PLoS ONE: Kræft i æggestokkene Gene Therapy Brug HPV-16 pseudovirion Regnskabsmæssig HSV-tk Gene

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er den hyppigste årsag til død af alle gynækologiske kræftformer og konventionelle behandlinger såsom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling normalt undlader at kontrollere fremskredne stadier af sygdommen. Således er der et presserende behov for alternative og innovative behandlingsmuligheder. Vi ræsonnere, at kræft genterapi anvendelse af en vektor i stand til specifikt at levere et enzym-kodende gen til ovariecancerceller vil tillade cancercellen at metabolisere en harmløs prodrug til et potent cytotoksin, som vil føre til terapeutiske virkninger. I den aktuelle undersøgelse, vi undersøge brugen af ​​et humant papillomavirus (HPV) pseudovirion at levere en herpes simplex virus thymidinkinase (HSV-tk) genet til ovarietumorceller. Vi fandt, at HPV-16 pseudovirion kunne fortrinsvis inficere murine og humane ovarie tumorceller, når de indgives intraperitonealt. Endvidere intraperitoneal injektion af HPV-16 pseudovirioner bærer HSV-tk-genet efterfulgt af behandling med ganciclovir ført til betydelige terapeutiske antitumorvirkninger i murine ovariecancer-bærende mus. Vore data antyder, at HPV pseudovirion kan tjene som en potentiel leveringsvehikel for ovariecancer genterapi

Henvisning:. Hung C-F, Chiang AJ, Tsai H-H, Pomper MG, Kang TH, Roden RR, et al. (2012) Kræft i æggestokkene Gene Therapy Brug HPV-16 pseudovirion Regnskabsmæssig HSV-tk Gene. PLoS ONE 7 (7): e40983. doi: 10,1371 /journal.pone.0040983

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA

Modtaget: 15. marts 2012; Accepteret: 15 juni 2012; Udgivet: 17 Juli 2012

Copyright: © 2012 Hung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute Specialized programmer for forskning Excellence (https://trp.cancer.gov/) i livmoderhalskræft P50 CA098252, CA118790 (Roden), og CA122581 (Roden). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den hyppigste årsag til død af alle gynækologiske kræftformer og den sjette mest almindelige malignitet for kvinder i USA [1], [2]. Skønt betydelige fremskridt har fundet sted i både kirurgiske og kemoterapeutiske teknikker, de overordnede 5-års overlevelsesraten for alle stadier af kræft i æggestokkene forblive 50% [2], [3]. Aktuelle behandlinger (operation, kemoterapi og strålebehandling) normalt undlader at kontrollere fremskredne stadier af sygdommen. Derfor kan alternative terapeutiske metoder tjene som vigtige metoder til at kontrollere disse fremskredent stadium tumorer i æggestokkene.

En mulig tilgang er brugen af ​​selvmord genterapi (SGT). Med SGT, er genet for en fremmed enzym (dvs. et fra en virus, bakterie eller gær) specifikt leveret til cancerceller. Genadministration efterfølges af systemisk indgivelse af en ikke-toksisk prodrug. De inficerede cancerceller er i stand til at udtrykke det fremmede enzym til at konvertere prodruget til et aktivt cytotoksin, som er i stand til at dræbe de inficerede celler. En fordel SGT har i forhold til konventionelle genterapier er dens evne til at dræbe naboceller gennem tilskuer-virkning. Det aktive lægemiddel kan undslippe de transducerede celler og diffunderer ind tilstødende ikke-inficerede celler, i sidste ende fører til deres død så godt. De døende celler er også i stand til at inducere naturlig killer (NK) celler og T-celler til at inducere en fjern tilskuer-virkning. Den håb for denne fremgangsmåde er at have stor specificitet for tumorceller, især cancer stamceller. Denne fremgangsmåde bør også reducere de toksiske bivirkninger associeret med konventionelle cancerterapier grund af den øgede specificitet både levering og aktivering af cytotoksin [4].

