PLoS ONE: Kliniske og Prognostiske Konsekvenserne af Transskription Factor SOX4 hos patienter med tyktarmskræft

Abstrakt

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige maligne kræftformer verdensplan, men de nuværende terapeutiske strategier til avanceret tyktarmskræft er mindre effektive. Dette studie undersøgte associationer mellem ekspressionen af ​​nukleare transkriptionsfaktor SOX4 og forskellige clinicopathologic parametre samt patienternes overlevelse. Ekspressionsniveauer af nukleare SOX4 blev analyseret ved immunhistokemi; data omfattede colonvæv fra 263 patienter med coloncancer. Parret

t Salg tests blev anvendt til at analysere forskellene i nuklear SOX4 ekspression mellem tumor og ikke-tumor-væv fra hver patient. To-tailed Χ

2 tests blev udført for at bestemme, hvorvidt forskellene i nukleare SOX4 udtryk og clinicopathologic parametre var signifikant. Time-to-begivenhed endepunkter for clinicopathologic parametre blev plottet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden, og statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse univariate log-rank test. Cox proportional hazard model blev brugt til multivariat analyse for at bestemme uafhængighed prognostiske virkninger af nuklear SOX4 udtryk. Overekspression af nuklear SOX4 var signifikant korreleret med dybden af ​​invasion (

P

= 0,0041), fjernmetastaser (

P

0,0001), og fase (

P

= 0,0001 ). Patienter, der viste høje ekspressionsniveauer af nukleare SOX4 opnået en markant dårligere sygdomsfri overlevelse sammenlignet med patienter med lav SOX4 udtryk niveauer (

P

0,001). Univariate Cox regressionsanalyse viste, at overekspression af nuklear SOX4 var en klar prognostisk markør for tyktarmskræft (

P

= 0,001). Overekspression af nuklear SOX4 kan anvendes som en markør til at forudsige resultatet af patienter med coloncancer

Henvisning:. Lin C-M, Fang C-L, Hseu Y-C, Chen C-L, Wang J-W, Hsu S-L, et al. (2013) Kliniske og Prognostiske Konsekvenserne af Transskription Factor SOX4 hos patienter med tyktarmskræft. PLoS ONE 8 (6): e67128. doi: 10,1371 /journal.pone.0067128

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: Marts 21, 2013; Accepteret: 14 maj 2013; Udgivet: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Chi Mei Medical center (Grant No. 101 cm-TMU-03) (https://www.chimei.org.tw). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarmskræft er en af ​​de hyppigste kræftformer og en almindelig årsag til cancer-relaterede dødsfald [1]. I Taiwan, tyktarmskræft rangerer som den hyppigst diagnosticerede malignitet og forårsager mere end 4900 dødsfald om året (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; adgang i september 2012). På trods af de nuværende kirurgiske teknikker og kemoterapi, der har gjort betydelige forbedringer, grundet dårlig prognose og fjern invasion og migration, den samlede forekomst af tyktarmskræft er ca. 5% og 5-års overlevelsesraten for patienter med tyktarmskræft er meget lav [2]. , Identifikation af nye mål for udviklingen af ​​ikke-konventionelle behandlinger er således påtrængende og vil drage fordel af fremskridt i bred og dyb forståelse af den molekylære patogenese for tyktarmskræft.

Blandt de prognostiske markører nu tilgængelig for tyktarmskræft, det vigtigste er den amerikanske Blandede cancer (AJCC) fase bestemmes af dybden af ​​invasionen, inddragelse af lymfeknuder, og fjern metastaser. Imidlertid er prognosen varierer selv blandt patienter på samme stadium,. I de seneste årtier har flere undersøgelser antydet, at genetiske ændringer kan spille en rolle i udviklingen og progressionen af ​​tyktarmskræft [3], [4]. Studier i molekylær patologi kan hjælpe med at forstå sygdommen patogenese og måske også afsløre nyttige prognostiske molekylære markører. Nogle foreslåede biologiske prognostiske markører indbefatter overekspression af protein kinase CK2, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), forstærker af Zestes homolog 2 og transglutaminase 2 [5] – [8].

Hos mennesker sex-bestemmende region Y (SRY) kasse familie, også kaldet SOX familien omfatter 20 højt konserverede transkriptionsfaktorer, der spiller vigtige roller i udviklingen. Disse transskriptionsfaktorer er defineret af en konserveret signatur sekvens i høj mobilitet gruppe (HMG) DNA-bindende domæne (DBD) [9], [10]. SOX4 er en 47-kDa protein, som kodes af en enkelt exon gen, som er stærkt bevaret i hvirveldyr. Hos mus er SOX4 specifikt udtrykkes i ovariet, testikel, brystkirtel og thymus og i muse T og præ-B lymfocytiske cellelinier [11]. Desuden SOX4 er afgørende for udviklingen af ​​hjertet, lymfocytter og thymocytter, og SOX4-null mus dør af hjertedefekter [12]. Proliferative kapacitet B-celle-progenitorer er alvorligt nedsat i celler fra SOX4 knockout mus [13].

