PLoS ONE: aptamer-dendrimer biokonjugater for Målrettet Levering af miR-34a udtrykkende plasmid og antitumorvirkningerne i ikke-småcellet lungekræft celler

Abstrakte

Metastase og lægemiddelresistens er store barrierer for behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). At udforske nye terapeutiske muligheder, vi med succes indkapslet MicroRNA-34a (miR-34a), en potent endogen tumor suppressor i NSCLC i S6 aptamer-konjugeret dendrimer at danne lungecancerrelaterede målrettet gen levering nanopartikler (PAM-AP /pMiR-34a NP’er) . PAM-Ap /pMiR-34a NP’er havde en diameter på 100-200 nm og Zeta potentiale ~ 30 mV ved anvendt N /P-forhold. Aptameren konjugering væsentligt forbedret cellulær optagelse samt gen transfektionseffektiviteten af ​​PAM-AP /pMiR-34a NP’er i dyrkede NSCLC celler. Vi viste, at PAM-Ap /pMiR-34a NP forbedret regulering af målrettede gener, BCL-2 og p53

in vitro

. Desuden afslørede vi PAM-AP /pMiR-34a NP’er signifikant hæmmede cellevækst, migration, invasion og induceret apoptose af lungekræft celler sammenlignet med ikke-målrettede NP’er. Metoden forudsat en roman terapeutisk strategi for eksperimentel behandling af NSCLC

Henvisning:. Wang H, Zhao X, Guo C, Ren D, Zhao Y, Xiao W, et al. (2015) aptamer-dendrimer biokonjugater for Målrettet Levering af miR-34a udtrykkende plasmid og antitumorvirkningerne i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 10 (9): e0139136. doi: 10,1371 /journal.pone.0139136

Redaktør: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, Spanien

Modtaget: May 5, 2015; Accepteret: September 8, 2015; Udgivet: 25 September, 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Videnskab og Teknologi Development Plan Projekt i Shandong-provinsen (2013WS0273). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i hele verden [1]. Ca. 85% af alle de tilfælde kliniske lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [2, 3]. Trods talrige fremskridt i kirurgisk behandling, kemoterapi og molekylære målrettede agenter for NSCLC, metastase og multiresistens er fortsat store årsager til fejl i behandling af lungekræftpatienter [4, 5]. Det er således yderst ønskeligt at udvikle nye terapeutiske metoder end konventionelle behandling for NSCLC. MikroRNA’er (miRNA) er blevet vist at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​humane cancere og kan være effektive mål for cancerterapi [6]. MiRNA er små RNA’er af ~ 22 nukleotider lang, som er kritiske regulatorer af genekspression [7]. Modent miRNA mål-mRNA ved komplementære sites, hvilket fører til mRNA nedbrydning og translationel suppression [8, 9]. Blandt mere end 700 humane miRNA identificeret, MIR-34a er en transkriptionel mål for tumor suppressor p53 [10], og nedreguleres MIR-34a-ekspression korrelerer med en høj sandsynlighed for tilbagefald hos NSCLC-patienter [11]. Desuden overekspression af MIR-34a hæmmer væksten og metastase af NSCLC ved at regulere flere tumorsuppressorer eller onkogener, såsom p53, BCL-2, c-Met og CDK4 [12]. Tidligere rapporter har vist, at overekspression af MIR-34a kunne forhindre progression og metastase af NSCLC, samt styrke kemoterapi følsomhed.

Udviklingen af ​​miRNA-baserede terapeutiske har blive et lovende alternativ strategi til konventionel behandling, herunder kemoterapi og radioterapi for NSCLC behandling. Men den kliniske anvendelse af miRNA møder mange biologiske udfordringer, såsom hurtig blod clearance, dårlig stabilitet i serum og utilstrækkelig cellulær optagelse [13]. Tumortargeting nano-administrationssystemer er blevet udviklet for at overvinde disse problemer [14, 15]. Gen-loaded nanocomplexes anses for at være en bedre egnet til kræftbehandling på grund af deres passive ophobning i solide tumorer ved deres forbedrede permeabilitet og fastholdelse (EPR) egenskaber i de hurtigt voksende tumorer [16]. Funktionalisering af polymerer med specifikke celle-targeting ligander kan forbedre deres tumor ophobning mere end EPR effekt [17], som forbedrer transfektionseffektiviteten og biokompatibilitet af disse gen-loaded nanocomplexes.

polyamidoamin (PAMAM) er kationiske med dendritiske struktur. Gennem elektrostatiske interaktioner, PAMAM og negativt ladede pDNA danner nanocomplexes der er almindeligt anvendt som ikke-virale genvektorer til transfektion exogent DNA eller RNA i celler [18]. Vigtigt er det, kan molekylet vægten og ladningsdensitet PAMAM nemt manipuleres til at have overlegen sikkerhed. Til dato har en lang række potentielle biomarkører for lungekræft blevet identificeret, såsom EGFR, TP53, CA-125 og CEA, men fraværet af specificitet og følsomhed var stadig et problem i praksis af målrettet lægemiddelafgivelse [19].

