PLoS ONE: Prognostisk og funktionelle betydning af MAP4K5 i bugspytkirtlen Cancer

Abstrakt

Mål

MAP4K5 spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​en række cellulære reaktioner og er involveret i Wnt signalering i hæmatopoietiske celler . Men dens funktioner i humane maligniteter ikke undersøgt. De vigtigste mål med denne undersøgelse er at undersøge de udtryk, funktioner og kliniske betydning af MAP4K5 i pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC).

Materialer og metoder

Ekspressionsniveauerne for MAP4K5, E-cadherin , vimentin og carboxylesterase 2 (CES2) blev undersøgt ved immunhistokemi i 105 PDAC og matches ikke-neoplastiske bugspytkirtel prøver fra vores institution. De RNA sekventering data fra 112 PDAC patienter blev hentet fra TCGA data portalen. Immunoblotting og RNA-sekventering analyse blev anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​MAP4K5 og E-cadherin i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Effekten af ​​knockdown MAP4K5 hjælp siRNA på ekspression af CDH1 og vimentin blev undersøgt af Real-time RT-PCR i Panc-1 og AsPC-1 celler. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af IBM SPSS Statistics.

Resultater

MAP4K5 protein udtrykkes ved høje niveauer specifikt i bugspytkirtlen ductusceller celler i 100% non-neoplastiske bugspytkirtel prøver, men er nedsat eller tabt i 77,1% (81/105) af PDAC prøver. MAP4K5-low korreleret med tabet af E-cadherin (P = 0,001) og reduceret CES2 ekspression (P = 0,002) i vores patientpopulationer. Ekspressionsniveauerne af MAP4K5 mRNA direkte korreleret med ekspressionsniveauerne af CDH1 mRNA (R = 0,2490, P = 0,008) i den anden kohorte af 112 PDAC patienter fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) RNA-seq datasæt. Lignende sammenhænge mellem ekspression af MAP4K5 og E-cadherin blev observeret både på protein og mRNA-niveauer i flere bugspytkirtelkræft cellelinjer. Knockdown MAP4K5 førte til nedsat CDH1 mRNA-ekspression i Panc-1 og AsPC-1-celler. MAP4K5-lav korreleret signifikant med reduceret total overlevelse og var en uafhængig prognosticator i patienter med stadie II PDAC.

Konklusioner

MAP4K5 udtryk er nedsat eller tabt i størstedelen af ​​PDACs. De stærke associationer mellem lav MAP4K5 udtryk og tab af E-cadherin, reduceret CES2 udtryk og faldt samlet overlevelse kan foreslå en vigtig rolle MAP4K5 i epitel-til-mesenkymale overgang, kemoterapi modstand og tumor progression i bugspytkirtelkræft. Målretning forringet MAP4K5 signalering kan repræsentere en ny terapeutisk strategi for kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Wang OH, Azizian N, Guo M, Capello M, Deng D, Zang F, et al. (2016) Prognostisk og funktionelle betydning af MAP4K5 i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 11 (3): e0152300. doi: 10,1371 /journal.pone.0152300

Redaktør: Murray Korc, Indiana University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juli 28, 2015; Accepteret: 12 mar 2016; Udgivet: Marts 29, 2016

Copyright: © 2016 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Patienten kliniske og overlevelsesdata anvendt i denne undersøgelse er beskyttet oplysninger HIPAA (Health Insurance Mobilitet og Accountability Act af 1996) og de personmotiver Research (45 CFR 46) fra det amerikanske Department of Health Menneskelig service. Denne undersøgelse er underlagt strenge IRB protokol på UT MD Anderson Cancer Center, som forbyder forfatterne fra at gøre de minimale datasæt offentligt tilgængelige. Data er tilgængelige fra University of Texas Data Access /etiske komité for forskere, der opfylder kriterierne for adgang til fortrolige data ([email protected])