Den mest studerede selvmordsgen /prodrug system er kombinationen af herpes simplex virus thymidinkinase (HSV-tk) med ganciclovir (GCV) [5]. HSV-tk, som har høj affinitet for ganciclovir, katalyserer det første phosphorylering af GCV, der så kan være di- og tri-phosphoryleret af cellulære kinaser. Triphosphoryleret GCV kan inkorporeres i replikerende DNA, hvilket fører til polymerase inhibering og til sidst apoptose [4] – [6]. Dette system har vist en vis succes i klinikken, men dens anvendelighed er begrænset af sin afhængighed af celle-til-celle kontakt og gap junctions for tilskuer effekt [4].

5-8 uger gamle C57BL /6 mus blev udfordret med MOSEC tumorceller (1 x 10

6 celler /mus). En uge senere blev tumorbærende mus injiceret intraperitonealt med eller uden HPV-16 /luc pseudovirioner (20 ug HPV-16 L1-protein /mus, svarende til 120 ng DNA /mus). Naive mus inficeret med eller uden HPV-16 /luc pseudovirioner tjente som kontrol. Mus blev afbildet af ikke-invasiv luminescens billeddannelse 1 dag efter infektion. De viste data er repræsentative for 2 eksperimenter udført.

I denne undersøgelse anvender vi replikationsdefekte humant papillomvirus (HPV) pseudovirioner at levere HSV-tk-genet til ovarietumorceller. Nylige undersøgelser viser DNA-plasmider kan pakkes ind i papillomavirus L1 og L2 capsidproteiner at generere den “pseudovirion ‘at effektiv kan levere DNA’et i multiple cellelinier [7] – [9]. Indkapslingen beskytter også DNA fra nucleaser og giver en målrettet levering med stor stabilitet. Mange af de sikkerhedsproblemer forbundet med anvendelse af levende virusvektorer lindres som HPV pseudovirioner indeholder en DNA-konstruktion adskiller sig fra den naturlige HPV virale genom. Der er også over 100 typer papillomavirus pseudovirioner, hvilket tillader gentagen styrke ved hjælp af forskellige typer, da de neutraliserende antistoffer mod én type er normalt ikke krydsreaktive med andre typer.

Her udforske vi brug af HPV pseudovirioner til levere markørgener og suicidal gener for både murine og humane ovarietumorceller. Vi fandt, at intraperitoneal injektion af HPV-16 pseudovirioner førte til præferentiel infektion af ektopiske og spontant forekommende murine ovariecancer hos mus. Differentieret infektion forekom også i humane æggestokkene tumorxenoplantater af tumor-bærende mus. Intraperitoneal injektion af HPV-16 pseudovirioner bærer HSV-tk-genet efterfulgt af indgivelse af ganciclovir medførte betydelige terapeutiske antitumorvirkninger i murine-ovariecancer-bærende mus. Vores data viser proof-of-principle at HPV pseudovirioner kan være nyttige vektorer til afgivelse af terapeutiske gener til ovariecancer.

5-8 uger gamle nøgne mus blev injiceret intraperitonealt med ES2 humane ovarie tumorceller (1 x 10

6 celler /mus). En uge senere blev tumorbærende mus intraperitonealt injiceret med vildtype (wt) HPV-16 /Luc PSV eller mutant L2 (mtL2) HPV-16L1mtL2-Luc pseudovirioner (20 ug HPV-16 L1-protein /mus, svarende til 120 ng DNA /mus). Naive mus inficeret med wt eller MT HPV-16 /luc pseudovirioner tjente som kontroller. Mus blev afbildet af ikke-invasiv luminescens billeddannelse 1 dag efter infektion. De viste data er repræsentative for 2 eksperimenter udført.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i den vejledning for den Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Alle procedurer blev udført med forudgående godkendelse fra Johns Hopkins Animal Care og brug Udvalg (protokol MO08M446).

Mus

C57BL /6 og nøgen (BALB /c nu /nu) mus var erhvervet fra National Cancer Institute.

