A). Endvidere behandling af celler med cisplatin (1XIC

50) signifikant beriget ALDH

br cellepopulation i æggestokkene og brystcancercellelinier

in vitro

(figur 6B). Den ALDH

br befolkning var betydeligt mere resistent over for platin behandling i forhold til ALDH

lav befolkningstæthed (figur 6C). Endelig tester vi den ovenstående observation

in vivo

ved hjælp af en kræft i æggestokkene xenograft musemodel. Tre uger efter implantation af tumorceller, A2780 (5 x 10

6 per dyr) blev musene tilfældigt inddelt i tre forsøgsgrupper at modtage behandling ved i.p. injektion med 1) kontrol behandling (n = 4), 2) 2 mg /kg cisplatin behandling (½ maksimalt tolererede dosis (MTD), n = 3) og 3) 4 mg /kg cis-platin behandling (fuld MTD, n = 3). Den q7d × 4 i.p. behandlingsprogram (figur 6D) blev anvendt til eksperimentel behandling. Andel af ALDH positive population blev analyseret ved ALDEFLUOR assay. I overensstemmelse med vores

in vitro

data, cis-platin behandling signifikant øget den ALDH

br cellepopulation i xenograft tumor

in vitro

(figur 6D, ½ MTD: 8,44 gange i gennemsnit ; fuld MTD: 4,67 gange i gennemsnit, sammenlignet med ikke-behandlede tumorer). Den foreslår, at ALDH

br tumorcellepopulation er resistent over for kemoterapi. Lignende resultater blev også rapporteret i tyktarmskræft

in vivo

senest af en uafhængig gruppe [50].

A. ALDH

br celler blev bemærkelsesværdigt udvidet i platin-resistente cellelinier (A2780 /CP70, A2780 /C200 og A2780 /C30) i forhold til deres forældres platin følsom linje (A2780 /WT). B.

In vitro

platin behandling steget betydeligt ALDH

br cellepopulation i æggestokkene og brystkræft cellelinier efter tre dage. C. ALDH

br celler var resistente overfor platin behandling. ALDH

br og ALDH

lave celler blev isoleret ved FACS sortering. D. ALDH

br tumor celle population var resistent over for kemoterapi

in vivo

. Den q7d × 4 i.p. Behandlingsplanen blev anvendt til eksperimentel behandling. Tumorer blev opsamlet og adskilles ved enzymfordøjelse. Andel af ALDH

br befolkning blev analyseret ved ALDEFLUOR assay.

Diskussion

Som en ny tilgang, kan ALDEFLUOR assay og ALDH1 immunfarvning vise sig nyttig til påvisning og isolering cancerstamceller i epiteliale tumorer og således lette anvendelsen af ​​kræft stamcellelinjer begreber til klinisk praksis [34]. Vi fandt, at mønster og niveauet for ekspression af ALDH1 i normal humane væv er bemærkelsesværdigt anderledes og kunne klassificeres i tre typer: 1) væv med fraværende eller begrænset ALDH1 udtryk, såsom bryst eller lunge; 2) væv med relativ svag ALDH1 udtryk, såsom tyktarmen eller gastrisk epitheliums; og 3) væv med omfattende og høj ekspression af ALDH1, såsom lever eller bugspytkirtel (figur 1A).