Finansiering:. Forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest dødelige sygdomme blandt alle menneskelige maligniteter med kun 6% af. patienter i live 5 år efter diagnosen [1]. Øjeblikket, pancreascancer er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA [2]. På grund af mangel på tidlig påvisning, effektiv behandling og forebyggelse for kræft i bugspytkirtlen, er det blevet forudsagt, at kræft i bugspytkirtlen bliver den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA i 2030 [3].

kræft i bugspytkirtlen er kendt for sine sub-optimale løsninger på traditionelle kemoterapi og strålebehandling. At overvinde resistens har været en af ​​de største hindringer for at forbedre de kliniske resultater for patienter med kræft i bugspytkirtlen [4, 5]. Det er blevet vist, at epitelial-mesenkymale overgang (EMT) bidrager, i det mindste delvist, til den terapeutiske modstand pancreascancer [5, 6]. EMT spiller vigtig rolle under embryogenese, sårheling og tumorprogression og er kendetegnet ved tab af epitel markør E-cadherin og få ekspression af mesenchymale markører, såsom N-cadherin, vimentin og fibronectin etc. Undertrykkelse af epitelial fænotype og forstærkning af mesenchymale fænotype er reguleret af mange molekyler, herunder mester transkriptionsfaktor regulatorer, Snail, Slug, Twist og Zeb-1 [7, 8]. De molekylære mekanismer i EMT regulering i bugspytkirtelkræft er fortsat uklare.

mitogenaktiveret protein (MAP) kinase pathway spiller en vigtig rolle i mutant Kras-drevet bugspytkirtlen tumorigenese og er involveret i reguleringen af ​​EMT gennem transformerende vækst faktor beta (TGFp) [9]. MAP4K5, også kaldet germinale center kinase-relaterede (GCKR) eller kinase homolog til STE20 (KHS1), tilhører det mammale STE20-lignende serin /threonin-kinase-familien. Inden for denne kinase familien, er både HPK1 (også kaldet MAP4K1) og MAP4K5 grupperet i kimcentret kinase-underfamilien og fungere som MAP4Ks idet de aktiverer MAP3Ks, som signalerer gennem den veletablerede MKK4 /MKK7, c-Jun N-terminal kinase (JNK), eller stress-aktiveret proteinkinase (SAPK) kaskader [10, 11]. Nylige undersøgelser viste, at HPK1 kan fungere som en ny tumor suppressor i bugspytkirtelkræft. Den gradvise tab af HPK1 protein medieret af 26S proteasomet er stærkt forbundet med progression fra tidlige pancreas intraepitelialneoplasi til invasiv pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC). Restaurering af HPK1 proteinekspression i PDAC celler enten ved proteasominhibitoren eller knockdown Fbxw8 forårsager cellecyklusstop og hæmmer PDAC cellevækst, som er medieret gennem stabilisering af p21 og p27 [12, 13]. På den anden side er MAP4K4 overudtrykkes i de fleste humane cancerceller herunder bugspytkirtelkræft og fremmer tumorcellemigration og invasion [14-16]. Overekspression af MAP4K4 er forbundet med dårlig prognose hos patienter med stadium II PDAC efter pancreaticoduodenectomy [16]. Disse undersøgelser antyder den funktionelle betydning MAP4K proteiner i bugspytkirtelkræft. Imidlertid har det udtryk og funktioner MAP4K5 i kræft ikke undersøgt. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​MAP4K5 ved immunhistokemi i PDAC og matchede ikke-neoplastiske bugspytkirtel prøver fra 105 patienter, som gennemgik pancreaticoduodenectomy på vores institution. Vi korreleret resultaterne af MAP4K5 udtryk med clinicopathologic funktioner, samlet overlevelse, EMT markører (E-cadherin, vimentin) og carboxylesterase 2 (CES2). Vi valideret vores resultater i en anden uafhængig kohorte af 112 PDAC patienter fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) database og i humane PDAC cellelinjer. Desuden har vi undersøgt virkningerne af MAP4K5 knockdown hjælp siRNA på ekspression af EMT markører i PDAC cellelinjer. Vores resultater kan antyde, at tab af MAP4K5 ekspression spiller en rolle i EMT, kemoterapi modstand og progression af pancreascancer. Således målrette forringet MAP4K5 signalveje kan bidrage til at overvinde lægemiddelresistens af kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Patient befolkning