MISIIR-TAG

transgene mus [10] blev venligst stillet til rådighed af Dr. Denise Connolly på Fox Chase Cancer Center. Alle dyrene blev holdt under specifikke patogenfrie betingelser, og alle procedurer blev udført i overensstemmelse med godkendte protokoller og i overensstemmelse med anbefalinger til korrekt brug og pleje af forsøgsdyr.

C57BL /6 mus og

MISIIR -tag

transgene mus blev injiceret med 20 ug af HPV-16 /luc PSV ved intraperitoneal injektion 10 uger efter fødslen. Luminescens billeder blev taget 1 dag efter HPV-16 /luv PSV injektion.

Top,

Repræsentative luminescens billeder af PSV-inficerede C57BL /6 mus eller

MISIIR-TAG

transgene mus (venstre) og deres høstede organer (til højre). Bemærk: Hvid pil angiver kun ovariecancer fra MISRII transgene mus kan blive inficeret af HPV-16 /luc PSV.

Bund,

Repræsentative søjlediagrammer af luminescens billedbehandling i MISIIR-TAG transgene mus eller C57BL /6 mus. Data er repræsentative for 2 eksperimenter udført.

cellelinier

293TT celler blev venligst stillet til rådighed af J Schiller (National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH)) [11 ]. Den MOSEC cellelinien (en mus ovariecancer cellelinie) blev fremstillet som tidligere [12] beskrevne. Den ES2 cellelinien (en human ovariecancer-cellelinje) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. MOSEC /luciferase (MOSEC-luc) celler blev dannet som beskrevet tidligere [13].

MOSEC-Luc celler blev inficeret HPV16-GFP PSV eller HPV16 /HSV-tk PSV i en koncentration på 1 ug L1-protein /ml i 48 timer. De inficerede celler blev podet i plader med 96 brønde og derefter behandlet med 0 ug /ml, 0,1 pg /ml, 1 ug /ml eller 10 ug /ml Ganciclovir i 72 timer. Luciferaseekspression blev undersøgt af IVIS 200-systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). De viste data er repræsentative for 2 eksperimenter udført.

plasmider

De plasmider kodende HPV16 L1 L2 (pShell16) blev venligst stillet til rådighed af Dr. J Schiller (NCI). Punktmutationen HPV16L1 mtL2 konstrukt er beskrevet i vores tidligere undersøgelse [14]. Genereringen af ​​luciferase-udtrykkende plasmid (pcDNA3-luciferase) og GFP-udtrykkende plasmid (pcDNA3-GFP) er tidligere blevet beskrevet [15], [16]. Den pORF-HSVtk plasmid blev købt fra InvivoGen.

HPV pseudovirion Produktion

HPV16-GFP, HPV16-Luc (luciferase), HPV16-tk (HSVtk herpes simplex virus-thymidinkinase) pseudovirioner var efter metoden som tidligere beskrevet [11]. Kort fortalt blev 293TT celler cotransficeret med HPV ekspressionsplasmider pShell16 og plasmiderne af valg (såsom GFP, luciferase eller HSVtk) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter 48 timer blev cellerne høstet og vasket med Dulbeccos phosphatpufrede saltvand (PBS) (Invitrogen) suppleret med 9,5 mM MgCl

2 og antibiotikum-antimykotikum-blanding (DPBS-Mg) (Invitrogen). Cellerne blev suspenderet i DPBS-Mg suppleret med 0,5% Brij58, 0,2% Benzonase (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA) og 0,2% Plasmid Safe (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) ved 100 × 10

6 celler /ml og inkuberet ved 37 C i 24 timer for capsid modning. Efter modning blev cellelysatet afkølet på is i 10 min. Saltkoncentrationen af ​​cellelysatet blev justeret til 850 mM og inkuberet på is i 10 min. Lysatet blev derefter klaret ved centrifugering, og supernatanten blev lagdelt på en Optiprep gradient. Gradienten blev centrifugeret i 4,5 timer ved 16 C ved 40 000 rpm i en SW40 rotor (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Renheden af ​​HPV pseudovirioner blev evalueret ved at køre fraktionerne på 4-15% gradient natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese. Det indkapslede DNA-plasmid blev kvantificeret ved ekstraktion indkapslet DNA fra Optiprep fraktioner efterfulgt af kvantitative real-time PCR sammenligninger med serielle fortyndinger af nøgent DNA. Koncentrationerne af plasmider (GFP, luciferase, eller HSVtk) i pseudovirioner blev bestemt til at være ca. 6,2 ng DNA pr 1 ug L1-protein.