Aptamerer er korte, enkeltstrengede oligonukleotider (DNA eller RNA) udvalgt fra SELEX-fremgangsmåden (systematisk evolution af ligander ved eksponentiel berigelse). Sammenlignet med antistoffer, fordelene ved aptamerer er forskellige, såsom bekvem syntese og modifikation, høj affinitet og specificitet til målmolekylerne, lav immunogenicitet, mindre toksicitet, højere stabilitet og hurtig vævsgennemtrængning [20, 21]. Derfor kan aptamer-konjugeret nanocomplexes levere oligonukleotider i en celletypespecifik måde med den forbedrede transfektionseffektivitet og /eller reducerede bivirkninger til normale celler [22]. Adskillige cellespecifikke aptamere er blevet anvendt til genafgivelse, men en aptamer-konjugeret nanocomplex anvendes i behandlingen af ​​NSCLC er begrænset. I vores arbejde har vi udviklet PAMAM-PEG-aptamer-forbindelse (PAM-Ap) ved anvendelse af S6, en aptamer valgt mod A549 lungecancerceller ved celle-SELEX [23] og vedtaget at funktionalisere PAMAM G5.0, derefter blandet vi PAM Ap med pMiR-34a til at konstruere PAM-AP /pMiR-34a nanopartikler (PAM-AP /pMiR-34a nationale parlamenter) til at levere af pDNA til lungekræft celler. Næste vurderede vi genet transfektionseffektivitet og antitumorvirkningen af ​​PAM-AP /pMiR-34a NP’er i A549-celler. Vore data viser aptameren-dendrimer biokonjugaterne systemet er en effektiv måde at levere miR-34a udtrykker plasmid til ikke-småcellet lungekræft celler.

Materialer og Metoder

Materialer

polyamidoamin- (PAMAM, ethylendiamin kerne, G5.0) og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Maleimid polyethylenglycol succinimidylester (Mal-PEG-NHS, Mw 2000) blev indkøbt fra Bio-matrix Inc. (Jiaxing, Kina). Gelred

TM DNA gel pletten blev købt fra Biotium (CA, USA). Føtalt bovint serum (FBS), RPMI-1640 dyrkningsmedium, Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS), trypsin, penicillin-streptomycin og YOYO-1 iodid blev købt hos Invitrogen /Life Technologies (Carlsbad, CA). Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) farvning kit var fra BD Biosciences (San Jose, CA). Celletælling Kit 8 (CCK-8), RIPA protein lyseringsbuffer og BCA proteinassay-kit blev indkøbt fra Beyotime (Nanjing, Kina). A549 celle bindende aptamer (S6, sekvens: GTGGCCAGTCACTCAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG) med sulfhydrylgruppe ved 5′-enden blev syntetiseret af RiboBio Co. Ltd (Guangzhou, Kina). MIR-34a og forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) co-udtrykkende plasmid (pMiR-34a, sense: 5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3 ‘, antisense: 5′-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3′) og negativ kontrol-plasmid (pMiR-NC, forstand: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) blev opnået fra SunBio Co.Ltd (Shanghai, Kina). A549 humane NSCLC-cellelinje blev opnået fra Institut for Biokemi og Cell Biology, SIBS, CAS (Kina). Celler blev dyrket i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS, penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C inkubator med 5% CO

2.

Syntese af aptamer konjugeret dendrimer (PAM-Ap)

for at syntetisere aptamer konjugeret dendrimer, 100mg PAMAM (methanol opløsning) blev tørret under nitrogen og opløst i 5 ml PBS (pH 7,2). Derefter 20 mg Mal-PEG-NHS (Mw 2000) blev tilsat til PAMAM opløsning og omrørt i 6 timer, og derefter blev blandingen dialyseret i destilleret vand under anvendelse dialysemembran (MWCO 3500 Da) i 24 timer for at fjerne uomsat Mal-PEG- NHS, efterfulgt af lyofilisering for at få pegyleret PAMAM (PAM-PEG-Mal). For konjugeringen af ​​S6 aptamer, blev 25 mg PAM-PEG-Mal opløst i 2 ml PBS (pH 7,2). Derefter 50 nM S6 aptamer blev blandet med opløsningen i 6 timer blev produktet derefter dialyseret mod destilleret vand under anvendelse dialysemembran (MWCO 7500 Da) i 12 timer og lyofiliseret for at få PAMAM-PEG-Ap (PAM-Ap).