Vores undersøgelse bestod af 105 patienter (57 mænd og 48 kvinder) med trin II PDAC der undergik bugspytkirtlen resektion med helbredende hensigt på vores institution. Patientens alder varierede fra 24,9 til 84,8 år (median alder: 64,2 år). Pancreaticoduodenectomy, distal pankreatektomi, og total pankreatektomi blev udført i 86, 17 og 2 patienter. Ingen patienter fik præoperativ neoadjuverende kemoterapi og /eller strålebehandling. Patienter, som gennemgik pankreatektomi for carcinomer i duodenum, blev ampulla af Vater, fælles galdegang eller andre typer af pancreas neoplasmer udelukket. Tre patienter med stadie IV sygdom blev også udelukket, fordi antallet af sager for fase IV sygdom var for lille til at være repræsentativt. Skriftlige samtykke fra alle patienter blev opnået. Denne undersøgelse og immunnohistochemistry blev godkendt af Institutional Review Board fra University of Texas MD Anderson Cancer Center.

Tissue microarray byggeri

De bugspytkirtelkræft væv mikroarrays blev konstrueret som tidligere beskrevet ved hjælp af et væv microarrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) [17]. Kort fortalt blev repræsentative områder af tumor og matches ikke neoplastiske pancreasvæv vælges baseret på gennemgang af hematoxylin og eosin (H E-cadherin (Life Technologies, klone HeCd-1, Camarillo, CA, 1: 7000 fortynding); vimentin (DAKO klon V9, Carpeninteria, CA, 1: 900 fortynding) og anti-carboxylesterase 2 (CES2, Sigma-Aldrich, HPA018897, St. Louis, MO, 1: 1000 fortynding). Kort fortalt blev antigen-genvinding udføres ved behandling i en dampkoger i 25 min, efterfulgt af en standard indirekte immunperoxidase procedure (ABC-Elite, Vector Lab, Burlingame, CA). Immunohistokemiske farvede objektglas blev bedømt uafhængigt ved to patologer (M.G. og H.W.). Baseret på farvningsintensitet blev ekspressionen af ​​MAP4K5 kategoriseret som MAP4K5-lav (negativ eller svag cytoplasmatisk farvning i tumorceller) eller MAP4K5-høj (moderat eller stærk cytoplasmatisk farvning i tumorceller), da alle tumorerne var enten diffust positiv eller negativ for MAP4K5. Ekspressionen af ​​E-cadherin blev kategoriseret som E-cadherin-høj (≥50% tumorceller med membranøs farvning) eller E-cadherin-lav ( 50% af tumorcellerne med membranøs farvning) som tidligere beskrevet [6, 20] . Ekspressionen af ​​vimentin blev kategoriseret som positive, hvis cytoplasmatisk farvning for vimentin blev detekteret i enhver kræftceller eller negativ, hvis tumoren viste fuldstændig negativ farvning for vimentin som tidligere rapporteret [20]. Udtrykket af CES2 blev klassificeret som CES2-lav og CES2-høj anvendelse af kriterierne som tidligere beskrevet [21].

The Cancer Genome Atlas (TCGA) RNA-sekventering dataanalyse

niveau 3-RNA sekventering (RNA-seq) data genereret ved hjælp af Illumina HiSeq 2000 RNA Sequencing Version 2 platform af 112 pancreas duktale adenocarcinom patienter blev hentet fra TCGA data portalen (https://tcga-data.nci.nih.gov). De enkelte RNA-seq prøve udtryk filer blev samlet i et datasæt ved hjælp R v3.1.1 og R-studie v0.98.1062. Genekspression niveau blev bestemt ved anvendelse RSEM normaliserede læse tæller.