In vitro

Infektion af tumorceller ved HPV16 pseudovirioner

MOSEC eller ES2 celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5000 celler /brønd og dyrket natten over. Cellerne blev inficeret med HPV-16 /Luc PSV (1 ug L1-protein /ml) i 72 timer. Luciferin (15 ug /ml) blev tilsat og inkuberet i 10 min. En integrationstid på 10 sek blev anvendt til erhvervelse luminescens billede ved IVIS 200 systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA).

Karakterisering af Tumor Infektion med HPV16 pseudovirioner i mus

C57BL /6-mus (5 pr gruppe) blev injiceret intraperitonealt med 1 x 10

6 MOSEC celler /mus. En uge senere blev tumorbærende mus injiceret intraperitonealt med HPV-16 /Luc PSV i en dosis på 20 ug HPV-16 L1-protein /mus (svarende til 120 ng DNA /mus). Luminescens billederne blev optaget dagen efter HPV-16 /Luc PSV injektion. En integrationstid på 2 min blev anvendt til erhvervelse luminescens billede.

I karakteriseringen af ​​infektionen af ​​humane ovariecancerceller af HPV-16 /Luc PSV, nøgne mus blev udfordret med ES2 humane ovarie tumorceller ved en dosis på 1 × 10

6 celler /mus. En uge senere blev tumorbærende mus intraperitonealt injiceret med vildtype (wt) HPV-16 /Luc PSV eller mutant (mt) HPV-16L1mtL2-Luc PSV i en dosis på 20 ug HPV-16 L1-protein /mus (ækvivalent til 120 ng DNA /mus). Naive mus uden tumorer inficeret med wt eller mt HPV-16 /Luc PSV fungerede som kontroller. Luminescens billeder blev taget dagen efter den /Luc PSV injektion HPV-16. Musene blev injiceret med 0,2 ml 15 mg /ml beetle luciferin (kaliumsalt; Promega). Efter 10 minutter blev musene filmede med IVIS 200 systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). En integration tid på 30 sek blev anvendt til erhvervelse luminescens billede.

In vitro

Cytotoksicitet medieret af HPV16-TK pseudovirioner og ganciclovir

MOSEC-Luc celler blev inficeret HPV16- GFP PSV eller HPV16-TK PSV (1 ug L1-protein /ml) i 48 timer. De inficerede celler blev podet i plader med 96 brønde. De inficerede celler blev behandlet med 0 ug /ml, 0,1 ug /ml, 1 ug /ml eller 10 ug /ml ganciclovir i 72 timer og luciferase-ekspression blev undersøgt ved IVIS 200-system (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA ).

In vivo

Cytotoksicitet medieret af HPV16-TK pseudovirioner og ganciclovir

mus blev injiceret intraperitonealt med 1 × 10

6 MOSEC-Luc celler /mus på dag 1. Luciferaseaktivitet blev undersøgt på dag 2 som en indikation af antallet af tumorer i mus. Musene blev injiceret med 0,2 ml 15 mg /ml beetle luciferin (kaliumsalt; Promega). Efter ti minutter blev musene filmede med IVIS 200 systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). En integrationstid på 2 min blev anvendt til erhvervelse luminescens image. Mus blev injiceret med HPV16-GFP PSV (20 ug L1-protein) eller HPV16-TK PSV (20 ug L1-protein) på dag 3. Mus blev behandlet dagligt med ganciclovir (50 mg /kg) eller PBS fra dag 5 til dag 18. Mus blev afbildet igen ved non-invasiv luminescens billedbehandling på dag 20.

Resultater

intraperitoneal injektion af HPV-16 pseudovirioner fører til Differentieret Infektion af murine ovariecancerceller i Tumor-bærende mus

Vi undersøgte først, hvis HPV-16 pseudovirion bærer luciferasegenet (HPV-16 /Luc PSV) var i stand til at inficere murine ovariecancer cellelinje, MOSEC,

in vitro

. Som vist i figur S1, HPV-16 /Luc PSV kunne inficere MOSEC tumorceller

in vitro

. For at demonstrere, om HPV-16 /Luc PSV også kan inficere murine ovariecancer cellelinje i tumorbærende mus, vi først intraperitonealt injicerede mus med MOSEC tumorceller. De tumorbærende mus blev intraperitonealt injiceret med HPV-16 /Luc PSV en uge senere. Som vist i figur 1, mens mus uden tumorer ikke viste nogen luciferase aktivitet, tumorbærende mus injiceret intraperitonealt med HPV-16 /Luc PSV viste signifikant luciferaseaktivitet. Disse data tyder HPV pseudovirion inficerer fortrinsvis tumorcellerne i tumor-bærende mus.

intraperitoneal injektion af HPV-16 pseudovirioner Fører til Differentieret infektion af humane ovariecancerceller i Tumor-bærende nøgne mus

Vi undersøgte endvidere, om HPV-16 /Luc PSV kunne inficere den humane ovariecancer-cellelinje ES2. Som vist i figur S2, ES2 celler inficeret med HPV-16 /Luc PSV demonstreret luciferaseaktivitet, hvilket antyder, at HPV-16 /Luc PSV var i stand til at inficere humane ovariecancerceller

in vitro

. Vi kendetegnet også

in vivo

infektivitet af HPV-16 /luc PSV i nøgne mus, der bærer ES2 humane ovarietumorer at afgøre, om smitsomheden af ​​HPV pseudovirioner er afgørende for effektiv gen-levering til ovarietumorceller ved HPV pseudovirioner. Det er nu klart, at HPV L2 minor capsid protein er væsentlig for effektiv infektion af celler ved HPV pseudovirioner [14], [17]. Således har vi ansat HPV-16 /Luc PSV med en enkelt aminosyre mutation i HPV L2 (HPV16L1mtL2-luc PSV), der afskaffer smitsomhed pseudovirioner [14]. Som vist i figur 2, kun nøgne mus med humane ovarietumorer viste signifikant luminescens sammenlignet med de ikke-tumorbærende nøgne mus. Desuden er det kun tumorbærende mus inficeret med HPV-16 /luc PSV men ikke mutant HPV-16 /L1mtL2- luc PSV viste signifikant luminescens (fig. 2). Således er vores data viser, at HPV-16 pseudovirioner også fortrinsvis kan inficere humane ovarie tumorceller

in vivo

. Desuden vores data viser, at intakt HPV L2 er afgørende for effektiv levering af indkapslet gener til æggestokkene tumorceller ved HPV pseudovirioner.

HPV-16 /luc PSV inficerer fortrinsvis æggestokkræft i

MISIIR-Tag

transgene mus

Vi undersøgte yderligere den foretrukne infektion af æggestokkene tumorceller ved HPV pseudovirioner i

MISIIR-Tag

transgene mus, en spontant forekommende murine æggestokkene tumor model. Dette transgene mus, som udtrykker det transformerende region SV40 under kontrol af den Mullerian inhiberende stof type II receptor genpromotor, er blevet vist at udvikle bilaterale ovarietumorer. Således spontane ovariecancer model i

MISIIR-Tag

transgene mus mere ligner human ovariecancer end en transplantation model som MOSEC tumor model.

MISIIR-Tag

transgene mus er blevet rapporteret spontant udvikle ovariecancer inden 6-13 uger efter fødslen [10]. I vores laboratorium, alle af

MISIIR-Tag

transgene mus (fra en ny linje erhvervet fra Dr. Connolly) udviklede tumorer i æggestokkene inden for 4 måneder efter fødslen. Vi injicerede HPV-16 /luc PSV 10 uger efter fødslen, og vi fandt, at HPV-16 /Luc PSV kunne også fortrinsvis inficere spontant forekommende kræft i æggestokkene i

MISIIR-Tag

transgene mus (fig. 3). Desuden observerede vi, at de vitale organer, herunder lunger, hjerte, mave, milt og nyre ikke blev smittet. Desuden blev ingen luciferaseaktivitet observeret i de normale ovarierne fra C57BL /6 mus injiceret med HPV-16 /luc PSV. Således er vores data viser, at HPV-16 pseudovirioner selektivt kan inficere ovarietumorceller i en spontant forekommende murine ovarian tumor model.

Infektion af HPV-16 pseudovirioner Carrying HSV-tk-genet efterfulgt af behandling med Ganciclovir fører til

in vitro

Cytotoksicitet af inficerede celler

fortrinsret infektion af HPV-16 pseudovirioner i æggestokkene tumorceller giver mulighed for muligheden for at specifikt bære terapeutisk DNA til æggestokkene tumorceller til kontrol af ovarietumorer. Fordi den initiale administration af HPV pseudovirioner ikke kan være i stand til at inficere alle de ovarietumorceller, er det vigtigt at overveje en strategi, der tillader ovarietumorceller ikke direkte inficeret til også bliver modtagelige. Derfor valgte vi HSV-tk /ganciclovir-system, da det er den mest undersøgte selvmord genterapi-system og over to årtiers forsøg på at bruge systemet som en anticancer terapi har vist varierende succes. For at demonstrere, om HPV-16 /HSV-tk PSV kan inficere ovarietumorceller og gøre dem modtagelige for drab ved behandling med ganciclovir, vi inficerede MOSEC-Luc celler med HPV16-GFP PSV eller HPV16 /HSV-tk PSV i 48 timer. De inficerede celler blev efterfølgende behandlet med forskellige koncentrationer af ganciclovir og luciferase ekspression af de inficerede celler blev målt under anvendelse IVIS 200 systemet. Som vist i figur 4, MOSEC-Luc tumorceller inficeret med HPV-16 /HSV-tk PSV efterfulgt af behandling med ganciclovir førte til celledød af de inficerede celler

in vitro.

Dette blev ikke observeret i celler inficeret med HPV-16 /GFP. Vi bemærkede også, at højere koncentrationer af ganciclovir ført til mere celledød. Lignende effekter blev set, når lignende analyser blev udført med den humane ovariecancer-cellelinje ES2 (se figur S3).

intraperitoneal injektion af HPV-16 pseudovirioner Carrying HSV-tk Gene efterfulgt af behandling med Ganciclovir medfører betydelige antitumorvirkningerne i murine kræft i æggestokkene-bærende mus

Vi yderligere beslutsom hvis MOSEC tumor-bærende mus inficeret med HPV-16 /HSV-tk PSV efterfulgt af behandling med ganciclovir kunne udvise terapeutiske antitumorvirkninger. Musene blev injiceret med MOSEC-Luc tumorceller og derefter behandlet med HPV-16 /HSV-tk PSV eller HPV-16 /GFP PSV hjælp regime som beskrevet i figur 5. Musene blev efterfølgende behandlet med ganciclovir og tumorvækst blev overvåget ved anvendelse en luminescens-billeddannelsessystem. Som vist i figur 5, tumorbærende mus behandlet med HPV-16 /HSV-tk PSV efterfulgt af behandling med ganciclovir signifikant udviste bedre terapeutiske antitumorvirkninger end mus behandlet med HPV-16 /GFP PSV efterfulgt af behandling med ganciclovir. Disse data indikerer HPV-16 pseudovirion kan anvendes til effektivt at levere HSV-tk-genet til ovarietumorceller at gøre ovarietumorceller mere modtagelige for behandling med ganciclovir.

C57BL /6-mus (5 pr gruppe) blev injiceret intraperitonealt med 1 x 10

6 MOSEC-Luc celler per mus på dag 1. Luciferaseaktivitet blev undersøgt på dag 2 som indikation af antallet af tumorer i musene. Mus blev injiceret HPV16-GFP PSV (L1-protein 20 ug) eller HPV16 /HSV-tk PSV i en dosis på L1-protein (20 ug /mus) på dag 3. Mus blev behandlet dagligt med ganciclovir i en dosis på 50 mg /kg eller PBS fra dag 5 til dag 18. Mus blev afbildet med ikke-invasive luminescens billeddiagnostiske teknikker på dag 20. Den viste data er repræsentative for 2 eksperimenter udført.

diskussion

Den vellykkede ansættelse af HSV-tk genet for kræft i æggestokkene genterapi hjælp HPV pseudovirioner tyder på, at andre egnede kandidatgener også kan leveres af HPV pseudovirion til ovarietumorer for kræft i æggestokkene genterapi. Adskillige kandidatgener for enzym-prodrug-kombinationer for selvmord genterapi er rapporteret herunder cytosindeaminase [18], [19], nitroreduktase [20], carboxylesterase [21], cytochrom P450 [22] og purinnucleosidphosphorylase [23]. Ligesom HSV-tk, kan enzymerne kodet af disse gener omdanne ikke-toksiske prodrugs til lægemidler stand til at blokere DNA-syntese, hvilket resulterer i eventuel celledød samt bystander effekter til at dræbe yderligere tilstødende tumorceller.

Til fremtidig klinisk oversættelse, vil det være vigtigt at overveje sikkerhedsmæssige betænkeligheder både HSV-tk /GCV-system og af leveringskøretøjet. Imidlertid cancer genterapi under anvendelse af HSV-tk blevet anvendt meget. Mange kliniske forsøg med denne fremgangsmåde er blevet udført hos patienter med gliomer og ingen alvorlige bivirkninger blev rapporteret (for gennemgang se [24], [25]). På den anden side, produktion af HPV pseudovirion som DNA levering køretøjer vil sandsynligvis kræve yderligere udvikling for at forbedre sin sikkerhedsprofil. Den aktuelle anvendte cellelinie til frembringelse af pseudovirioner indeholder SV40 stort T-antigen, som er et oncoprotein, og derfor rejser nogle mulige sikkerhedsproblemer. En alternativ tilgang med gær til frembringelse pseudovirioner er blevet beskrevet [26]. Masseproduktion af HPV pseudovirioner vil sandsynligvis også kræve effektive standardiserede protokoller at frembringe store titere af infektiøse HPV pseudovirioner til klinisk oversættelse.

I den aktuelle undersøgelse, vi demonstreret præferentiel infektion af murine og humane ovarietumorer af HPV-16 pseudovirion. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af Roberts et al. anvendelse af en nøgen mus model for peritoneal formidling af human ovariecancer cellelinie SHIN3 [27]. De fandt også, at HPV pseudovirion administreret intraperitonealt inficerede æggestokkene tumorvæv med høj specificitet, mens springe de normale peritoneal væv overflader. forskellige typer af HPV pseudovirion kan imidlertid demonstrere forskellige tumor og /eller væv tropismer. F.eks Cerio et al, har vist, at et HPV-16, men ikke HPV-45, pseudovirus kunne inficere SWA-G humane ovarietumorceller

in vitro

[28]. Deres data foreslår, at pseudovirus infektion af humane tumorer kan være HPV type- og tumor-specifikke. Således er det vigtigt for yderligere at identificere de rigtige typer af HPV pseudovirion for fremtidig cancer genterapi.

Mekanismerne for den foretrukne infektion af ovarietumorceller efter HPV pseudovirioner fortsat uklare. I vores undersøgelse viste vi, at et intakt L2 er essentielt for smitsomheden af ​​HPV-16 pseudovirion i ovarietumorer (se figur 2). HPV post til målceller er blevet vist at være indledt ved først at binde til heparin sulfoneret proteoglycan (HSPG) celleoverflade vedhæftningsfaktorer. HPV viruspartikler derefter undergå en konformationsændring, der udsætter den N-terminale ende af L2 mindre capsidprotein til furin spaltning [29], [30]. Proteolysen af ​​L2 udsætter en tidligere okkluderet overflade af L1, som binder til et endnu ikke fastlagt celleoverfladereceptor på celler, som menes at være ansvarlig for partikel internalisering (for en oversigt se [31]). Det har også vist sig, at de fleste ovarian cancer cellelinjer opregulere furin ekspression [32]. Således er det tænkeligt, at opregulering af furin ekspression kan bidrage til præferentiel infektion af ovarietumoren ved HPV pseudovirioner. Vi kan også udelukke, at fortrinsret infektion er en artefakt af passage tumorcellerne

in vitro

siden fortrinsret infektion blev observeret i spontant forekommende æggestokkene tumor model (se figur 3). Det vil være vigtigt for yderligere at karakterisere mekanismerne for den foretrukne infektion af æggestokkene tumorceller ved HPV pseudovirioner. Sådanne oplysninger vil være nyttige for at forbedre den specifikke levering af genet af interesse for æggestokkene tumorceller ved hjælp HPV pseudovirioner.

Sammenfattende fandt vi, at intraperitoneal injektion af HPV-16 pseudovirioner fører til præferentiel infektion af murine og humane ovarie kræftceller i tumorbærende mus. Desuden cancer genterapi hjælp HPV pseudovirioner bærer HSV-tk var i stand til specifikt at målrette ovarietumorer, hvilket resulterer potente terapeutiske antitumor virkninger mod tumorer i æggestokkene. Det vil være vigtigt for yderligere at identificere de bedst egnede til genterapi kandidater og terapeutiske regimer for fremtidige undersøgelser i retning af klinisk oversættelse.

Støtte oplysninger

figur S1.

Karakterisering af infektion af MOSEC tumorceller ved HPV-16 pseudovirioner

in vitro

. MOSEC celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5.000 celler /brønd natten før infektion. De podede MOSEC celler blev derefter inficeret med HPV-16 /Luc PSV (1 ug L1-protein /ml) i 72 timer og luciferase-ekspression blev undersøgt af IVIS 200 systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Luminescens billeder af MOSEC ovariecancer cellelinje (øverst). Søjlediagram, der viser de samlede fotontællinger for hver brønd (nederst). Bemærk: HPV-16 pseudovirioner effektivt kan inficere MOSEC mus ovariecancer

in vitro

. De viste data er repræsentative for 2 eksperimenter udført

doi:. 10,1371 /journal.pone.0040983.s001

(TIF)

figur S2.

Karakterisering af infektion af ES2 humane ovariecancerceller ved HPV-16 pseudovirioner

in vitro

. ES2 humane ovarie tumorceller blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5.000 celler /brønd natten før infektion. De podede ES2 celler blev derefter inficeret med HPV-16 /Luc PSV (1 ug L1-protein /ml) i 72 timer og luciferase-ekspression blev undersøgt ved IVIS 200-system (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Luminescens billeder af ES2 ovariecancer cellelinje (øverst). Søjlediagram, der viser de samlede fotontællinger for hver brønd (nederst). Bemærk: HPV-16 pseudovirioner effektivt kan inficere ES2 human ovariecancer in vitro. De viste data er repræsentative for 2 eksperimenter udført

doi:. 10,1371 /journal.pone.0040983.s002

(TIF)

figur S3.

In vitro

cytotoksicitet medieret af HPV16-tk pseudovirioner og ganciclovir. ES2-Luc celler blev inficeret HPV16-GFP PSV eller HPV16 /HSV-tk PSV i en koncentration på 1 ug L1 protein /ml i 48 timer. De inficerede celler blev podet i plader med 96 brønde og derefter behandlet med 0 ug /ml, 0,1 pg /ml, 1 ug /ml eller 10 ug /ml Ganciclovir i 72 timer. Luciferaseekspression blev undersøgt af IVIS 200-systemet (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). De viste data er repræsentative for 2 eksperimenter udført

doi:. 10,1371 /journal.pone.0040983.s003

(TIF)

Tak

Vi vil gerne takke Katherine Liu ( JHMI) for udarbejdelsen af ​​manuskriptet.