Den kliniske betydning SOX4 har fået stigende opmærksomhed i de senere år, med talrige rapporter tyder på, at SOX4 kan bidrage til tumor progression. Tre uafhængige undersøgelser screening for vigtige onkogener viste, at SOX4 ofte ændres gennem retrovirale insertioner [14] – [16]. Det murine leukæmivirus typisk målrettet SOX4, og stabiliserede SOX4 meddelelsen for at frembringe B-cellelymfomer, der udviste øget SOX4 meddelelsesniveauer [16]. Øget SOX4 ekspression er associeret med tumorer i blæren, prostata, og med ikke-småcellet tumorer [17] – [19]. Imidlertid er den rolle, SOX4 i sådanne tumorer ikke fuldt forstået, og de rapporterede data har vist visse modsigelser. Betragtninger SOX4 knockdown resulterede i apoptose af ACC3 adenoid cystisk carcinom celler, SOX4 overekspression forfremmet cellecyklusstop og apoptose af HCT116 coloncarcinomceller [20], [21]. Den microRNA (miRNA) MIR-335 inhiberede metastatisk celleinvasion og handlede, i det mindste delvist, ved at målrette

sox4

og dens formodede mål

TNC

, som koder for et ekstracellulær matrixkomponent impliceret i celle migration [22]. Derimod jo højere niveau af SOX4 ekspression, jo bedre er prognosen for patienter med medulloblastomer og andre tumortyper [23]. Således kan SOX4 udøve forskellige virkninger på tumorceller afhængig af kontekst og første tilvirkning mekanisme; yderligere undersøgelser er berettiget til at afklare dette spørgsmål.

Til dato har den prognostiske betydning af nukleare SOX4 ekspressionsniveauerne i human tyktarmskræft ikke fastslået. Dette studie undersøgte sammenhængen mellem nuklear SOX4 udtryk og clinicopathologic parametre, og vurderet betydningen af ​​nuklear SOX4 forudsige prognosen for patienter med tyktarmskræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

de institutionelle gennemgang bord Chi Mei Medical center godkendt købet væv protokol for den immunhistokemiske og immunoblotting undersøgelse. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager før overtagelsen væv.

Deltagere og Prøver

Vi indsamlede 263 træk tyktarmskræft sager fra de medicinske filer af Chi Mei Medical Center i Taiwan. Alle patienter, der indgår i vores undersøgelse gruppe blev behandlet mellem 1998 og 2005, og havde modtaget kolektomi med lymfeknude dissektion. Alle tilfælde fik væv bevis for adenocarcinom via coloskopisk biopsi før operation. Fuldstændighed af kirurgisk resektion blev opnået i alle tilfælde, og patologisk undersøgelse viste ingen tumor involvering af resektionsrandene i kirurgiske prøver. Ingen af ​​vores undersøgelse patienter havde fået præoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling. Den ikke-tumor portion blev opnået fra groft normal colon mucosa, separat fra tumoren, i resektion kolon prøve. Clinicopathologic parametre for tyktarmskræft blev bestemt i henhold til AJCC klassificering. Opfølgningen varighed for sygdomsfri overlevelse blev defineret som perioden mellem driften dato og dagen for tilbagefald, i henhold til patientens journal. For hver patient, analyserede vi et par tumor og ikke-tumor colonvæv at bestemme den nukleare SOX4 ekspression.

Immunohistokemisk analyse

Nuclear SOX4 ekspression blev analyseret ved immunohistokemi. Paraffinindlejrede væv blokke blev snittet på 5 um og overført til mikroskop slides (Muto Pure Chemicals Co Ltd, Tokyo, Japan). Brystvæv blev anvendt som en positiv kontrol for SOX4. Den negative kontrol indebar udeladelse af det primære antistof og inkubering med phosphatbuffer saltvand. Snit blev afvokset med xylen, efterfulgt af rehydrering i graduerede alkoholer. Deparaffinerede snit blev inkuberet i pH 6,0 citratpuffer i 40 minutter ved 95 ° C på en varmeplade for at hente antigener. Yderligere antigen blokering blev udført under anvendelse Dako REAL Peroxidase-blokeringsopløsning (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) i 5 minutter. Objektglassene blev efterfølgende inkuberet med primært antistof: polyklonalt anti-SOX4 (levetid, Victoria, Canada) i 1 time ved stuetemperatur, ved en fortynding på 1:3200. Påvisning af det immunoreaktive farvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-kompleks fremgangsmåde ifølge producentens instruktioner. Et følsomt Dako REAL EnVision Detection System (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) blev anvendt. Efter inkubation med diaminobenzidin i 5 minutter blev snittene modfarvet med hematoxylin og monteret i Dako Faramount Vandigt Mounting Medium (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) til mikroskopisk fortolkning. Immunoreaktivitet semikvantitativt scoret baseret på intensiteten af ​​immunofarvning: 0, ingen farvning; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; 3, stærk farvning. Sektioner med en score på 0 eller 1 viste lav udtryk for SOX4, mens dem, der scorede 2 eller 3 blev defineret som havende høj ekspression eller overekspression af SOX4. Klinisk dataindsamling og immunhistokemisk analyse blev udført uafhængigt af hinanden, i en investigator-blindet undersøgelse.

Cell Culture

Humant normalt (FHC) og tyktarmskræft cellelinjer (DLD-1 og WiDr ) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellelinjer blev bekræftet af ATCC cellebiologi program, og blev passeret i højst seks måneder før nye celler blev bragt ud af den frosne tilstand eller en ny celle portion blev købt fra ATCC. Celler blev dyrket i DMEM /F-12 (FHC), RPMI-1640 (DLD-1), eller MEM (WiDr) medier suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycinsulfat, og 250 ng /mL amphotericin B.

Nuclear proteinpræparat

nukleare proteiner blev ekstraheret under anvendelse NE-PER Nuclear Extraction Reagent (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ifølge producentens instruktioner. Prøverne blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology) med bovint serumalbumin som en standard.

immunblotting

denatureret protein prøver blev underkastet 12% SDS-PAGE. Proteiner blev overført til nitrocellulosemembraner, og blokerede blots blev inkuberet ved 4 ° C natten over med anti-SOX4 polyklonalt antistof (1:1000 fortynding). TATA-bindende protein blev anvendt som en intern kontrol for lige protein loading. Blots blev yderligere inkuberet med sekundære antistoffer konjugeret med peroxidase (Sigma, St. Louis, MO) i 1 time ved stuetemperatur. De blev derefter inkuberet med SuperSignal West Femto Maximun Følsomhed Substrat (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), og udsat for en Fuji medicinske røntgenfilm (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan). Billedbehandling blev udført under anvendelse Fuji billede Gauge software.

Statistical Analysis

Forbundne

t

tests blev anvendt til at vurdere forskellen i nukleare SOX4 ekspression mellem tumor og ikke-tumor-væv for hver patient. Vi undersøgte flere clinicopathologic parametre: alder, køn, dybde af invasion, nodal status, fjernmetastaser, stage, grad af differentiering, vaskulær gennemtrængning og perineurale invasion. Sammenhængen mellem nukleare SOX4 udtryk og hver clinicopathologic parameter blev undersøgt ved hjælp af χ

2 test. Time-to-event endepunkter for alle clinicopathologic parametre blev afbildet ved Kaplan-Meier-metoden, og graden af ​​signifikans blev beregnet af univariate log-rank test. Parametre, der opstod som væsentlige (

P

≤0.05) i univariat analyse blev opført som variable i den multivariate Cox regressionsmodellen og hazard ratio (HR) og uafhængighed prognostisk effekt kunne bestemmes i en trinvis baglæns måde. Alle data blev analyseret under anvendelse af SPSS software-version 17,0 (SPSS, Chicago, IL). En

P

værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Demografi

Denne undersøgelse indskrevet 263 patienter med tyktarmskræft, 154 af dem var. mænd og 109 var kvinder (tabel 1). Patienternes alder varierede fra 21 til 92 år ved første diagnose (gennemsnit ± standarad afvigelse (standardafvigelse): 68,0 ± 12,9 år). Baseret på AJCC klassificering, 25 patienter var på trin I, 91 var i trin II, 108 var i stadie III, og 39 var på stadium IV. Opfølgningen periode for alle patienter varierede fra 0 til 146 måneder (gennemsnit ± standardafvigelse .: 58,6 ± 40,2 måneder). Under opfølgning, 116 patienter døde af tyktarmskræft.

Nuclear SOX4 Expression blev opreguleret og associerede med Clinicopathologic Parametre i Colon Cancer

Vi brugte immunhistokemisk analyse til at undersøge ekspressionen af ​​nukleare SOX4 i væv fra vores studie patienter (figur 1A til C). Nuklear SOX4 udtryk var signifikant højere i tumorvæv end i ikke-tumorvæv (

P

0,001). Overekspression af nukleare SOX4 (snesevis af 2 eller 3) blev observeret i 119 af de 263 patienter (45,2%). Western blot-analyse viste også, at ekspressionen af ​​SOX4 væsentlige blev forøget i colon cancerceller og væv sammenlignet med normale celler og væv (figur 1D). Derudover demonstrerede kvantitativ real-time PCR-analyse, at ekspressionen af ​​SOX4 mRNA væsentligt forhøjet i tumorvæv sammenlignet med ikke-tumorvæv (tabel 2). Som vist i tabel 3, overekspression af nukleare SOX4 korreleret betydeligt med følgende parametre: dybden af ​​invasion (

P

= 0,0041), fjernmetastaser (

P

0,0001), og fase (

P

= 0,0001). Ingen signifikant sammenhæng opstod mellem overekspression af nukleare SOX4 og alder, køn, nodal status, grad af differentiering, vaskulær invasion, eller perineurale invasion

Paneler A til C:. Tyktarmskræft prøver analyseret ved immunhistokemi med et antistof mod SOX4 . Panel A viser en prøve uden SOX4 udtryk; Panel B viser en prøve med lavt ekspressionsniveau af SOX4; Felt C viser en prøve med højt ekspressionsniveau af SOX4. Felt D: Nuclear SOX4 proteinekspression blev undersøgt i 3 colonceller og 3 ikke-tumor /tumor par colonvæv. Forstørrelse:. 200 × Vejviser

Overekspression af Nuclear SOX4 som prognostisk markør for Colon Cancer

Sammenslutninger af kliniske resultater med nukleare SOX4 udtryk er vist i figur 2 . Overekspression af nukleare SOX4 var signifikant associeret med kortere sygdomsfri overlevelse (

P

0,001). Patienter med høj ekspressionsniveauer af nukleare SOX4 opnået en 5-års sygdomsfri overlevelse på 58,3% sammenlignet med 76,6% for patienter med lave ekspressionsniveauer. Endvidere high-trins GC (stadium III og IV) blev anvendt til at finde ud af virkningen af ​​nuklear SOX4 overekspression på prognosen. Overekspression af nuklear SOX4 var signifikant associeret med kortere sygdomsfri overlevelse (

P

= 0,016, figur 3). Patienter med høj ekspressionsniveauer af nukleare SOX4 opnået en 5-års sygdomsfri overlevelse på 44,8% sammenlignet med 63,8% for patienter med lave ekspressionsniveauer.

Alle statistiske tests blev tosidede og signifikansniveau var

P

. 0,05

Alle statistiske tests blev tosidede og signifikansniveau var

P

. 0,05

resultaterne af univariat analyse af de prognostiske markører for tyktarmskræft er vist i tabel 4. sygdomsfri overlevelse var signifikant korreleret med hver af følgende: dybden af ​​invasion (

P

= 0,029), nodal status (

P

0,001), fjernmetastaser (

P

0,001), fase (

P

0,001), vaskulær invasion (

P

0,001), perineurale invasion (

P

0,001), og overekspression af nukleare SOX4 (

P

= 0,001). Men sammenhængen mellem overekspression af nukleare SOX4 og overlevelse var ikke signifikant efter kontrol for andre kendte prognostiske markører i multivariat analyse (

P

= 0,425, tabel 5). I multivariat analyse, fjernmetastaser (HR = 0,052, 95% CI = 0,024-0,111,

P

= 0,001). Var prognostisk uafhængig

Diskussion

Tyktarmskræft fortsat et stort problem for folkesundheden på verdensplan [1]. På trods af de nuværende kirurgiske teknikker og kemoterapi, der har gjort betydelige forbedringer, kuren sats for fremskreden tyktarmskræft er fortsat lav og morbiditet er fortsat høj [2]. Større viden om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af ​​denne dødelige neoplasme er nødvendig, hvis nye strategier for at forebygge og behandle tyktarmskræft skal udvikles. Især identifikation af molekyler, der er ændret i løbet af kræft initiering og progression kan give værdifulde værktøjer som prognostiske markører eller terapeutiske mål.

Ekspressionen af ​​SOX4 i humane cancere varierer alt efter cancer type. Den SOX4 niveauet er forhøjet i adskillige humane kræftformer, herunder af blæren, prostata, endometrium, og lever, mens den er faldet i melanom og galdeblære kræft [17], [18], [24] – [27]. I den foreliggende undersøgelse, vi vurderede ekspressionsniveauerne af nukleare SOX4 i colon væv fra 263 patienter med tyktarmskræft. Vores resultater var i overensstemmelse med dem i blære og prostatacancer, og viste, at nuklear SOX4 ekspression blev forhøjet i colon tumorvæv i forhold til ikke-tumor-colonvæv. De immunoblotting Resultaterne bekræftede, at nuklear SOX4 udtryk var højere i tyktarmen kræftceller end i normale kolon celler.

Vores fund viste også, at overekspression af nuklear SOX4 i tyktarmskræft væv var tæt korreleret med tumor invasion og metastase. Den mekanisme, hvorved SOX4 udøver sin invasive og metastatiske aktivitet er stadig uklar. I første linje af beviser, blev miRNA (lille ikke-kodende RNA med regulatoriske funktioner) vist sig at være forbundet med tumor invasion og metastase [28], [29]. Tidligere arbejde af Tavazoie et al. viste, at MIR-335 undertrykker metastase gennem nedregulering af SOX4 [22]. Dette resultat antydede, at SOX4 er knyttet til tumor aggressivitet.

Den anden linje af beviser er leveret af undersøgelser af epitel-mesenkymale overgang (EMT), som er et vigtigt skridt i løbet af embryogenese [30]. Akkumulere tyder på, at uhensigtsmæssig anvendelse af EMT kan være en bestanddel af invasionen af ​​mange tumorer af epitelvæv. Cell egenskaber er stærkt påvirket under EMT, hvilket resulterer i ændringer i celle-celle og celle-matrix interaktioner, celle motilitet, og invasivitet [31], [32]. Nylig undersøgelse af Zhang et al. viste, at overekspression af SOX4 i humane mammae epitelceller førte til erhvervelse af mesenchymale træk, og øget cellemigration og invasion. Endvidere SOX4 reguleres positivt ekspressionen af ​​kendte EMT induktorer og aktiveret TGF-β-vejen for at bidrage til EMT. Ekspressionen af ​​SOX4 blev induceret ved TGF-β og var nødvendig for TGF-β-induceret EMT. Disse resultater viser, at SOX4 spiller en vigtig rolle i progressionen af ​​brystcancer, ved at skabe EMT [33]. Disse undersøgelser kan forklare en del af sammenslutningen af ​​overekspression af nukleare SOX4 med tumor invasion og metastase.

Præcis forudsigelse af risikoen for tilbagefald ville hjælpe med at minimere de negative virkninger af tyktarmskræft og maksimere den terapeutiske effekt af behandling . Af de tilgængelige prognostiske markører for coloncancer, den AJCC fase er vigtigst. Imidlertid er prognosen varierer selv blandt patienter på samme sygdom fase; dermed søges alternative prognostiske markører. Kun få studier har undersøgt den prognostiske værdi af SOX4 proteiner. Aaboe et al. viste, at en stærk sammenhæng eksisterede mellem øget SOX4 udtryk og øget patientsikkerhed overlevelse i tilfælde af blærekræft [17]. Tilsvarende Kim et al. viste, at overekspression af SOX4 protein hos patienter med hepatocellulær carcinom var forbundet med forbedrede patient resultater [25]. Desuden Jafarnejad et al. viste, at i melanom patienter, fandtes en stærk sammenhæng mellem reduceret SOX4 udtryk og dårlig patient overlevelse [26]. Vi fandt ingen publicerede rapporter diskuterer den prognostiske betydning af SOX4 i human coloncancer. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at nukleare SOX4 overekspression omvendt var forbundet med patientens overlevelse; dette fund modsiges de tidligere rapporterede positive associationer. Vores undersøgelse var den første til at vise, at overekspression af nuklear SOX4 kan forudsige dårligere behandlingsresultater for patienter med coloncancer. Overekspression af nuklear SOX4 synes at være en nyttig markør til at forudsige resultater hos patienter med coloncancer, som har modtaget kirurgisk resektion af tumoren. Derfor bør patienter med tyktarmskræft, der viser overekspression af nukleare SOX4 følges op omhyggeligt. Fordi vores patientgruppe var lille, bør fremtidige studier omfatte en større tyktarmskræft patientgruppe at belyse den prognostiske betydning af nukleare SOX4 i denne sygdom.

Sammenfattende dette studie fremlagt dokumentation for den kliniske betydning af overudtrykt SOX4 i patienter med coloncancer. Vores resultater viser, at målretning SOX4 kunne tilvejebringe en ny terapeutisk modalitet til behandling af coloncancer.