Cell kultur og immunoblotting

Humane bugspytkirtelkræft cellelinjer MIA Paca-2, Panc-1, ASPC-1, CFPAC-1, Panc -3, L3.6PL, MPanc-96, BxPC-3, SW1990, SU.86.86, Hs 766T, Panc 03,27, HPAF-II og Capan-2 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og blev dyrket enten i Dulbeccos modificerede Eagles medium eller i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum i en fugtet inkubator indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. Den HPDE cellelinje, en udødeliggjort human pancreas ductal cellelinie, var en generøs gave fra Dr. Ming-Sound Tsao [22]. Proteinerne i hele cellelysater blev adskilt ved 10% SDS-PAGE, elektroblottet på PVDF-membraner (Novex, San Diego, CA), blokeret i 5% skummetmælk i 1 x TBS, og probet med de følgende primære antistoffer mod MAP4K5, E -cadherin, og actin. De 293T-celler transficeret med MAP4K5 cDNA konstrukt gemt som en positiv kontrol for MAP4K5 immunblotting. Proteiner blev påvist ved anvendelse af et forøget kemiluminescens (ECL) (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

RNA sekvensanalyse

RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse RNeasy Maxi Kit (Qiagen) fra 11 humane pancreas cancer cellelinjer (BxPC-3, SW1990, SU.86.86, Panc-1, Hs 766T, CFPAC-1, MIA PaCa-2, AsPC-1, Panc 03,27, HPAF-II og Capan-2). RNA-Seq biblioteker blev fremstillet ved anvendelse af standard Illumina reagenser og protokoller. Forbundne-ende sekventering med den læste længde på 50 baser blev udført på Illumina HiSeq 2000 platform efter producentens anvisninger. Casava 1.8.2 blev anvendt til demultiplex og skabe FASTQ filer. De sekventering blev analyseret ved hjælp af software-pakker af Tophat (Trapnell C, et al. Bioinformatik 2009) kortlægning mod hg19 og Manchetknapper (Trapnell C, et al. Nat Biotechnol 2010). Antallet af læser var normaliseret og udtrykt som fragmenter pr kilobase af exon per million fragmenter kortlagt [23].

Knockdown af MAP4K5 udtryk ved hjælp siRNA og Real-time RT-PCR-analyse

Panc- 1 eller AsPC-1-celler blev udpladet på 100 mm skåle og transient transficeret med Dharmacon SMARTpool kontrol og MAP4K5 siRNA i slutkoncentrationer på 25 nmol /l under anvendelse Hiperfect transfektionsreagens (QIAGEN) i overensstemmelse med producentens protokol. Celler blev inkuberet med siRNA kompleks i 48 timer, derefter høstet for real-time revers transkription-PCR (RT-PCR) som tidligere beskrevet [6]. Kort fortalt blev RNA fremstillet under anvendelse TRlzol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kvaliteten af ​​RNA blev vurderet ved anvendelse af spektrofotometri. CDNA’et anvendes til efterfølgende PCR blev fremstillet ved anvendelse iScript (Bio-Rad Laboratories) og SensiMix realtids-PCR-kit blev anvendt til real-time PCR (Bioline, Taunton, MA) for MAP4K5, CDH1 og vimentin. 18S rRNA blev anvendt som en intern reference gen at normalisere input cDNA.

Statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført ved anvendelse IBM SPSS Statistics (version 22, IBM SPSS Inc., Chicago, IL ). Kategoriske data af MAP4K5 udtryk og korrelationer med clinicopathologic funktioner og udtryk for E-cadherin, vimentin og CSE2 blev analyseret ved hjælp af Chi-square og Fishers eksakte test. Samlet overlevelse kurver blev konstrueret ved hjælp af en Kaplan-Meier-metoden. Den statistiske signifikans af forskelle i overlevelse blev analyseret under anvendelse af log-rank test. Univariate og multivariate Cox-regressionsanalyser via en baglæns trinvis procedure blev udført. En P-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Angivelse af MAP4K5 er nedsat hos PDAC prøver