Formulering og karakterisering af pDNA nanopartikler Salg

på pDNA bindingsevnen evaluering, 1 ug pDNA blev blandet med PAM-Ap ved N /P-forhold i området fra 0,5 til 16 PBS (pH 7,2 ). Hver prøve blev hvirvlet i 20 s, inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur til dannelse af PAM-AP /pDNA NP’er. Derefter blev prøverne elektroforeret i 1,5% agarosegel indeholdende Gelred

TM i 20 min (100 V), og båndene af pDNA blev visualiseret under UV-lys. For partikelstørrelse og Zetapotentialet måling, PAM-AP /pDNA NP’er blev fremstillet ved forskellige N /P-forhold i destilleret vand og bestemmes ved en Zetasizer Nano ZS (Malvern Inc., Westborough, MA). For serum stabilitetstest, den nøgne pMiR-34a, PAM /pMiR-34a og PAM-AP /pMiR-34a-komplekser (N /P = 40) blev inkuberet i 50% FBS ved 30 ug /ml. Blandingerne blev inkuberet ved 37 ° C i forskellige tidsintervaller. Derefter blev 20 pi af blandingerne behandlet med 10 pi heparin (1000 U /ml) for at frigøre den belastede pDNA efter elektroforese på en 1,0% w /v agarosegel indeholdende Gelred

TM i 15 min. Den ikke-nedbrudt pDNA blev visualiseret under UV-lys.

Flowcytometri for cellulær optagelse assay

A549-celler blev podet i 6-brønds plader ved en densitet på 3 x 10

5 celler pr og dyrket i 24 timer. PAM-Ap /pDNA eller PAM /pDNA NP’er blev fremstillet med YOYO-1 mærket pDNA (1 molekyle YOYO-1 iodid til 20 basepar af nukleotid) ved N /P-forhold på 40. Før transfektion blev dyrkningsmediet fjernet. Derefter 2 ml serumfrit RPMI 1640-medium indeholdende PAM-AP /pDNA eller PAM /pDNA NP blev sat til hver brønd (pDNA 4 ug /brønd). Efter 4 timers inkubation blev transfektionsblandingen mediet fjernet. Cellerne blev vasket, trypsiniseret og resuspenderet i DPBS og prøver blev straks bestemt ved flowcytometri (BD, San Jose, CA). For konkurrence undersøgelse af S6 aptamer medieret cellulær optagelse af PAM-Ap, blev A549-celler udsået i 6-brønds plader, 30 min før PAM-Ap /pDNA NP behandling blev en 50-fold overskud af S6 aptamer tilsat til dyrkningsmedium og inkuberet i 4 timer før analyseret cellerne som ovenfor.

Konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) undersøgelse

A549-celler blev podet i dækglas i 24-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

4 per brønd og dyrket i 24 timer. Den YOYO-1 mærket PAM-Ap /pDNA eller PAM /pDNA NP’er blev fremstillet med den samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor. Cellerne blev transficeret med PAM-AP /pDNA eller PAM /pDNA NP’er ved en pDNA koncentration på 1 ug /brønd. Efter 4 timers inkubation blev cellerne vasket og fikseret med 4% formaldehyd, farvet med DAPI. De ekstracellulære polymerer /pDNA nanopartikler blev vasket med DPBS indeholdende heparin. Billederne blev taget med konfokal laser scanning mikroskop (Olympus, Japan).

Transfektionseffektivitet evaluering

For at vurdere transfektion effektivitet, 1,5 × 10

5 af A549 celler blev podet i 12 Tja plader og dyrket i 24 timer. A549-celler blev transficeret med PAM-AP /pMiR-34a eller PAM /pMiR-34a NP’er (2 ug pMiR-34a per brønd) ved N /P-forhold på 10, 20 og 40 i 4 timer. Efter transfektion blev mediet udskiftet, og cellerne blev dyrket i yderligere 48 timer. EGFP-udtrykkende celler blev afbildet ved hjælp af fluorescens mikroskop (Leica, Tyskland) og kvantificeret ved flowcytometri.

