PLoS ONE: Anti-proliferative effekt af L-Carnosine korrelerer med en Nedsat Angivelse af Hypoxi Inducerbar Faktor 1 alfa i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

I de senere år betydelig opmærksomhed er blevet givet til brugen af naturlige stoffer som lægemidler mod cancer. Den naturlige antioxidant dipeptid-L-carnosin tilhører denne klasse af molekyler, fordi det har vist sig at have en betydelig anticancer aktivitet både in vitro og in vivo. Tidligere undersøgelser har vist, at-L-carnosin inhiberer proliferationen af ​​humane kolorektal carcinom celler ved at påvirke (ROS) produktion ATP og reaktive oxygenarter. I den foreliggende undersøgelse identificerede vi den Hypoxi-inducible factor 1α (HIF-1α) som et muligt mål for L-carnosin i HCT-116-cellelinjen. HIF-1α protein er overudtrykt i flere typer af human cancer og er den væsentligste årsag til resistens over for lægemidler og stråling i solide tumorer. Af særlig interesse er eksperimentelle data støtter konceptet, at generering af ROS tilvejebringer et redox signal for HIF-1α induktion, og det er kendt, at nogle antioxidanter kan undertrykke tumorigenese ved at hæmme HIF-1α. I den aktuelle undersøgelse fandt vi, at-L-carnosin reducerer HIF-1α proteinniveau påvirker dets stabilitet og nedsætter HIF-1 transkriptionel aktivitet. Desuden har vi vist, at-L-carnosin er involveret i ubiquitin-proteasom systemet fremme HIF-1α nedbrydning. Endelig har vi sammenlignet antioxidant aktivitet af L-carnosin med den af ​​to syntetiske anti-oxidant bis-diaminotriazoles (dvs. 1 og 2, henholdsvis). På trods af disse tre forbindelser har den samme evne til at reducere intracellulære ROS, 1 og 2 er mere potente scavengers og har ingen virkning på HIF-1α ekspression og cancercelleproliferation. Disse resultater tyder på, at en analyse af L-carnosin antioxidant vej vil klarlægge mekanismen bag de anti-proliferative virkninger af denne dipeptid på tyktarmskræft celler. Selv den molekylære mekanisme, ved hvilken L-carnosin nedregulerer eller inhiberer HIF-1α aktivitet er endnu ikke klarlagt, kan denne evne være lovende ved behandling af hypoxi sygdomme

Henvisning:. Iovine B, Oliviero G, Garofalo M, Orefice M, Nocella F, Borbone N, et al. (2014) Anti-proliferative effekt af L-Carnosine korrelerer med en Nedsat Angivelse af Hypoxi Inducerbar Faktor 1 alfa i Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 9 (5): e96755. doi: 10,1371 /journal.pone.0096755

Redaktør: Sabato D’Auria, CNR, Italien

Modtaget: Marts 17, 2014 Accepteret: April 5, 2014; Udgivet: 7. maj 2014

Copyright: © 2014 Iovine et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af “Finanziamento per l’Avvio di Ricerche originali”, Università degli Studi di Napoli Federico II, GO. “Progetti di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale” tilskud 2009 fra den italienske Ministero dell’Università e della Ricerca, GO NB GP. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

-L-carnosin (β-Ala-His) er et naturligt forekommende histidin dipeptid, endogent syntetiseret og bredt findes i hjernen, muskler, nyre, mave, og, i store mængder, i skeletmuskel. Dette dipeptid har vist sig at udføre en række biologiske funktioner, herunder anti-oxidant aktivitet, evne til at chelatere metalioner, inhibering af proteinglycosylering, anti-inflammatorisk og anti-senescens egenskaber [1]. Et andet aspekt af virkningen af-L-carnosin angår dens antiproliferativ virkning i humane cellelinier. Vi har for nylig vist, at-L-carnosin inhiberer proliferationen af ​​humane kolorektal carcinom HCT-116-celler ved at påvirke produktionen ATP og ROS og ved at inducere cellecyklusstandsningen i G1-fasen [2]. Desuden har nogle forfattere, med et proteomisk tilgang støtter muligheden for, at dette dipeptid påvirker tumorcellevækst i de humane gliomceller og forsinker tumorvækst in vivo i en NIH3T3-HER2 /neu musemodel gennem et indgreb i proteinfoldning /forarbejdning og HIF-1α signalering [3] – [4]. Faktisk har betydelig indsats blevet rettet mod opdagelsen af ​​kemiske og naturlige molekyler, der er målrettet HIF-1α protein og regulere HIF-1α signalvejen gennem en række molekylære mekanismer, herunder transkriptionel regulering, stabilisering, nedbrydning og transaktivering. Af særlig interesse er den rolle af ROS og antioxidant molekyler i HIF-1α regulering. Faktisk en række forbindelser, såsom rapamicin og resveratrol, har vist sig at være inhibitorer af HIF-1α [5] – [6]. HIF-1α er en komponent af HIF-1-kompleks, der spiller en central rolle i O