immunhistokemisk farvning for MAP4K5 viste diffus cytoplasmatisk farvning specifikt i. pancreas duktale celler af ikke neoplastiske bugspytkirtel prøver. De acinære celler og øceller havde ingen eller meget lav ekspression af MAP4K5 (Fig 1A og 1B). I PDAC sager, der var MAP4K5 positiv, blev diffus cytoplasmatisk farvning observeret kun carcinomceller. Højt niveau af MAP4K5 ekspression blev detekteret i de normale pankreatiske duktale celler af alle matchede ikke neoplastiske pancreas prøver (100%). I modsætning hertil blandt de 105 PDAC prøver, kun 24 (22,9%) var MAP4K5-høje og 81 (77,1%) tumorer havde ingen eller meget lav udtryk for MAP4K5 (MAP4K5-lav, Fig 1C og 1D). Ekspressionen af ​​MAP4K5 var højere hos normale pancreas duktale celler end PDAC (tabel 1, P = 0,0001). Disse data antyder, at tab af MAP4K5 ekspression kan anvendes som en diagnostisk markør for PDAC.

Repræsentative mikrografer viser ekspressionen af ​​MAP4K5 i normalt pancreasvæv (A) og kronisk pancreatitis (B). De godartede pancreas ductusceller celler i normal bugspytkirtlen og kronisk pancreatitis viser stærk cytoplasmatisk farvning for MAP4K5. De tilstødende pancreatiske acinære celler og pancreatiske øceller er enten negativt eller har meget lav ekspression af MAP4K5. C D, Repræsentative mikrografer viser tabet af MAP4K5 udtryk i to forskellige pancreas duktale adenocarcinom prøver. Stærk cytoplasmatisk farvning for MAP4K5 i benigne pancreas ductusceller celler i øverste venstre hjørne i D fungerede som intern positiv kontrol. Originale forstørrelser:. 200X

Ekspressionsniveauerne for MAP4K5 korrelerer med udtryk for E-cadherin i humane PDAC prøver i to uafhængige kohorter af patienter

Repræsentative mikrografier viser sammenhængen mellem MAP4K5 ekspression og ekspression af E-cadherin i PDAC prøver er vist i fig 2A-2D. Vi fandt, at tabet af MAP4K5 ekspression (MAP4K5-lav) korreleret med tab af E-cadherin ekspression i PDAC i vores patientpopulation. Blandt de 24 tilfælde, der var MAP4K5-høj, kun 1 (4,2%) havde en lav ekspression af E-cadherin. I modsætning hertil 31 af 81 (38,3%) tumorer, der var MAP4K5-low havde lav ekspression af E-cadherin (P = 0,001, Tabel 2 og Fig 2A-2D). Vi har også observeret en stigning i vimentin udtryk i MAP4K5-lav tumorer i vores patientpopulation. Men forskellen i vimentin udtryk mellem MAP4K5-lav og MAP4K5-high gruppe var ikke statistisk signifikant (P = 0,30)

A B, Repræsentative mikrografer viser stærk cytoplasmatisk farvning for MAP4K5 og stærk membranøs farvning for E-cadherin i en pancreas duktalt adenocarcinom. C D, Repræsentative mikrografer viser tab af MAP4K5 udtryk og tabet af E-cadherin udtryk i en pancreas duktalt adenocarcinom. Originale forstørrelser:. 200X

For at validere sammenhængen mellem ekspressionen af ​​MAP4K5 og E-Cadherin identificeret i vores patientgruppe, vi undersøgte sammenhængen mellem ekspressionsniveauerne af MAP4K5 mRNA og CDH1 mRNA i 112 PDAC patienter ved hjælp af RNA sekventering data downloadet fra TCGA data portalen. Vi fandt, at mRNA-niveauer af MAP4K5 direkte korreleret med ekspressionsniveauerne af CDH1 mRNA (R = 0,2490, p = 0,008, Fig 3) i TCGA patientpopulation. MRNA niveau af CDH1 blev omvendt korreleret med ekspressionen af ​​vimentin mRNA i denne patientgruppe (R = -0,3496, p = 0,0002, data ikke vist).