RNA-isolering og qPCR analyse

Niveauerne af BCL-2 og p53-mRNA blev bestemt ved kvantitativ real-Time PCR (QRT-PCR). A549-celler blev podet i 6-brønds plader ved en densitet på 3 × 10

5 per brønd og dyrket i 24 timer. Transfektion af PAM-AP /pMiR-34a eller PAM /pMiR-34a NP’er blev udført som beskrevet ovenfor. Efter 48 timers inkubation blev dyrkningsmediet fjernet, og cellerne blev vasket med PBS. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy mini-kits (Qiagen, Germantown, MD) ifølge producentens protokol. BCL-2 og p53-mRNA-niveauer blev kvantificeret ved anvendelse iScript

TM ettrins RT-PCR kit med SYBR green (Bio-Rad, CA) under anvendelse iQ

TM5 RT-PCR detection system. Relative genekspressionsniveauer blev beregnet ved en sammenlignende Ct metode mod endogen kontrol β-actin-ekspressionsniveau. Data er normaliseret BCL-2 eller p53-ekspression niveau af ubehandlede celler. Sekvenser af genspecifikke primere til qPCR er som følgende: β-actin (sense) 5′-GGATCCGACTTCGAGCAAGAGATGGCCAC-3 ‘(antisense) 5′-CAATGCCAGGGTACATGGTGGTG-3′; BCL-2 (sense) 5’-TTGGATCAGGGAGTTGGAAG-3 ‘(antisense) 5′-TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3′; p53 (sense) 5’-ACCAGGGCAGCTACGGTTTC-3 ‘(antisense) 5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTCC-3’.

Western blot-analyse

A549-celler blev dyrket og behandlet som beskrevet ovenfor. Totalt protein blev ekstraheret ved RIPA lysebuffer og blev kvantificeret ved BCA proteinassaykit. 40 mg protein blev påsat og separeret på 10% Ready Gel Tris-HCI Gel (Bio-Rad, CA) og derefter overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran (Millipore, Bedford, MA). PVDF-membranen blev blokeret med 5% skummetmælk i 1 time og undersøgt med primære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time. Efterfølgende blev membranen farvet med HRP-konjugeret sekundært antistof og båndene blev påvist med ECL Plus kit (Beyotime, Nanjing, Kina).

Cytotoksicitetsassay

In vitro cytotoksicitet blev vurderet ved CCK-8 assay. A549-celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 6.000 celler per brønd og dyrket natten over. Cellerne blev transficeret med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a eller PAM-Ap /pMiR-34a NP’er i 4 timer (2 ug /ml pMiR-34a), derefter blev mediet udskiftet, og cellerne blev yderligere inkuberet i 24 timer, 48 timer, 72 timer eller 96 timer. Efter fjernelse af mediet, 100 pi kulturmedium indeholdende 10 pi CCK-8 blev tilsat til hver brønd og inkuberes i yderligere 1 time, Absorbansen af ​​hver brønd blev målt ved anvendelse af en mikropladelæser (Thermo Scientific, MUTISKAN MK3) ved 450 nm bølgelængde . Cellelevedygtigheden af ​​A549-celler blev udtrykt i forhold til ubehandlede celler.

Cell apoptose analyse

A549-celle apoptose blev bestemt ved flowcytometri som tidligere rapporteret [24]. Kort fortalt blev A549-celler podet i 12-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

5 celler per brønd og inkuberet natten over. Cellerne blev transficeret med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a eller PAM-AP /pMiR-34a NP’er i 4 timer (2 ug /ml pDNA), derefter transfektion blev mediet udskiftet, og cellerne blev yderligere inkuberet i 48 timer. Derefter blev cellerne vasket, trypsiniseret og opsamlet ved centrifugering. Celleapoptosen blev vurderet med flowcytometri efter farvning med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) farvning kit ifølge producentens protokol.

In vitro

migration og invasion assay

migration og invasion evne A549-celler blev evalueret under anvendelse af den modificerede 6,5 mm transwell kammer med polycarbonatmembraner (8,0-mm porestørrelse) (Costar, Cambridge, Mass). A549-celler (1 x 10

5-celler) blev transficeret i 24 timer og blev trypsinbehandlet og suspenderet i 200 pi serumfrit RPMI 1640 medium. Derefter blev cellerne podet på de øverste kamre med den ikke-coatede eller belagt med 20 mg Matrigel (for migration og invasion assay, henholdsvis). Dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS i nederste kammer blev anvendt som kemoattraktant. Efter 24 timers inkubation blev ikke-migrerede eller ikke-invaderende celler tørres af med vatpinde fra toppen kammer. Celler på undersiden af ​​kammeret blev fikseret med 4% paraformaldehyd, derefter farvet med 0,5% krystalviolet opløsning i 1 time og talt under et mikroskop i fem forudbestemte felter.

Statistisk analyse

Data blev vist som middelværdi ± SD. Envejs analyse af varians (ANOVA) blev udført. P-værdi 0.05 blev defineret som statistisk signifikant.

Resultater og Diskussion

Syntese og karakterisering af materialer

Bifunktionel maleimid polyethylenglycol succinimidylester (Mal-PEG-NHS) blev vedtaget for at forbinde aminogruppen af ​​PAMAM og 5′-thioleret S6 aptamer. Dialyse blev anvendt til at oprense produktet. Omsætningen af ​​PAMAM og Mal-PEG-NHS blev monitoreret ved 1H-NMR (300 MHz), med specifikke toppe for PAMAM (2,3, 2,4, 2,7, 3.1ppm) (Fig 1A), PEG (3,6 ppm), MAL (5,8 , 6,3 ppm) (fig 1B). De

1 H-NMR-data bekræftede dannelsen af ​​PAMAM-PEG-MAL. Vi anvendte de integrerede områder af H-NMR toppe at kvantificere forholdet mellem PEG-kæder og PAMAM. Med antagelsen af ​​164 methylenprotoner pr PEG og 2032 pr PAMAM, identificerede vi, at PAMAM-PEG-MAL havde en PAMAM /PEG proton-forhold på 0,32, hvilket indikerer, at hver PAMAM havde i gennemsnit 3,9 PEG kæder forbindelse.

Karakterisering af PAM-AP /pDNA nanopartikler

de frisklavede PAM-Ap konjugater blev opløst i vandige betingelser og blandet med pDNA at danne nano-skaleret partikler. Gennemsnitsstørrelsen af ​​PAM-AP /pDNA NP’er spænder fra 100 til 200 nm, når N /P-forholdet overstiger 5 (Fig 2A). Som N /P-forhold steg, størrelsen af ​​PAM-Ap /pDNA NP’er faldet under 200 nm (Fig 2A), og ingen ændring i størrelse efter at. Disse resultater indikerede dannelsen af ​​tætte nanopartikler mellem PAM-Ap og pDNA. Som vist i fig 2B og 2C, blev størrelsen og zeta-potentialet lidt ændret efter konjugeringen af ​​PEG og aptamer. Størrelsen af ​​PAM-Ap /pDNA steg yderligere til omkring 150 nm, mens zetapotentialet faldet til omkring 31mV, hvilket indikerer, at PEG og aptamer omgivet nanopartikel overflade. Desuden PAM-AP /PDNA NP havde smallere fordeling størrelse i forhold til PAM /pDNA NP’er. PDNA kondensation evne af det syntetiserede PAM-Ap blev målt ved agarosegel retardering. Gelelektroforesen eksperimenter viste en øget N /P-forhold af PAM-Ap /pDNA NP’er (Fig 2D). Og ved N /P-forhold på 4, komplet retardering af PAM-Ap /pDNA blev identificeret.

(A) Størrelsen og Zetapotentialet af PAM-ap NP’er blev målt ved DLS. (B) Størrelsesfordelingen af ​​PAM /pDNA og PAM-Ap nationale parlamenter på N /P = 40. (C) Den Zeta potentielle fordeling af PAM /pDNA og PAM-Ap nationale parlamenter på N /P = 40. (D) Gel retardering elektroforese af PAM-AP /pDNA NP’er. Band 1: Naked pDNA, bands 2-7: PAM-Ap /pDNA NP’er blev fremstillet ved N /P-forhold på 0,5, 1, 2, 4, 8 og 16, henholdsvis. (E) Serum stabilitetstest af pDNA, PAM /pDNA og PAM-AP /pDNA-komplekser i 50% FBS betingelser ved 37 ° C. Dataene blev vist asmean ± SD (n = 3).

Stabiliteten pDNA i komplekser er vigtig for effektiv gen-levering. En agarosegel assay blev indført for at bestemme pDNA stabilitet i 50% serum for at efterligne

in vivo

betingelser. Beskyttelsen virkning af komplekser mod DNA-nedbrydning af serum blev vist i fig 2E. Den nøgne pDNA blev fuldstændig nedbrudt med 50% FBS efter 8 timer, mens PAM /pDNA og PAM-Ap /pDNA udstillet beskyttende virkninger mod serum i 48 h (Fig 2E). Disse resultater antydede, at PAM-Ap ikke alene kunne binde pDNA, men også beskytte det mod nedbrydning i serum, som kan bidrage til den potentielle anvendelse af genet delivery system.

Cellulær optagelse af nanopartikler

udførelsen af ​​ikke-virale genafgivelse vektorer er nært beslægtet med niveauet af cellulær optagelse [25]. Den grønne fluorescens udsendes fra pDNA /YOYO-1 blev analyseret for at vurdere den cellulære optagelse af PAM-AP /pDNA NP’er. A549-celler blev inkuberet med nøgen pDNA, PAM /pDNA eller PAM-AP /pDNA NP, henholdsvis, og derefter YOYO-1-positive celler blev kvantificeret ved flowcytometri repræsenterer graden af ​​cellulær optagelse [26]. Andelen af ​​YOYO-1-positive celler steg med N /P-forhold, hvilket indikerer den cellulære optagelse NPS blev underkastet N /P-forholdet i høj grad (Fig 3A og 3B). PAM-Ap /pDNA NP udstillet højere cellulær optagelse end nontargeted PAM /pDNA NP’er. Ved behandling med PAM-AP /pDNA NP’er på N /P-forholdet 40, A549-celler udviste bemærkelsesværdigt højere fluorescenssignaler (94,2% YOYO-1-positive celler) sammenlignet med PAM /pDNA NP’er behandlede celler (48,5% YOYO-1-positive celler). Disse resultater antyder, at PAM-ap /pDNA NP’er binder fortrinsvis til A549-celler. For yderligere at bevise, at S6 receptor-medieret optagelse af PAM-AP /PDNA nationale parlamenter i cellerne, vi udført konkurrence eksperiment ved forbehandling A549 celler med overskud af S6 aptamer og afslørede en markant lavere optagelse angiver fri aptamer blokerede bindingssteder af S6 på cytolemma overflade af A549-celler, som undertrykte den målsøgende evne PAM-AP /pDNA NP’er.

ubehandlede celler blev anvendt som kontrol. Data blev vist som middelværdi ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskel mellem disse grupper.

De CLSM eksperimenter blev næste gennemføres med yderligere at bekræfte den cellulære internalisering af receptor-medieret målrettet levering af PAM-AP /PDNA NP’er og distribution af pDNA i A549 celler fordi CLSM track YOYO-1 mærket pDNA (grøn fluorescens) formuleret i nanocomplexes. Sammenlignet med ikke-målrettede PAM /pDNA NP, A549-celler behandlet med PAM-AP /pDNA NP udviste stærkere grøn fluorescenssignaler efter 4 h inkubation, hvilket indikerer højere cellulær optagelse af de målrettede NP’er (Fig 4). Notebaly blev fluorescenssignal væsentligt reduceret i aptameren forbehandlet A549 celler under lignende betingelser, hvilket tyder på, at S6 receptor endocytose var en stor vej for PAM-Ap /pDNA nationale parlamenters internalisering. Desuden blev de fleste YOYO-1 signaler observeret i cytoplasmaet, hvilket indebærer de protonsvamp virkninger af PAMAM spillet en afgørende rolle i processen med endosomale /lysosomale escape [27]. Afslutningsvis vores data tyder på, at PAM-AP /PDNA nationale parlamenter viser både gode celle målrette og endosomale /lysosomale flugt egenskaber.

A549 celler behandlet med YOYO-1 mærkede pDNA kompleksbundet med PAM og PAM-Ap (N /P-forhold: 40) med eller uden S6 aptamer forbehandlet. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C. Alle skala barer er 20 um.

Transfektionseffektivitet af nanopartikler

Efter at demonstrere effektiv cellulære optagelse af PAM-AP /PDNA NP, vi næste målte transfektion effektiviteten af ​​PAM-Ap /pMiR-34a nationale parlamenter på A549 celler med en EGFP reporter. Fordi pMiR-34a indeholder ekspressionsvektoren forstærket grønt fluorescerende (EGFP) gen, hvis ekspression er drevet af den samme promotor, kan den EGFP-ekspression direkte afspejler niveauerne af pMiR-34a-ekspression og kan anvendes til at vurdere transfektionseffektiviteten. Som vist i fig 5A og 5B, genet transfektionseffektiviteten af ​​PAM-AP /pMiR-34a NP’er var meget højere end den af ​​PAM /pMiR-34a NP’er ved forskellige N /P-forhold. Det exogene EGFP-genekspression forøges med N /P-forholdet for begge nanopartikler. Transfektionseffektiviteten var lav på N /P-forhold på 10, men steg på N /P-forhold på 20 og 40. EGFP ekspression af PAM-AP /pMiR-34a NP’er på A549-celler var tydelige observeret ved N /P-forhold på 40 , hvilket indikerede, at nanopartikler opnået effektiv genekspression effektivitet. Tilsvarende de kvantitative målinger af EGFP positive celler bekræftede, at 37,9% af cellerne med held blev transficeret med PAM-AP /pMiR-34a nationale parlamenter, når N /P-forholdet var 40, mens det kun var 9,5% for PAM /pMiR-34a NP’er gruppe. Endvidere var der væsentlige forskelle i andelen af ​​transfekterede celler mellem de to grupper på alle N /P-forhold. Disse resultater antyder, at aptamer konjugation væsentlig grad forbedre transfektionseffektiviteten af ​​PAM-AP /pDNA NP’er. Da toksiciteten også stiger med mængden af ​​kationiske polymerer [28, 29], valgte vi nanopartikler på N /P-forhold 40 for de følgende eksperimenter.

Data blev vist som middelværdi ± SD (n = 3). Alle skala barer er 200 um. * P 0,05, signifikant forskel mellem disse grupper.

Indflydelse af genekspression

Over-ekspressionen af ​​anti-apoptotiske gener i kræftceller betragtes som en af ​​de mekanismer for tumor progression. Som en potent regulator af apoptosis, har BCL-2 blevet identificeret i adskillige cancertyper [30]. BCL-2 har vist sig at være hyppigt overudtrykt i lungekræft og dets anti-apoptotiske rolle er tæt forbundet med dens ekspressionsniveauer [31, 32]. Over-ekspression af bcl-2 resultat i cancerceller resistens mod kemoterapi lægemiddelinduceret apoptose [33]. BCL-2 er tidligere blevet identificeret som et lovende nedstrømsmål af MIR-34a [34]. Som en tumor suppressor, p53-inaktivering som reaktion på nogle cancerassocierede stresssignaler er en almindelig genetisk ændring i et flertal af cancertyper [35]. Aktiveret p53 fremkalder mange biologiske resultater, såsom reparation af mindre skader, regulering af celle-cyklus, induktion af replikativ senescens og apoptose. Samspillet mellem p53 og miR-34a er blevet tydeliggjort i mange typer af kræft, herunder NSCLC [36]. Til evaluering af BCL-2-genet undertrykkelse og p53-aktivering aktivitet af pMiR-34a overført A549-celler behandlede vi A549-celler med PAM-Ap /pMiR-34a, PAM /pMiR-34a eller PAM-AP /pMiR-NC NP’er og måles niveauerne af BCL-2 og p53 mRNA’er. Resultaterne fra qPCR viste, at niveauet af BCL-2-mRNA var signifikant nedreguleret og p53-mRNA signifikant opreguleret i A549-celler (fig 6A). Efter 48 timers inkubation, observerede vi 60,8% reduktion af BCL-2 mRNA-ekspression for PAM-Ap /pMiR-34a, men kun 26,5% fald for PAM /pMiR-34a. I mellemtiden, PAM-Ap /pMiR-34a transficerede A549-celler resulterede i en 7,93 ganges forøgelse af p53 mRNA, signifikant højere end den for PAM /pMiR-34a (2,1 gange). Tilsvarende blev ekspressionsniveauet af p53 og BCL-2-proteiner på A549-celler målt ved Western blotting (Fig 6B). Som forventet viste proteinerne den samme tendens som den mRNA-ekspression niveau siden p53-protein ekspression var ureguleret og BCL-2-protein blev reduceret i PAM-Ap /pMiR-34a transficerede A549-celler. Taget sammen indikerer disse resultater, at PAM-Ap /pMiR-34a NP’er er i stand til at påvirke beslægtede gener og proteiner Ekspression i A549-celler. Salg

Celler blev dyrket i 48 timer efter transficeret med PAM-Ap /pMiR-NC NP, PAM /pMiR-34a nationale parlamenter og PAM-AP /pMiR-34a nationale parlamenter i 4 timer. Kvantitativ realtids-PCR-analyse blev vedtaget at kvantificere mRNA-ekspression, og western blotting blev brugt til at bestemme proteinekspression. De ubehandlede celler blev anvendt som kontrol. Data blev vist som middelværdi ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskel i forhold til PAM /pMiR-34a.

vækst Kræft celle hæmning

Dernæst vi vurderet den

in vitro

antiproliferative effekt af PAM ap /pMiR-34a NP’er på A549-celler under anvendelse CCK-8 assay. Efter 24, 48h, 72 h eller 96h transfektion blev hæmning satser af cellevækst målt. Det blev konstateret, at PAM-AP /pMiR-34a NP’er udviste de stærkeste antiproliferative virkninger på A549-celler (fig 7A). Cellelevedygtighed af PAM-AP /pMiR-34a NP’er behandlede A549-celler viste 29,8%, 49,7%, 57,5% og 62,4% mindre end den af ​​kontrolgruppen efter 24 timer, 48 timer, 72 og 96 timer af transfektion hhv. Som inkubationstiden gik, forskellen på cellelevedygtighed mellem PAM-Ap /pMiR-34a og andre grupper steget, og dette kan være på grund af hysterese af eksogent gen udtrykt af pMiR-34a. Det er værd at bemærke, at PAM-Ap /pMiR-NC nationale parlamenter lidt hæmmet vækst A549 celle. Således aptamer bidrog også til antiproliferative effekt af PAM-Ap /pMiR-34a. Disse eksperimentelle resultater viste, at stigningen af ​​gentransfektion i A549-celler påvirket cellevækst. Således PAM-Ap /pMiR-34a NP’er har et potentiale til at blive en målrettet gen delivery system i behandling lungekræft.

(A) In vitro cytotoksicitet af PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR- 34a og PAM-AP /pMiR-34a nationale parlamenter i A549 celler på forskellige tidspunkt efter transfektion. (B) Cellulær apoptose af A549-celler efter behandling med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a og PAM-Ap /pMiR-34a NP’er i 48 timer. CCK-8 assay blev anvendt til at evaluere cellelevedygtighed og flowcytometri blev anvendt til bestemmelse celleapoptose med Annexin /PI-farvning. Data blev vist som middelværdi ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskel mellem disse grupper.

Apoptose har generelt været anset for at være en af ​​de fremherskende mekanismer for celledød [37, 38]. Som vist i fig 7B, de apoptotiske og nekrotiske celler i kontrolgruppen var ikke indlysende ( 10%). Behandlingen af ​​PAM /pMiR-34a og PAM-AP /pMiR-34a NP’er signifikant øget andelen af ​​tidlige og sene apoptotiske celler. Desuden celler behandlet med PAM-AP /pMiR-34a NP’er viste den højeste procentdel af det samlede beskadigede celler, hvilket var betydeligt højere end for de øvrige grupper (P 0,05). Resultaterne viste, at PAM-Ap /pMiR-34a NP’er var mere effektive til at inducere apoptose af A549 celler end ikke-målrettede PAM /pMiR-34a.

In vitro

migration og invasion

der er forskellige ændringer i cancerceller og mikromiljø væv, og ændringerne forårsager cellerne til at migrere eller invadere til sunde væv, hvilket resulterer i metastase af cancer [39]. Derfor migration og

in vitro

invasion assays er væsentligt at evaluere tendens metastase proces. Efter transficeret med PAM-AP /pMiR-34a nationale parlamenter, blev den vandrende og invasive evne A549 celler undersøgt. Som vist i fig 8A og 8B, fandt vi, at PAM-AP /pMiR-34a NP’er signifikant inhiberede migration og invasion af A549-celler. Bemærkelsesværdigt, de vandrende og invasive satser af PAM-AP /pMiR-34a-behandlede celler var 17,7% og 23,8% sammenlignet med ubehandlede celler. Der var imidlertid en meget minimal indvirkning på migration og invasion af celler behandlet med PAM-Ap /pMiR-NC sammenlignet med dem i kontrolgruppen, hvilket kunne udledes, at MIR-34a ekspression hovedsagelig påvirket cellemigration og invasion snarere end S6 aptamer.

Celler blev forbehandlet med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a og PAM-Ap /pMiR-34a NP’er. De ubehandlede celler blev anvendt som kontrol. (A) Repræsentative mikroskopi billeder af migration og kvantitativ analyse af migrerende celler. (B) Repræsentative mikroskopi billeder af invasion og kvantitativ analyse af invasive celler. Data blev vist som middelværdi ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskel mellem disse grupper.

Konklusion

Selv om giftigheden af ​​dendrimerer er en af ​​de faktorer, der begrænsede deres kliniske anvendelser, har dendrimerer været betragtet som “smarte” bærere for deres evne som intracellulær genafgivelse køretøj.