2 homeostase og i virkeligheden betragtes som en central regulator af tilpasningsforanstaltninger cancerceller for hypoxi [7]. HIF-1-komplekset er et heterodimert transkriptionsfaktor bestående af O

2-reguleret HIF-1α og konstitutivt udtrykte HIF-1β underenheder. Under normoksiske betingelser isoformen prolyl hydroxylase PHD2 hydroxylerer HIF-1α på to funktionelt uafhængige prolinrester, Pro

402 og Pro

564, inden for ODD (ilt-afhængige nedbrydning) domæne [8] – [9]. Hydroxylerede Pro-rester fremmer rekrutteringen af ​​HIF-1α af Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein (VHL), en anerkendelse modul af E3-ubiquitin-ligase, er ansvarlig for dets ubiquitinering og efterfølgende proteasom-medieret nedbrydning [10]. Under hypoxiske betingelser HIF-1α protein undslipper for proteolyse, opreguleres, og danner en heterodimer med HIF-1β i HIF-1-komplekset. HIF-1-kompleks genkender og binder til hypoxi responsive element (HRE) af hypoxi-inducerbare gener, herunder gener, der påvirker angiogenese, jern metabolisme, modulation af glucosemetabolisme, celleproliferation, overlevelse, og invasion, derved aktivere deres transkription [ ,,,0],11]. I de senere år har HIF-1 dukket op som et lovende mål for kræftmedicin. Faktisk HIF-1α overekspression er et fælles træk ved humane cancere, hvor den medierer tilpasning til den hypoxiske tumormikromiljøet. I overensstemmelse med disse observationer, er formålet med denne undersøgelse var at undersøge i HCT-116-cellelinjen virkningerne af L-carnosin på ekspressionen af ​​HIF-1α og HIF-1α-afhængige gener. Endvidere i de seneste år af særlig interesse har det været den rolle af ROS og antioxidant molekyler i HIF-1α regulering [12]. Således at forstå de mekanismer, der er ansvarlige for L-carnosin effekt vi har også undersøgt, hvordan denne dipeptid påvirker ROS intracellulære niveauer i sammenligning med to nye anti-oxidant bis-diaminotriazole forbindelser (dvs. 1 og 2 henholdsvis) tilgængelig fra vores laboratorier og hvis antioxidant aktivitet er ikke udgivet. På trods af disse tre forbindelser har den samme evne til at reducere intracellulære ROS, fandt vi, at 1 og 2 har ingen virkning på HIF-1α ekspression og cancercelleproliferation. Vi formoder, at den antioxiderende aktivitet af-L-carnosin opererer med en anden mekanisme end forbindelserne 1 og 2. Således konkluderer vi, at en analyse af L-carnosin antioxidant pathway vil klarlægge mekanisme, der ligger virkningerne af denne dipeptid på colon cancerceller.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

HCT-116 human colorectal carcinom cellelinje blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC) USA. Cellelinien blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle Medium) købt hos BioWhittaker Classic celledyrkningsmedier, Lonza – VWR International srl, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ( Gibco Laboratories, North Andover, Massachusetts) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco Laboratories).

Kemisk syntese af bis-triazolforbindelser 1 og 2

De to forbindelser blev fremstillet ved en omsætning af den tilsvarende syre (trans-trans-muconsyre og fumarsyre henholdsvis) med diaminoguanidine monohydrochlorid i polyphosphorsyre som dehydrerende middel, efter den allerede beskrevne i [13] procedure. De chlorohydrates 1 og 2 blev fremstillet som følger. Hver bis-diaminotriazole blev suspenderet i vand. Fortyndet saltsyre (10 ml konc. I 100 ml vand) blev tilsat, opvarmet til kogning, indtil det faste stof var fuldstændigt opløst. Efter afkøling til stuetemperatur, 2 blev opnået som brune prismatiske krystaller. I tilfældet med 1, den chlorohydrate (lysebrune prismatiske krystaller) blev opnået ved tilsætning af ethanol til den vandige opløsning og afkøling til stuetemperatur. Strukturen af ​​chlorohydrates og protonering ved N-2-atom i ringen, i stedet for på aminogrupperne, blev bekræftet ved enkeltkrystal-analyse (arbejde under forberedelse) og er i overensstemmelse med lignende resultater rapporteret i [13].

Behandlinger

-L-carnosin, leveret af Sigma-Aldrich Canada, blev opløst i DMEM uden phenolrødt (Sigma-Aldrich). HCT-116-celler blev udpladet i en koncentration på 3,0 × 10

6 celler i 100 mm plader. Efter inkubation i en dag ved 37 ° C i 5% CO

2, L-carnosin blev tilsat fra 0,5 til 100 mM; cellerne blev inkuberet ved 37 ° C og høstet 24 timer efter. Behandlingen med bis-diaminotriazole forbindelserne (1 og 2) blev udført under de samme betingelser med koncentrationer fra 0,05 til 0,5 mm. For CoCl

2 behandling 100 mM CoC

2 blev tilsat til HCT-116 i 6 timer. MG132, leveret af Calbiochem USA blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) og tilsat til dyrkningsmediet. HCT-116-celler blev inkuberet i 1 time før-L-carnosin behandling [14]. 24 timer efter-L-carnosin behandling blev cellerne høstet til protein immunopræcipitation.

fluorescensmikroskopi

HCT116-celler blev dyrket på objektglas i 24 timer og behandlet med 100 mM L-carnosin. Efter 24 timer blev cellerne vasket med PBS og fikseret med kold 4% paraformaldehyd i PBS ved stuetemperatur i 10 minutter og derefter blev permeabiliseret med 0,4% Triton X100 i PBS 1X. Efter 10 minutter blev cellerne vasket to gange med PBS 1X /0,4% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne blev først behandlet med HIF-1a antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i PBS 1X /0,4% BSA i 1 time ved stuetemperatur og efterfølgende med ALEXA 568 (Molecular Probes ‘Alexa Fluor 568) sekundære antistoffer i PBS 1X /0,4% BSA i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Efter vask med PBS blev cellerne farvet med monteringsmedium til fluorescens med DAPI (Vector Laboratories). Resultaterne blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi på en Zeiss Axiophot på 40X opløsning.

Antioxidant Activity Måling af DPPH Method

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) quenching metode blev anvendt til evalueringen af ​​antioxidanten aktivitet på 1, 2 og-L-carnosin [15]. Evnen af ​​prøverne til at skyllepumpetab DPPH radikal blev målt ved hjælp af Brand-Williams metoden [16]. Prøver (60 ul) af 1 mM opløsning af 1, 2 og L-carnosin blev tilsat til 3 ml DPPH-opløsning (6 x 10

-4 M), og absorbansen blev bestemt ved 515 nm (Philips PU 8620 serien UV /synligt spektrofotometer) hver 5 min, indtil steady state. For hver antioxidant assay blev en Trolox alikvot anvendes til at udvikle en 50-500 mM standardkurve. Alle data blev derefter udtrykt som Trolox ækvivalenter (mmol TE /L).

Analyse af Cell Levedygtighed

MTT-analysen blev udført i overensstemmelse med protokollen tidligere rapporteret [17]. HCT-116-celler blev udpladet ved en densitet på 1 x 10

5-celler i 96-brønds plader. Efterfølgende blev bis-diaminotriazole forbindelserne (1 og 2) analyseres under anvendelse koncentrationer fra 0,05 til 0,5 mm. Efter 24 timers inkubering, 10 pi 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) (Sigma-Aldrich) (0,05 mg /ml) blev tilsat til dyrkningsmediet. Efter 4 timer ved 37 ° C blev dyrkningsmediet fjernet, og 200 pi DMSO blev tilsat for at opløse saltene af formazan. Absorbansen blev målt med en 96-brøndplade spektrofotometer ved 570 nm. Eksperimenterne blev individuelt gennemført tre gange, og hvert eksperiment indeholdt tredobbelt replikater. Kontrolprøver med et komplet dyrkningsmedium uden celler eller kontrolceller uden L-carnosin blev også inkluderet i hvert forsøg.

klongenicitetsassayet

HCT116-celler blev udpladet med en densitet på 500 celler /brønd i 12-brønds plader i 500 pi frisk dyrkningsmedium indeholdende komplet DMEM med 20-50-100 mM L-carnosin eller bis-diaminotriazole forbindelserne (1 og 2) (fra 0,05 til 0,5 mM). Efter 7 dage blev cellerne vasket to gange med PBS 1X og farvet med en opløsning af 0,2% krystalviolet, 50% methanol og 10% eddikesyre i H

2O i 30 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev cellerne vasket med deioniseret H

2O og fotograferet.

Måling af reaktive oxygenarter (ROS)

Dannelsen af ​​ROS blev vurderet ved hjælp af 2,7-dichlorofluorescein diacetat probe (H2DCF-DA) (indkøbt fra Sigma-Aldrich). HCT-116-celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd i plader med 96 brønde i 100 pi frisk dyrkningsmedium indeholdende DMEM uden phenolrødt. Celler lodes vokse i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2, så-L-carnosin (fra 0,5 til 100 mM) eller forbindelserne 1 og 2 (fra 0,05 til 0,5 mM) blev tilsat til dyrkningsmediet . ROS foranstaltning blev udført ifølge protokollen tidligere rapporteret [18]. Fluorescens blev overvåget ved anvendelse af en LS 55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer Ltd., Beaconsfield, England). I hvert forsøg blev fluorescensen stigning målt i tre replikatkulturer for hver behandling.

transfektionsassay og Luciferase Reporter Assay

Cellerne blev transficeret med hypoxi responselementet (HRE) -luciferase reporter plasmid eller med en vektor indeholdende oxygen-afhængige nedbrydning (ODD) domæne af HIF-1α, under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i serum-frit OptiMEM-1 medium (Lonza, Verviers, Belgien), i henhold til fabrikantens specifikationer. Kulturer blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2 i 24-48 timer. Luciferaseaktivitet blev vurderet ved Dual-Luciferase Reporter assaysystem (Promega, Madison WI, USA) og med en Promega GloMax 20/20 luminometer, ifølge producentens specifikationer.

Fremstilling af Total, kerner og cytosol Protein ekstrakter

Total ekstrakter af HCT-116 blev fremstillet 24 timer efter behandling med L-carnosin fra 0,5 til 100 mm eller med 1 eller 2 fra 0,05 til 0,5 mm. Prøverne blev vasket to gange med iskold PBS 1X og centrifugeret ved 240 g i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten blev resuspenderet i en kold lysebuffer indeholdende 1% Triton X100, 0,1% SDS, 0,1% NaN

3, 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,1 mM Na

3VO

4, 10 mM Nappi, 0,5 mM PMSF og 10 pg /ml aprotinin, leupeptin og pepstatin ved 4 ° C i 30 minutter på is. Cellelysaterne blev centrifugeret ved 20.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. For cytosolisk og nukleare ekstrakter HCT116 celler blev høstet, vasket to gange med iskold PBS 1X og centrifugeret ved 240 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten blev resuspenderet i 100 pi iskold hypotonisk lysepuffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 1 mM PMSF, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Na

3VO

4, 10 ug /ml af hver af aprotinin, leupeptin og pepstatin) og inkuberet under omrystning ved 4 ° C i 15 min. Derefter blev cellerne lyseret ved tilsætning af 5% NP40. Den cellulære ekstrakt blev centrifugeret i 5 minutter ved 500 x g og supernatanten indeholdende den cytosoliske fraktion blev derefter opnået efter yderligere centrifugering i 10 minutter ved 20.000 x g.

nukleare pellet blev resuspenderet i højt saltindhold ekstraktionsbuffer ( 20 mM HEPES pH 7,9, 0,4 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 ug /ml af hver af aprotinin, leupeptin og pepstatin) og inkuberet under omrystning ved 4 ° C i 15 minutter . Den nukleare ekstrakt blev derefter centrifugeret i 15 minutter ved 20.000 x g, og supernatanten blev opdelt i portioner og opbevaret ved -80 ° C. Proteinkoncentration blev bestemt ved en Bio-Rad-protein-assay-kit (Bio-Rad Laboratories). For western blot-analyser blev proteinerne opnået udfordret med antistoffer mod HIF-1α (kanin polyklonalt antistof fra Santa Cruz Biotechnology), aldolase A (ABNOVA), aldolase C (kanin polyklonalt antistof fra Santa Cruz Biotechnology) og β-actin (mus monoklonalt fra Santa Cruz Biotechnology). Signalerne blev påvist ved anvendelse af ECL-kittet (GE Healthcare).

Immunopræcipitation

HCT-116-celler blev lyseret i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 250 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 5 mM EDTA og 1 mM DTT) suppleret med proteaseinhibitorer. Prøverne (800 ug) blev for-klaret med 30 pi protein A /G PLUS-agarose (Santa Cruz Biotechnology) i 2 timer ved 4 ° C. Den anti-HIF-1α antistof (kanin polyklonale antistof fra Santa Cruz Biotechnology) blev tilsat til lysat og inkuberes natten over ved 4 ° C og derefter 30 pi protein A /G PLUS-Agarose blev tilsat til lysatet. Efter 1 time ved 4 ° C proteinerne blev udvundet i Laemmli-puffer, opløst på 8% denaturerende gel og derefter underkastet immunblotting.

Real-time PCR assay

Totalt RNA blev fremstillet ud fra HCT -116 celler ved hjælp af RNeasy mini kit (Qiagen) og blev anvendt til at syntetisere cDNA med tilfældige hexanukleotid-primere og MultiScribe revers transkriptase (Invitrogen) ved 48 ° C i 1 time. CDNA’et blev derefter amplificeret i et iCycler iQ real time PCR detection system (Bio-Rad Laboratories) under anvendelse iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Real-Time PCR reaktioner og relativ kvantificering genekspression blev udført som rapporteret i [19]. Forholdene mellem 2

-ΔΔ

CT

før behandling med L-carnosin og dem, der beregnes for prøverne inkuberet med-L-carnosin fra 5 til 100 mM udtrykkes som fold ændringer.

statistisk analyse

Resultater blev udtrykt som middelværdien ± SDS (standardafvigelser) af tre uafhængige forsøg. Den statistiske analyse blev udført ved anvendelse envejs variansanalyse ANOVA og P-værdi for en multiple sammenligningstest. Niveauet af statistisk signifikans blev defineret som ** p 0,001, *** p 0,0001 [2]. Analyserne blev udført ved hjælp af GraphPad PRISM-software (version 3.0, GraphPad Software, Inc .: La Jolla, CA, USA, 2002) på en Windows-platform

Resultater

-L-carnosin Reducerer HIF. -1a proteinniveauer påvirker dets Stabilitet i HCT-116 Cells

for at fastslå virkningen af ​​dipeptidet L-carnosin på ekspressionen af ​​HIF-1α transskriptionsfaktor, humane colon carcinomceller (HCT-116) blev behandlet med forskellige koncentrationer af L-carnosin (fra 0,5 til 100 mm). Især RT-PCR-analyse, 24 timer efter L-carnosin Desuden afslørede en konstant tilstand af HIF-1α mRNA’er niveauer sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (figur 1A). Dernæst vurderede vi virkningerne af L-carnosin på HIF-1α proteinekspression i de HCT-116-celler ved Western blot analyse. De proteinniveauer blev vurderet både i hypoxi og normoxi, samt i nærvær (fra 0,5 til 100 mm) og fravær af L-carnosin. I HCT-116 normoksiske celler, 50-100 mM L-carnosin reducerede ekspressionen af ​​HIF-1α sammenlignet med en kontrolprøve ikke er behandlet med-L-carnosin (figur 1B). Vi observerede også, at hypoxi-induceret (ved CoCl

2) udtryk for HIF-1α faldt efter behandling med 50 eller 100 mM-L-carnosin (figur 1C). Blottene blev re-probet med antistoffer mod β-actin at bekræfte proteinet belastning ækvivalens. For at bekræfte en reduktion af HIF-1α udførte vi en immunpræcipitationsassay. Vi fandt, at HIF-1α-antistof immunopræcipitat indeholdt signifikante niveauer af HIF-1α protein kun i kontrolprøven (figur 2A). Derudover undersøgte vi effekten af ​​L-carnosin på HIF-1α proteinsyntese i celler behandlet med cycloheximid (CHX). Analysen af ​​HIF-1α proteinstabilitet i CHX-behandlede celler viste, at niveauet af HIF-1α faldt i-L-carnosin-behandlede celler (50-100 mM), hvilket antyder, at-L-carnosin påvirker HIF-1α proteinstabilitet (fig. 2B). Desuden undersøgte vi, om dette dipeptid kan inddrages i proteasomet nedbrydning af HIF-1α. Derfor har vi vurderet ved Western blot-analyse virkningen af ​​proteasominhibitor MG132 på HIF-1α proteinniveauer efter behandling med 50-100 mM L-carnosin. Som vist i figur 2C, behandling med 1 mM MG132 og-L-carnosin i 24 timer forøgede HIF-1α proteinniveauet sammenlignet med ubehandlede kontrolceller eller celler behandlet med MG132 alene. En yderligere indikation for inddragelse af L-carnosin i HIF-1α proteasom nedbrydning blev opnået ved transfektion af en vektor indeholdende ODD domæne af HIF-1α. Som vist i figur 2D, luciferaseaktiviteten faldt mærkbart 24 timer efter behandling med-L-carnosin (100 mM).

(A) HIF-1α mRNA’er blev målt ved real time PCR i en total RNA-præparat fra HCT -116 celler 24 timer efter L-carnosin behandling. Hvide søjler angiver fold ændringer i mRNA i forhold til mængden af ​​HIF-1α mRNA i ubehandlede celler rapporteret som værdien 1; (B) Western blotting-analyse af totale proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer efter L-carnosin og (C)-L-carnosin og CoCl

2 behandling probet med HIF-1α og p-actin-antistoffer. Relaterede histogrammer rapporterer densitometriske værdier af HIF-1α /β-actin-forhold. De densitometriske værdier repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg. Forskellene blev betragtet som signifikante på ** p 0,001, *** p 0,0001

(A) Western blotting-analyse undersøgt med anti-HIF-1α antistof immunopræcipiterede proteiner i HCT-116.; (B) Western blotting-analyse af totale proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer efter-L-carnosin (100 mM) eller-L-carnosin (100 mM) plus 10 mM cycloheximid (CHX) behandling probet med HIF-1α og β-actin antistoffer. Relaterede histogrammer rapporterer densitometriske værdier af HIF-1α /β-actin forhold; (C) Western blotting-analyse af totale proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer efter-L-carnosin (100 mM) eller-L-carnosin (100 mM) plus 1 mM MG132 behandling probet med HIF-1α og p-actin-antistoffer. De densitometriske værdier repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg. Forskellene blev betragtet som signifikante på ** p 0,001, *** p 0,0001; (D) Skematisk repræsentation af ODD-LUC reporter vektor. ODD-LUC-vektoren indeholder oxygen-afhængige nedbrydning (ODD) domæne af HIF-1α klonet opstrøms for luciferasegenet. Luciferaseaktiviteten blev målt 48 timer efter transfektion og repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg. Værdierne er blevet rapporteret som procentdele af luciferaseaktivitet sammenlignet med 100% af ubehandlede celler.

L-carnosin Influence HIF-1α Nuclear Translokation Reduktion transkriptionsaktiviteten af ​​Hypoxi Responsive Element (HRE) og Expression af dens downstream Gener

Stabiliseret HIF-1α protein translokerer fra cytoplasmaet til kernen, hvor det dimeriserer med HIF-1β danner transkriptionelt aktive HIF-1-komplekset. Derfor er den nukleare lokalisering af HIF-1α er essentiel for den transkriptionelle aktivitet af HIF-1α. Virkningen af ​​L-carnosin på den intracellulære lokalisering af HIF-1α blev analyseret på et første trin ved western blotting under anvendelse af cytoplasmatiske og nukleare proteinfraktioner, derefter ved immunofluorescensanalyse. Som vist i figur 3A og 3B, L-carnosin påvirkninger translokationen af ​​HIF-1α fra cytoplasmaet til kernen. I virkeligheden, når HCT-116 celler blev behandlet med-L-carnosin nukleare protein niveauer af HIF-1α faldt mærkbart, mens de cytosoliske niveauer ikke blev berørt. Også i immunofluorescensanalyse (figur 3C) HIF-1α signal i-L-carnosin behandlede celler var svagt detekterbar sammenlignet med ubehandlede kontrolceller eller CoCl

2-behandlede celler. I cancerceller, aktivering af HIF-1-komplekset indebærer dets associering med HRE motiv i de regulatoriske regioner af target gener involveret i den glycolytiske proces. Af denne grund blev HCT-116-celler transient transficeret med HRE-luciferasereporterplasmid. Som vist i figur 3D, behandling med 100 mM-L-carnosin forårsagede mærkbar nedgang i luciferaseaktivitet (24 timer efter behandlingen). Efterfølgende vurderede vi mRNA’erne af nogle HIF-1a-afhængige gener. Vi målt ved RT-PCR-analyse af virkningerne af forskellige koncentrationer af L-carnosin (0,5, 5, 50 og 100 mM) på mRNA-niveauer af aldolase A og PDK-1. Som vist i figur 4B, aldolase A og PDK-1 mRNA’er koncentrationen faldt efter behandling med L-carnosin, især mellem 50 og 100 mM. Western blot analyse af aldolase A demonstrerede også en reduktion af proteinniveauet (figur 4C). Derudover observerede vi, at ekspressionen af ​​GLUT-1-protein, såvel som af aldolase C-protein, faldt efter-L-carnosin behandling (figur 4D og 4E). Aldolase C er en hjerne-specifik isoform af aldolase, men for nylig er det blevet påvist, at mRNA niveau af aldolase C er 30 gange højere i humane gastrisk cancer cellelinjer. De oligonukleotidsekvenser, der anvendes i RT-PCR-analyser er vist i figur 4A.

(A) Western blotting-analyse af cytosolisk og (B) nuklear proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer efter 20-50-100 mM L-carnosin behandling probet med HIF-1α, β-actin og histon H3-antistoffer. Relaterede histogrammer rapporterer densitometriske værdier af HIF-1α /β-actin og HIF-1α /H3-forhold. De densitometriske værdier repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg. Forskellene blev betragtet som signifikante på *** p 0,0001; (C) HCT-116 behandlet med CoCl

2 og 100 mM-L-carnosin i 24 undersøgte med fluorescens mikroskop ved 40x forstørrelse med anvendelse filtre til sekundært antistof mod HIF-1α protein h og 4′-6′-diaminodino-2 -phenylindole (DAPI); (D) Skematisk repræsentation af HRE-LUC reporter vektor. HRE-LUC vektoren indeholder ni gentagne sekvenser af Hypoxi Reaktion Element (HRE) klonet opstrøms for luciferasegenet. Luciferaseaktiviteten blev målt 48 timer efter transfektion og repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg. Værdierne er blevet rapporteret som procentdele af luciferaseaktivitet sammenlignet med 100% af ubehandlede celler

(A) Tabellen rapporterer primersekvenserne anvendes i Real Time PCR-forsøg.; (B) aldolase A og PDK-1 mRNA

S blev målt ved real time PCR i en total RNA-præparat fra HCT-116-celler 24 timer efter-L-carnosin behandling. Streger indikerer fold ændringer i mRNA

S med hensyn til mængden af ​​aldolase A og PDK1 mRNA’er i ubehandlede celler rapporteret som værdien 1; (C), (D) og (E) western blotting analyser af de samlede proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer efter-L-carnosin behandling probet med aldolase A, aldolase C, GLUT-1 og p-actin-antistoffer. Histogrammer rapporterer densitometriske værdier af aldolase A /β-actin-forhold, aldolase C /β-actin-forhold og GLUT-1 /β-actin-forhold. De densitometriske værdier repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg. Forskellene blev betragtet som signifikante på ** p 0,001, *** p 0,0001

The Antioxidant Effekt af forbindelser 1 og 2 I forhold til L-dipeptidcarnosin

generation af. reaktive oxygenarter (ROS) under hypoxi tilvejebringer et redox signal for HIF-1α induktion. Faktisk nogle forfattere definerer ROS som positive regulatorer af HIF-1α [20]. Den iagttagelse, at andre antioxidanter kan påvirke niveauet af HIF-1α-protein førte os til at evaluere antioxiderende aktivitet af to hidtil ukendte bis-diaminotriazole forbindelserne (1 og 2) (figur 5A), i sammenligning med den for-L-carnosin, ved DPPH assay. Først målte vi procentdelen af ​​DPPH inaktivering under anvendelse af en 1 mM koncentration for alle forbindelser, og vi demonstreret, at forbindelserne 1 og 2 har en væsentlig aktivitet som ROS scavengers sammenlignet med-L-carnosin (se tabellen i figur 5B). Dernæst undersøgte vi intracellulære ROS-generering induceret af-L-carnosin (100 mM) i HCT-116-celler og sammenlignet det med mængden af ​​ROS genereret ved at behandle den samme cellelinje med forskellige koncentrationer (fra 0,05 til 0,5 mM) af forbindelser 1 og 2. som vist i figur 5C, behandling med, 0,1 og 0,5 mM af 1 og 2 reducerede intracellulære ROS-generering i HCT-116 med ca. 40-50% lighed med 50-100 mM-L-carnosin. Endelig har vi også vurderet virkningen af ​​forskellige koncentrationer af 1 og 2 (fra 0,05 til 0,5 mM) på HIF1-α ekspression og cellelevedygtighed. Som vist i figur 6A og 6B, har tilsætning af 1 og 2 påvirker ikke de HIF-1α proteinniveauer eller celleproliferationen. Desuden har vi vurderet ved klonogene overlevelse assay evne HCT-116-celler at proliferere og danne en stor koloni eller en klon i nærvær af L-carnosin eller 1 eller 2 (figur 6C). 50 mM-L-carnosin reduceret antallet af kolonier i forhold til den ubehandlede kontrolprøve, hvorimod forbindelserne 1 og 2 ikke påvirkede den celler evnen til at danne kolonier ved den undersøgte koncentration. En flowcytometriassayet (FACS) bekræftede, at 1 og 2 ikke påvirkede cellecyklussen og ikke inducere apoptose i HCT-116-celler (data ikke vist). Den tidlige apoptotiske dødstal i HCT-116-celler behandlet med de to forbindelser var ikke signifikant forskellig fra kontrolprøven

(A) Kemiske strukturer af forbindelserne 1 og 2.; (B) Antioxidant aktivitet af L-carnosin, 1 og 2 målt ved DPPH-metoden som beskrevet i afsnit 1.2.4; (C) ROS produktion evalueret 24 timer efter tilsætning af L-carnosin, 1 og 2 i HCT-116 celler ved sonden 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (H2DCF-DA). Alle værdier repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg og er udtrykt som en procentdel sammenlignet med 100% af kontrolceller. Forskellene blev betragtet som signifikante på ** p 0,001, *** p. 0,0001

(A) Western blotting-analyse af de samlede proteinekstrakter fra HCT-116 celler efter behandling med forbindelser 1 og 2 probet med HIF-1α og p-actin-antistoffer. Histogrammer rapporterer densitometriske værdier af HIF-1α /β-actin-forhold. De densitometriske værdier repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg; (B) celleproliferationen blev målt ved MTT-assay i HCT-116-celler 24 timer efter behandling med forbindelserne 1 og 2. Alle værdier repræsenterer middelværdien ± SD’er af tre uafhængige forsøg og er udtrykt som en procentdel sammenlignet med 100% af kontrolceller ; (C) Klonogen overlevelse assay i HCT-116 efter behandling med-L-carnosin (50 mM) eller forbindelser 1 og 2 (0,5 mM) i forhold til ubehandlede celler.

Diskussion

i denne undersøgelse har vi vurderet virkningen af ​​L-carnosin behandling på HIF-1α-aktivitet i humane coloncancer-celler.