Ekspressionsniveauerne for MAP4K5 korrelerer med ekspression af E-cadherin i humane PDAC cellelinier

i overensstemmelse med vores immunhistokemiske farvningsresultater, højt niveau af MAP4K5 proteinekspression blev detekteret i Æske med HDPE-celler, udødeliggjorte normale pancreas duktale celler, men kun i 2 af 7 (28,6% ) humane pancreas cancer cellelinier ved immunblotting analyse (figur 4A). For yderligere at bekræfte korrelationen mellem ekspression af MAP4K5 og E-cadherin observeret i PDAC patienter målte vi ekspressionsniveauerne af MAP4K5 og E-cadherin i syv PDAC cellelinier ved immunoblotting og fundet en tilsvarende sammenhæng mellem tab af MAP4A5 og E- cadherin proteinekspression i disse PDAC cellelinier. De Æske med HDPE, CFPAC1 og L3.6PL celler, der udtrykte høje niveauer af MAP4K5 viste også høje niveauer af E-cadherin ekspression. I forhold til disse celler, havde alle andre bugspytkirtelkræft cellelinjer, der havde lav MAP4K5 udtryk nedsat ekspression af E-cadherin (fig 4A). Derudover udførte vi RNA-sekventering analyse af elleve PDAC cellelinier og fandt en signifikant direkte sammenhæng mellem ekspressionsniveauerne af MAP4K5 mRNA og CDH1 mRNA (R = 0,7248, p = 0,012, Fig 4B), som svarer til resultaterne fra TCGA patientpopulation. Ekspressionen af ​​CDH1 mRNA blev indirekte korreleret med mRNA-niveauer af vimentin i disse cellelinier (R = -0,6087, p = 0,047, data ikke vist).

A. Immunoblotting for MAP4K5 og E-cadherinekspression i Æske med HDPE celler, udødeliggjort humane pancreas ductusceller celler og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. De 293T-celler transficeret med MAP4K5 cDNA konstrukt gemt som en positiv kontrol for immunblotting. B. Pearsons korrelationsanalyse mellem MAP4K5 mRNA og CDH1 mRNA ekspression ved RNA-sekventering analyse i 11 bugspytkirtelkræft cellelinjer.

Knockdown MAP4K5 udtryk fører til nedsat E-cadherin i PDAC cellelinjer

for at vurdere virkningerne af MAP4K5 på CDH1 genekspression, vi forbigående transficeret Panc-1 og AsPC-1 celler med siControl eller siMAP4K5 og målte mRNA niveauerne af CDH1 og vimentin ved kvantitativ RT-PCR. Vi fandt, at silencing af MAP4K5 førte til et signifikant fald i ekspressionsniveauerne af CDH1 mRNA i begge cellelinier, men ikke mRNA-niveauerne af vimentin (Fig 5A og 5B). Vore data antyder, at MAP4K5 kan spille en rolle i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​CDH1 genet og EMT fænotype i PDAC.

Knockdown MAP4K5 ekspression fører til nedsat ekspression af E-cadherin-mRNA, men ingen signifikante ændringer i ekspressionen af ​​vimentin mRNA i Panc-1 (A) og AsPC-1-celler (B). * P. 0,01

Tab af MAP4K5 udtryk korrelerer med CES2 udtryk i humane PDAC prøver

På baggrund af de seneste rapport, at CES2, den mest effektive carboxyl esterase i aktivering af prodrug irinotecan til den aktive metabolit SN-38, forudsagde tumor respons på irinotecan og neoadjuverende FOLFIRINOX hos patienter med PDAC [21] undersøgte vi sammenhængen mellem tab af MAP4K5 udtryk og CES2 udtryk i vores patientpopulation. Vi fandt, at tabet af MAP4K5 udtryk korreleret signifikant med lav udtryk CES2. Lav CES2 ekspression var til stede i 48,7% MAP4K5-lav tumorer sammenlignet med 13,0% i MAP4K5-høj tumorer (p = 0,002, tabel 2). Ingen signifikant sammenhæng mellem ekspression af MAP4K5 og CES2 mRNA blev observeret i TCGA patientpopulation.

Lav MAP4K5 udtryk er forbundet med kortere samlet overlevelse

Den mediane opfølgningstid efter diagnosen PDAC var 21,8 måneder i vores patientpopulation (interval: 4,2 til 236,3 måneder). Den mediane overlevelse var 21,2 ± 2,6 måneder i MAP4K5-lav gruppe sammenlignet med 40,6 ± 6,2 måneder i patienter, hvis tumor var MAP4K5-høj (P = 0,02, log-rank test, figur 6). Tab af MAP4K5 udtryk i PDAC korrelerede signifikant med reduceret samlede overlevelse. Men vi ikke observere signifikant sammenhæng mellem ekspression af E-cadherin, vimentin eller CES2 og overlevelse (P 0,05, data ikke vist). I multivariat analyse, tab af MAP4K5 udtryk var en uafhængig prognostisk faktor for nedsat samlet overlevelse med en hazard ratio på 2,05 (95% konfidensinterval: 1,17-3,56, P = 0,012). Desuden lymfeknudemetastase og positiv resektionsranden var også uafhængige prædiktorer for nedsat overlevelse, P = 0,013 og P = 0,012 henholdsvis i multivariat analyse (tabel 3). Ingen signifikant korrelation mellem MAP4K5 ekspression og andre clinicopathologic funktioner, herunder køn, alder, tumorstørrelse, differentiering, lymfeknude og status resektionsranden, blev observeret i vores patientpopulation (P 0,05, tabel 2) Salg

Patienter, hvis tumorer havde ingen eller lav MAP4K5 udtryk (MAP4K5-lav) havde kortere samlet overlevelse end patienter, hvis tumorer var MAP4K5-høj.

diskussion

MAP4K5 spiller en vigtig rolle i regulering af en række cellulære responser af hæmatopoietiske celler til miljømæssige stimuli, såsom TNFa gennem stress-aktiverede proteinkinaser (SAPKs) og JNK pathways [24-26]. MAP4K5 har også vist sig at være involveret i både den kanoniske og ikke-kanoniske Wnt signalering i B-lymfocytter [27]. Men dens funktioner i humane maligniteter ikke undersøgt. I denne undersøgelse viste vi, at MAP4K5 ekspression blev nedsat eller tabt i 77,1% af PDAC. I modsætning hertil blev MAP4K5 udtrykt på højt niveau i de normale pancreas ductusceller celler i 100% af de matchede ikke-neoplastiske bugspytkirtel prøver. Tilsvarende tab af MAP4K5 proteinekspression blev observeret i størstedelen af ​​humane bugspytkirtelkræft cellelinjer sammenlignet med Æske med HDPE celler, udødeliggjort normale pancreas duktale celler. Mere vigtigt, vi viste, at tabet af MAP4K5 proteinekspression var forbundet med reduceret samlet overlevelse og var en uafhængig prognosticator for samlet overlevelse hos patienter, som gennemgik resektion for PDAC af multivariat analyse. foreslog vores data, for første gang, kan dette tab af MAP4K5 ekspression spiller en rolle i progressionen af ​​pancreascancer. Vores resultater stemte overens med nylige undersøgelser, der viste, at HPK1, et andet medlem af GCK underfamilien af ​​det mammale STE20-lignende serin /threonin-kinase-familien, fungerer som en tumorsuppressor både i bugspytkirtelkræft og lungecancer [12, 13, 28] . På den anden side har MAP4K4 vist sig at blive overudtrykt i bugspytkirtelkræft og andre typer af maligniteter. Overekspression af MAP4K4 er en dårlig prognostisk faktor for både samlet og sygdomsfri overlevelse hos patienter med kræft i bugspytkirtlen [16]. Disse data antyder en divergerende rolle MAP4K familie i cancer. Tidligere undersøgelser har vist, at målrettet nedbrydning af HPK1 i bugspytkirtelkræft ved CUL7 /Fbxw8 ubiquitinligase involverer HPK1 autophosphorylering. Aktivering og autophosphorylering af HPK1 danner en negativ-feedback-loop til at begrænse HPK1 aktivitet, som regulerer cellecyklusprogression og celleproliferation i pancreascancer [12, 13]. Det er muligt, at 26S proteasom pathway kan spille en rolle i tabet af MAP4K5 ekspression i humane maligniteter. Men de molekylære mekanismer, der fører til tab af MAP4K5 ekspression i bugspytkirtelkræft brug for yderligere undersøgelse.

WNT /β-catenin signalvejen spiller en central rolle i at opretholde de epiteliale cellefænotype og celle-celle vejkryds. Dysregulering af denne vej vil føre til EMT, som er blevet vist at være involveret i udviklingen, progression, og kemoterapi modstand pancreascancer [5, 6]. I lyset af tidligere resultater, som MAP4K5 er involveret i reguleringen af ​​både den kanoniske og ikke-kanoniske Wnt signalering [27] undersøgte vi de funktioner og sammenhænge mellem MAP4K5 og EMT i bugspytkirtelkræft. Vi fandt en statistisk signifikant sammenhæng mellem tabet af MAP4K5 udtryk og tabet af E-cadherin udtryk, en signatur immunfænotypisk markør for EMT, i to store uafhængige patientkohorter, kohorten fra vores institution og TCGA kohorte. Derudover observerede vi den samme korrelation mellem tab af MAP4K5 ekspression og tabet af E-cadherin ekspression både proteinet og mRNA-niveauer i flere pancreas cancercellelinier. Desuden knockdown MAP4K5 i bugspytkirtelkræft cellelinjer medførte nedsat CDH1 mRNA-ekspression. MAP4K5 kan derfor spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​E-cadherin og EMT i bugspytkirtelkræft. Vores data giver en sammenhæng mellem tabet af MAP4K5 og EMT i bugspytkirtelkræft og kan antyde, at MAP4K5 signalering udgør en potentiel terapeutisk target for kræft i bugspytkirtlen.

De regimer af FOLFIRINOX og Gemcitabin /Nab-paclitaxel har vist sig at har forbedret virkning ved behandling af patienter med metastatisk pancreascancer sammenlignet med gemcitabin alene [29, 30]. Ved hjælp af en omfattende proteomisk tilgang, Capello

et al

. nylig identificeret CES2 som en potentiel prædiktiv markør for kræft i bugspytkirtlen patienter, der fik neoadjuverende FOLFIRINOX [21]. De viste, at høje niveauer af CES2 ekspression formindske halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) af irinotecan og øge effektiviteten af ​​FOLFIRINOX regime [21]. I denne undersøgelse fandt vi, at tab af MAP4K5 udtryk er signifikant associeret med lave niveauer af CES2 udtryk i vores patientpopulation. Selvom vi ikke fandt en signifikant sammenhæng mellem MAP4K5 mRNA og CSE2 mRNA i TCGA population (data ikke vist), vores resultater tyder på, at tabet af MAP4K5 kan være involveret i kemoterapi modstand af kræft i bugspytkirtlen, især til regimer, som indeholder irinotecan i rygraden.

sammenfattende er MAP4K5 protein udtrykt i høje niveauer specifikt i de Langerhanske duktale celler med normal pancreas. Tab af MAP4K5 udtryk er til stede i størstedelen af ​​pancreas ductale adenocarcinomer og er en uafhængig dårlig prognostisk faktor for patienter med stadie II PDAC. De stærke associationer mellem tabet af MAP4K5 udtryk og tab af E-cadherin eller nedsat CES2 udtryk kan foreslå en vigtig rolle MAP4K5 i epitel-til-mesenkymale overgang, kemoterapi modstand og tumor progression i bugspytkirtelkræft. Således kan målrette forringet MAP4K5 signalering repræsenterer en ny terapeutisk strategi for kræft i bugspytkirtlen behandling.

Tak

Dette arbejde blev støttet af Khalifa bin Zayed Al Nahyan Foundation Institute for kræft i bugspytkirtlen Research ved University of Texas MD Anderson Cancer center. Forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde.