PLoS ONE: A Novel strategien at forbedre den terapeutiske virkning af gemcitabin for ikke-småcellet lungekræft ved Tumor-Penetrerende peptid iRGD

Abstrakt

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige type lungekræft, der omfatter ca. 75-80% af alle lungekræft. Gemcitabin er en godkendt kemoterapi stof for NSCLC. Formålet med dette studie var at udvikle en ny strategi for at forbedre den terapeutiske effekt af gemcitabin for NSCLC af co-administrerede iRGD peptid. Vi viste, at satserne for positivt udtryk for avp3, αvβ5 og NRP-1 i A549-cellelinje var 68,5%, 35,3% og 94,5%, hhv. Mængden af ​​Evans Blå akkumuleret i tumoren af ​​Evans Blå + iRGD gruppen var 2,5 gange højere end Evans Blå gruppe. Satserne for væksthæmning af tumorer i iRGD gruppe, gemcitabin gruppen og Gemcitabin + iRGD gruppen var 8%, 59,8% og 86,9%, hhv. Resultaterne af mekanismen studier viste, at PCNA-ekspression i Gemcitabin + iRGD gruppe faldt 71,5% i forhold til det i Gemcitabine gruppe. Hastigheden af ​​apoptose i Gemcitabin + iRGD gruppen var 2,2 gang den for Gemcitabine gruppen. Derfor kan det tumor-gennemtrængende Peptid iRGD forbedre det tumor-indtrængningsevne og terapeutisk virkning af gemcitabin i A549 xenograft. Den kombinerede anvendelse af gemcitabin med iRGD kan være en roman strategi at styrke den kliniske terapeutiske effekt af gemcitabin til patienter med NSCLC

Henvisning:. Zhang Q, Zhang Y, Li K, Wang H, Li H, Zheng J (2015) A Novel strategien at forbedre den terapeutiske virkning af gemcitabin for ikke-småcellet lungekræft ved Tumor-Penetrating Peptide iRGD. PLoS ONE 10 (6): e0129865. doi: 10,1371 /journal.pone.0129865

Academic Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, ITALIEN

Modtaget: 25 oktober, 2014 Accepteret: 13. maj 2015; Udgivet: Juni 12, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK2012146, https://www.jstd.gov.cn/), National Natural Science Foundation of China (81.301.946, https://www.nsfc.gov.cn/), Jiangsu Provincial Office of Education Foundation (JHB2012-34, https://www.ec.js.edu.cn/), Kina Postdoc Science Foundation finansieret projekt (2013M540467, https://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), og Xuzhou Medical College Foundation (2012KJZ23, https://www.xzmc.edu.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan og fortsætter med at vise en stigende forekomst [1, 2]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige form for lungekræft, der omfatter ca. 75-80% af alle lungekræfttilfælde [3]. Diagnosen ofte lavet i patienter med fremskreden-stadie sygdom, og i næsten to tredjedele af alle tilfælde har kræften allerede spredt ud over et lokaliseret område på tidspunktet for diagnosen [4-6]. Dette begrænser valgmulighederne til terapi og fører til en dårlig prognose med en median overlevelse på mindre end 12 måneder [7, 8]. De fleste patienter med NSCLC stede med inoperabel sygdom, og derfor er de nuværende behandlingsmuligheder af kemoterapi og strålebehandling er palliative i bedste [7, 9]. Mange traditionelle cytotoksiske lægemidler, herunder Vindesin, carboplatin, etoposid, ifosfamid, cyclophosphamid og mitomycin, er blevet anvendt som monoterapi i tilfælde af NSCLC. I de sidste par år har nogle nye kemoterapeutiske midler, såsom vinorelbin, paclitaxel, docetaxel og Gemcitabin også blevet anvendt til behandling af NSCLC. Men disse kemoterapeutiske midler kun giver små forbedringer i samlet overlevelse [10].

Gemcitabin er et deoxycytidin analog, som omdannes in vivo til aktive metabolitter herunder difluordeoxycytidin di- og triphosphat [11]. Triphosphatet analoge Gemcitabin erstatter en af ​​nukleinsyre-byggesten (i dette tilfælde, cytidin) under DNA-replikation. Denne proces anholdelser tumorvækst og i sidste ende fører til apoptose. Andet mål af gemcitabin er ribonukleotidreduktase. Difosfat analog binder til det aktive sted i ribonukleotidreduktase og irreversibelt inaktiverer enzymet. Når enzymet inhiberes, er DNA-replikation og reparation afsluttes, og apoptose induceres [11-13]. Gemcitabin er blevet godkendt af Food and Drug Administration (FDA) som en behandling for avanceret og metastatisk NSCLC, bugspytkirtelkræft, blærekræft, kræft i æggestokkene og brystkræft alene eller i kombination med andre lægemidler [14].

Kliniske forsøg har vist, at Gemcitabin kunne forlænge overlevelsen og forbedre livskvaliteten for patienter med fremskreden NSCLC [14, 15]. Nogle undersøgelser har rapporteret, at gemcitabin konsekvent giver svarprocenter, der overstiger 20%, når det anvendes som et enkelt middel [14, 16, 17]. Men Gemcitabin ofte undlader at opnå tilstrækkelig kontrol med sygdomme på grund af utilstrækkelig cytotoksicitet til tumorcellerne og utålelige bivirkninger. Den mediane overlevelse forlænges for blot 2-4 måneder, og de fleste patienter dør af sygdomsprogression [7, 9]. Derfor kan en simpel forøgelse af dosis ikke forbedre tilstanden af ​​patienter; tværtimod, kan det føre til alvorlige bivirkninger.

Tidligere undersøgelser har vist, at passage af karvæggen og indtrængen i tumoren parenkym mod forhøjet interstitielle tryk i tumorer er fortsat en stor udfordring for den terapeutiske effekten af ​​de fleste kliniske lægemidler [18]. Nogle anticancerlægemidler kan kun trænge en afstand på 3 til 5 cellediametre fra blodkarrene i faste tumorer [19]. For eksempel er koncentrationen af ​​doxorubicin aftager eksponentielt som afstanden fra tumor blodkar stiger, og den når halvdelen af ​​sin perivaskulær koncentration i en afstand på ca. 40 pm [20]. Fordelingen af ​​Trastuzumab (Herceptin) i det indre område af brysttumor-xenotransplantater er også stærkt heterogen, hvilket resulterer i en manglende eksponering af mange tumorceller til detekterbare niveauer af lægemidlet [21]. Derfor kan øget tumor permeabilitet være en nyttig tilgang til at øge den terapeutiske effekt af kemoterapi narkotika.

iRGD er en tumor-gennemtrængende peptid (CRGDK /RGPD /EF), der har en specifik permeabilitet i tumorvæv og i tumorvaskulatur [22]. RGD tripeptid af iRGD kan binde integrinerne avp3 og αvβ5, er udtrykkene for hvilke stort set begrænset til tumorer (herunder tumorvaskulatur og celler) [22, 23]. Når iRGD binder til integriner, er peptidbindingen mellem aminosyrerne K og G spaltes proteolytisk ved celleoverfladen-associerede proteaser; derefter er det kryptiske C-ende-reglen (CendR) motiv (CRGDK /R) blotlagt. Den CendR motiv binder derefter til neuropilin-1 (NRP-1). Aktiveringen af ​​NRP-1 øger permeabiliteten af ​​blodkar og tumorvæv, som tillader medicin til at trænge ind i indre væv af tumoren meget lettere [22-24]. Det er blevet bekræftet, at iRGD har værdifulde potentiale som en målsøgende probe til molekylær billeddannelse af tumorer og til lægemiddelafgivelse, og kan forbedre effektiviteten af ​​alle stoffer op til 3 gange [24].

I denne undersøgelse vi kombineret Gemcitabin med iRGD at behandle nøgne mus implanteret af humant NSCLC oprettet med A549-cellelinje. Vores resultater viste, at iRGD effektivt kan stimulere Gemcitabin at inhibere tumorcelleproliferation og inducere tumor celle apoptose. In vivo terapeutisk effektivitet blev også signifikant forøget. Disse resultater antydede, at kombinationsbehandling med iRGD kan være en lovende metode til at forbedre den kliniske effekt af gemcitabin til behandling af NSCLC.

Materialer og metoder

Cell kultur

menneskelig NSCLC-afledt cellelinje A549 blev købt fra Shanghai Institute for Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og dyrket i F-12K medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Grand Island, NY, USA) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Flowcytometri

i alt 1 × 10

6 A549-celler blev inkuberet med fluorescensmærkede antistoffer fortyndet i 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter vasket, suspenderet og evalueres med en FACS maskine (FACSCanto II, Becton-Dickinson, USA). En matchet isotypekontrolantistof blev anvendt i alle analyser. Endelig blev alle data analyseres ved FlowJo software (Tree stjerne, USA). FITC-konjugeret muse-anti-humant integrin avp3 antistof og integrin αvβ5 antistoffer blev indkøbt fra Chemicon (CA, USA). Den matchede isotypekontrolantistof, FITC-konjugeret mus IgG1ĸ, blev købt fra eBioscience (San Diego, CA, USA). PE-konjugeret muse-anti-human NRP-1 antistof og dets isotypekontrol blev købt fra MACS Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Nordrhein-Westfalen, Tyskland).

Mus og in vivo forsøg

I vivo eksperimenter involverede seks uger gamle BALB /C nøgne mus (Vital River Laboratory Animal Technology Co, Ltd, Beijing, Kina), der blev anbragt i SPF-dyr facilitet for Eksperimentel Animal center, Xuzhou Medical College (Kina ). Dyrene blev anbragt med en 12-timers lys /mørke cyklus, i temperatur (22 +/- 1 ° C) og fugtighed (55 +/- 5%) kontrolleret rum. Alle mus fik fri adgang til sterilt vand og mad. Alle bure opstaldet op til 6 dyr og indeholdt høvlspåner og uafhængig lufttilførsel system. Alle dyr eksperimentelle protokoller blev godkendt og revideret af Institutional Animal Care og brug Udvalg Jiangsu Provincial Academy of kinesisk medicin (SCXK 2012-0005). Under in vivo forsøg blev dyr i alle forsøgsgrupper undersøgt dagligt for fysisk aktivitet. Ved slutningen af ​​forsøget blev musene aflivet ved cervikal dislokation.

tumormodel

Den humane NSCLC model blev etableret som tidligere beskrevet [25]. Kort fortalt, 1 x 10

7 A549-celler blev injiceret i den venstre forben armhulerne af 6 BALB /c nøgne mus. Når tumorerne voksede til ca. 150 mm

3, tumorerne høstet og segmenteret i væv blokke (4-6 mm

3 i størrelse). Derefter blev de venstre forben armhulerne af BALB /c nøgne mus inokuleret s.c. med vævet blokke ved en trokar. Musene blev behandlet, når tumorerne voksede til den ønskede størrelse.

Immunfluorescensfarvning

Når tumorerne nåede ca. 200 mm

3, blev musene aflivet, og tumorerne blev dissekeret og sektioneret på en kryostat. De dele af de fire grupper (n = 3) blev inkuberet natten over ved 4 ° C med det samme anti-human avp3, αvβ5 og deres isotypekontrolantistoffer som dem, der anvendes i flowcytometrisk analyse. De dele af de to grupper blev farvet natten over ved 4 ° C med et primært kanin-anti-humant NRP-1-antistof (Abcam, Beverly, MA, USA) og dens isotypekontrolantistof (Abcam, Beverly, MA, USA). Derefter blev snittene farvet med en DyLight 549-konjugeret gede anti-kanin IgG (H + L) sekundært antistof (EarthOx, San Francisco, CA, USA) ved 37 ° C i 1 time. Alle sektioner blev derefter observeret og fotograferet med en fluorescens mikroskop (DS-Ri1, Nikon, Japan).

Tumor permeabilitet assay

Når tumorerne nåede ca. 150 mm

3, i alt på 50 mg /kg Evans blåt, 4 mg /kg iRGD, 50 mg /kg Evans Blå + 4 mg /kg iRGD i 200 pi PBS som køretøjer eller 200 pi PBS alene blev injiceret i de fire grupper af tumorbærende mus (n = 3) hhv. Tredive minutter senere blev musene bedøvet med chloralhydrat og blev perfunderet gennem hjertet med PBS med 1% BSA. Derefter blev organer og tumorvæv opsamlet. For Evans Blå kvantificering, 10 pi N, N-dimethylformamid tilsat for hver 10 mg væv. Efter homogenisering blev blandingerne inkuberet ved 37 ° C i 24 timer blev blandingerne derefter centrifugeret, og supernatanterne blev høstet. Endelig kvantificering blev udført ved at måle absorbansen ved 600 nm med et spektrofotometer (BioTek Epoch, USA).

In vivo effektivitetsundersøgelser

Når tumorerne nåede ca. 100 mm

3 efter 10 dage blev musene inddelt i fire grupper (n = 6). I alt 100 mg /kg Gemcitabin (Merck, Darmstadt, Tyskland), 4 mg /kg iRGD, 100 mg /kg Gemcitabin + 4 mg /kg iRGD i 200 pi PBS som køretøj eller 200 pi PBS alene blev injiceret i mus af de fire grupper via halevenen. Injektionerne blev udført to gange om ugen i i alt 8 gange. Volumenet af tumorerne blev målt i to vinkelrette retninger med en tykkelse, og vægten af ​​den nøgne mus blev beregnet hver tredje dag. Volumenet blev målt under anvendelse af følgende formel: V = 0,5 × (W

2 × L), hvor V = tumorvolumen, W = den mindre vinkelrette diameter og L = den større vinkelrette diameter. På dag 30 blev musene aflivet, tumorerne blev opsamlet og vejet. Tumorvækstinhiberingen ratio (TGIR) beregnedes under anvendelse af formlen TGIR = (W – W

t) /W × 100%, hvor W er den gennemsnitlige tumorvægt for kontrolgruppen og W

t er den gennemsnitlige tumorvægt af behandlingsgruppe. Alle tumorer blev skåret i to dele henholdsvis og blev forarbejdet som følgende beskrivelse.

Immunohistokemisk farvning

Halvdelen af ​​hver tumor høstet ved afslutningen af ​​behandlingen undersøgelsen blev fikseret i 10% neutralisering pufret formalin, derefter indlejret i paraffin og skåret i 3-5μm sektioner [26]. Forsøgene blev udført med et streptavidin-peroxidase-systemet (SP) ifølge fabrikantens protokol (ZSGB-BIO, Beijing, Kina). Prolifererende cellekerneantigen (PCNA) blev påvist med et anti-PCNA-antistof (Abcam, Beverly, MA, USA). Billeddannelse blev udført ved fluorescensmikroskopi (DS-Ri1, Nikon, Japan). For at bestemme IOD indekset for PCNA blev fem repræsentative visuelle områder, der var positive for PCNA undersøgt fra hver tumor. Den PCNA indeks for hver udvalgt område blev analyseret ved hjælp af IPP-software.

TUNEL assay

De paraffinsnit blev fremstillet som beskrevet ovenfor. De apoptotiske celler blev detekteret ved anvendelse af en TdT-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) Kit ifølge producentens protokol (Roche, Mannheim, Tyskland). Antallet af TUNEL-positive celler blev talt i fem tilfældigt udvalgte felter fra hver tumor, og den apoptotiske indeks for hvert felt blev beregnet som procentdelen af ​​TUNEL-positive celler i forhold til 100 tilfældigt udvalgte celler.

Western blot analyse

Den anden halvdel af hver tumor var snap-frosset i flydende nitrogen. Derefter blev det totale protein ekstraheret. PCNA blev påvist ved normal Western blotting med det samme anti-PCNA-antistof som det, der anvendes i immunhistokemisk eksperimentet. IRDye 800CW gede anti-kanin IgG (H + L) antistof (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) blev anvendt som det sekundære antistof. β-actin blev også påvist som en intern kontrol. Billeder blev opnået ved Odyssey (LI-COR, USA) og intensitet kvantificering af de Western blot båndene blev udført af ImageJ software (National Institutes of Health, USA).

Statistisk analyse

SPSS-version 16,0 til Windows blev anvendt til alle analyser. Kvantitative data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD); en sammenligning mellem to grupper blev udført af uafhængige-prøve t-test, mens flere prøver blev sammenlignet med envejs ANOVA, med α = 0,05 som et niveau til testen. Resultater blev betragtet som statistisk signifikante ved P 0,05.

Resultater Salg

Ekspression af NRP-1, ανβ3 og ανβ5 i den humane NSCLC-afledte cellelinje A549

Ekspressionen af ​​integriner er stort set begrænset til tumorer (herunder tumorvaskulaturen og celler), og andre steder af angiogenese eller vævsreparation [22, 27]. Neuropilin-1 er også overudtrykt i mange tumorer [22, 28]. Tumor-gennemtrængende evne iRGD afhænger hovedsagelig af molekylerne ανβ3, ανβ5 og NRP-1 overudtrykkes i cancerceller [18]. For at bekræfte ekspressionen af ​​disse molekyler i humane NSCLC-cellelinie A549, udførte vi en flowcytometrisk analyse. Som vist i fig 1A, de positive ekspressionshastigheder for avp3, αvβ5 og NRP-1 var 68,5%, 35,3% og 94,5%, henholdsvis. Dette resultat viste, at A549-cellelinien kan anvendes til at etablere en human NSCLC model til at undersøge virkningerne af co-administreret iRGD.

(A) Ekspression analyse af avp3, αvβ5 og NRP-1 i A549-celler ved flowcytometri. (B) Ekspression analyse af avp3, αvβ5 og NRP-1 i A549 xenotransplantater ved immunfluorescensfarvning. EG, forsøgsgruppe; CG, kontrolgruppe. Både avp3 og αvβ5 er plettet grøn. NRP-1 farves rødt. Kerner farves blå. Forstørrelse, × 400; Scale barer = 50 um.

For at bekræfte ekspressionen af ​​ανβ3, ανβ5 og NRP-1 i tumorvæv, udviklede vi en BALB /c nøgne mus xenograftmodel med den humane NSCLC cellelinje A549. Ekspressionen af ​​avp3, αvβ5, og NRP-1 blev yderligere påvist ved immunfluorescensfarvning. Som vist i figur 1B, avp3 (til venstre), αvβ5 (midten) og NRP-1 (til højre) blev overudtrykt i xenograft væv.

Tumor-penetration af Evans Blå co-administreret med iRGD

for at bekræfte in vivo-virkningen af ​​det tumor-penetrerende peptid iRGD blev Evans blåt farvestof anvendes som model lægemiddel at afgøre, om iRGD kan fremme optagelsen af ​​et lægemiddel i en tumor [18]. Evans Blue er en albumin-bindende farvestof, der kan trænge organer via blodet og farvestof organerne blå. Sammenlignet med kontrollerne, blev tumorer i Evans Blå + iRGD gruppe farvet en dybere blå, som var synlige for det blotte øje. Men den blå farve af de normale organer, herunder hjerte, lever, milt, lunge og nyre, var ikke indlysende (Fig 2A og 2B). For yderligere at bekræfte, at virkningen af ​​iRGD til specifikt fremme indførelsen af ​​Evans blåt farvestof i tumorvæv blev Evans Blå i tumorerne og organer ekstraheret og analyseret kvantitativt ved spektrofotometri. Resultaterne viste, at i almindelighed mængden af ​​Evans blåt i Evans blåt-gruppen og i Evans blåt + iRGD gruppe var højere end i PBS eller iRGD gruppe (figur 2C). Mængden af ​​Evans Blå i tumorerne fra Evans Blå + iRGD gruppe var 1,5 gange højere end i Evans blåt gruppen (fig 2C). Med hensyn til de andre organer, sås ingen synlig forskel mellem Evans Blå gruppen og Evans Blå + iRGD gruppe (figur 2C). Disse data viste, at iRGD har potentiale til specifikt at fremme udbredelsen af ​​narkotika og give dem mulighed for at trænge ind i tumor.

(A) De repræsentative billeder af Evans Blå akkumulering i normale organer og i tumorer i mus, der fik forskellige behandlinger. Den blå intensitet angiver mængden af ​​opsamlet Evans Blå. (B) Billeder af tumoren i (A). (C) Kvantificering af Evans Blå ekstraheret fra tumorer og organer i (A) ved OD600 måling. n = 3; Fejlsøjler, middelværdi ± SEM; ***

s

0,001.

Terapeutisk virkning af gemcitabin co-administreret med iRGD

For at bestemme den passende koncentration af gemcitabin til in vivo forsøg, fire doser Gemcitabin (80 mg /kg, 100 mg /kg, 120 mg /kg og 140 mg /kg) blev anvendt til at behandle fire gruppe mus to gange én uge til to uger, hhv. To uger senere musene på 80 mg /kg og 100 mg /kg grupper forekom normale. Men det var tydeligt, at musene på 120 mg /kg-gruppen manglede energi og oplevet et tab af appetit. Derudover musene på 140 mg /kg-gruppen havde diarré. For at reducere virkningen af ​​de bivirkninger, vi valgte dosis på 100 mg /kg for in vivo forsøg.

For at afgøre, om den terapeutiske effekt af gemcitabin vil blive styrket, når det gives i kombination med iRGD, Gemcitabin og iRGD blev co-indgives til behandling af mus med A549 xenotransplantater som beskrevet i metodeafsnittet. Som vist i fig 3A, de tumorer i Gemcitabin + iRGD gruppe voksede langsommere end for Gemcitabine gruppen, og denne forskel var statistisk signifikant. Denne observation blev også bekræftet ved en analyse af tumor vægt (Fig 3B). blev analyseret yderligere Vækstraten hæmning af tumorer. Den iRGD gruppe, Gemcitabin gruppen, og Gemcitabin + iRGD gruppen viste en tumor væksthæmning på 8%, 59,8% og 86,9%, hhv. Disse resultater viste, at iRGD kunne øge den terapeutiske effekt af gemcitabin for humane NSCLC xenografter når de blev co-administreres. Legemsvægten skift analyse af eksperimentelle mus viste, at kropsvægten af ​​musene i både Gemcitabin gruppen og Gemcitabin + iRGD gruppe faldt ca. 5% ved slutningen af ​​eksperimentet. Der blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant forskel mellem disse to grupper (Fig 3C). Disse resultater viste, at iRGD ikke åbenbart forværre bivirkninger af gemcitabin.

(A) tumorvolumen kurve under behandlingen. Pile angiver tidspunktet for injektionen. Den dag, hvor behandlingen startede blev registreret som dag 0. Tumorvolumen blev målt en gang hver tredje dag indtil dag 30. (B) Gennemsnitlig tumorvægt i hver gruppe ved afslutningen af ​​behandlingen. (C) Kropsvægten skift kurve af mus under eksperimentet. n = 6. Fejlsøjler, middelværdi ± SD; ns, ikke signifikant; ***

s

0,001.

Hæmningen af ​​celledeling efter behandling med co-administreret Gemcitabin og iRGD

Gemcitabin udøver en terapeutisk virkning mod kræft via hæmning af DNA-syntesen i kræftceller og afbrydelse af deres fremskridt fra G1 til S-fasen [3, 29, 30]. PCNA, en 36-kDa protein, der primært udtrykkes i S-fasen og tidlig G2-fasen af ​​cellens cyklus i prolifererende celler [31]. Derfor kan PCNA anvendes som en markør for celleproliferation. For yderligere at bekræfte funktionen af ​​iRGD i forøgelsen af ​​anti-tumor effekt af gemcitabin, blev ekspressionsniveauet for PCNA i tumorerne påvist ved immunohistokemisk farvning. Som vist i fig 4A, blev ekspressionsniveauet af PCNA signifikant reduceret hos mus, der blev behandlet med gemcitabin (med eller uden iRGD) sammenlignet med ekspressionsniveauet i mus, som modtog PBS eller iRGD; ekspressionsniveauet af PCNA var lavere i de mus, som blev behandlet med gemcitabin + iRGD sammenlignet med mus, der blev behandlet med gemcitabin alene. For kvantitativ analyse af figur 4A, blev udtrykket niveau PCNA i Gemcitabin + iRGD gruppe reduceres med ca. 71,5% i forhold til, at der i Gemcitabin gruppen, og denne forskel var statistisk signifikant (figur 4B). Desuden tumorvævet af gemcitabin + iRGD gruppen viste strukturelle anomalier i cancerpatienter reder og morfologiske ændringer i de fleste kerner. De morfologiske ændringer i kernerne vil blive beskrevet i detaljer senere i manuskriptet.

(A) Immunohistokemisk farvning analyse. PCNA-positive celler i snit farves brun. Kernerne farves blå. Repræsentative tal fra hver gruppe, er vist; n = 6; Forstørrelse, × 400; Scale barer = 50 um. (B) De tilsvarende kvantitative analyseresultater af PCNA er vist i (A). Fem felter fra hver tumor vævssnit blev udvalgt tilfældigt til beregning af IOD værdi af den positive regionen gennem IPP software, som indikerede mængden af ​​antigen ekspression. (C) Western blot analyse. Totalt protein fra tumorvæv blev ekstraheret. PCNA blev påvist med β-actin som en intern kontrol. n = 3. (D) De kvantitative analyseresultater af PCNA er vist i (D). Intensiteten af ​​hver strimmel blev analyseret ved ImageJ software. De gennemsnitlige intensiteter af PCNA blev standardiseret til p-actin. Fejlsøjler, middelværdi ± SD; ns, ikke signifikant; ***

s

. 0,001

For yderligere at bekræfte ekspressionsniveauet af PCNA, vi udvindes det totale protein fra tumorvæv i hver gruppe. Niveauerne af PCNA blev detekteret ved Western blotting med β-actin som en intern kontrol. Hver strimmel blev scannet, og en kvantitativ analyse blev udført med ImageJ software. Ekspressionsniveauet af PCNA i tumorvæv hos mus i Gemcitabin + iRGD gruppe var signifikant reduceret sammenlignet med den for mus i Gemcitabin gruppen (fig 4C og 4D).

Tilsammen udgør disse resultater bekræftede endvidere, at terapeutiske effekt af gemcitabin blev forstærket, da det blev administreret sammen med tumor-gennemtrængende peptid iRGD.

Induktion af apoptose ved co-administreret Gemcitabin og iRGD

det er vist, at Gemcitabin kan hæmme DNA-replikation og reparation, hvilket i sidste ende fører til celle apoptose [3]. For at bekræfte den forbedrede terapeutiske effekt af co-administreret gemcitabin og iRGD, blev påvist apoptotiske celler i behandlede xenotransplantater ved hjælp af en TUNEL assay. Som vist i fig 5A, mere apoptotiske celler var synlige i tumorer fra Gemcitabin + iRGD gruppen end i tumorer fra Gemcitabine gruppen. Den apoptotiske indeks blev defineret som procentdelen af ​​TUNEL-positive celler versus det totale antal celler. Ifølge den statistiske analyse er vist i figur 5B, satsen for apoptose af Gemcitabin + iRGD gruppen var 2,2 gang den for Gemcitabine gruppen. Disse resultater bekræftede endvidere, at iRGD forbedret den terapeutiske effektivitet af gemcitabin ved NSCLC xenotransplantater.

(A) apoptotiske celler i tumorvæv blev påvist ved en TUNEL assay. TUNEL-positive kerner farves brun, og TUNEL-negative kerner farves blå. De viste tal er repræsentative for de seks tumorer i hver gruppe. Pile angiver de apoptotiske legemer. Forstørrelse, × 400; Scale barer = 50 um. (B) Kvantitativ analyse af apoptose indeks i hver gruppe. Procentdelen af ​​TUNEL-positive celler blev talt fra 100 tilfældigt udvalgte tumorceller per sektion. Fem sektioner blev talt pr tumor. n = 6; Fejlsøjler, middelværdi ± SD; ***

s

0,001.

Diskussion

Denne undersøgelse havde til formål at revurdere brugen af ​​iRGD peptid, viste, at det forbedrede ophobning og terapeutiske virkning af lægemidler i NSCLC xenograft etableret med A549 celle linje, der viste høj ekspression af avp3, αvβ5 og NRP-1. Vores data viser, at iRGD var i stand til signifikant at øge det tumor-gennemtrængning af Evans blåt samt den terapeutiske virkning af gemcitabin i humane NSCLC xenotransplantat. Den yderligere evaluering viste, at spredning og apoptose af tumorceller i iRGD + Gemcitabin gruppen var mere markant hæmmet end i kontrolgrupper.

I 2009 Teesalu et al. først rapporteret C-ende-regel-peptid (iRGD), og viste, at peptidet har aktiviteten af ​​NRP-1-afhængig celle, vaskulær, og vævspenetration [32]. Efterfølgende rapporter viste, at iRGD kunne øge intratumoral udbredelse og antitumor effekt af doxorubicin [33-35], Paclitaxel [36, 37] og Endostatin [38] ved konjugering med disse lægemidler eller narkotika-loaded køretøjer i dyreforsøg. De andre rapporter viste, at iRGD også kunne øge intratumoral ophobning og antitumor effekt af paclitaxel, doxorubicin, Transtuzumab [24, 39], Cisplatin [40], ved co-administration med disse lægemidler. I 2014, Akashi etal. rapporterede, at Gemcitabin blev coadministrated med iRGD at behandle kræft i bugspytkirtlen i murine modeller [41]. Så vidt vi ved, denne undersøgelse først vist effekten af ​​co-administreret iRGD og gemcitabin i humane NSCLC xenograft etableret med A549-cellelinje.

Akashi rapport viste, at pancreas-cancer modeller overudtrykker NRP-1 er følsomme for iRGD co-administration. Behandling med Gemcitabin plus iRGD peptid resulterede i en betydelig reduktion tumor sammenlignet med Gemcitabin monoterapi i pancreas cancer modellerne med cellelinjer [41]. Vores resultater viste, at ανβ3, ανβ5 og NRP-1, som medierer det tumor-gennemtrængning aktivitet af iRGD blev overudtrykt i humane NSCLC-cellelinie A549 og xenograft etableret med denne cellelinie. Den terapeutiske effekt af gemcitabin blev væsentligt forbedret ved co-administreret iRGD i murine NSCLC kræft model. Tilsammen udgør disse studier bekræftede virkningerne af iRGD at forbedre intratumoral udbredelse og anticancer effekt i NRP-1-overeksprimeres kræftmodeller.

Gemcitabin er en nukleosidanalog udbredt som den første linje kemoterapi af fremskreden NSCLC [42 ]. Gridelli et al. rapporterede, at svarprocenten (RR) blandt 233 patienter fik Gemcitabin var 16%, mens den gennemsnitlige tid til progression og samlet overlevelse (OS) var 17 uger og 28 uger henholdsvis [43]. Den MILES-2G fase 2 studie med monoterapi Gemcitabin i avanceret NSCLC ældre patienter viste en 17,6% RR, en median tid til sygdomsprogression på 16,1 uger, og median OS på 41,3 uger [44]. Flere andre undersøgelser under anvendelse Gemcitabin alene viste samme aktivitet med RR og median PFS og OS spænder fra 16 til 38,5%, 3-5.4 og 6.6-7.7 måneder henholdsvis [45-48]. Derfor er den terapeutiske virkning af gemcitabin for NSCLC har plads til at blive yderligere forbedret. Vores resultater viste, at iRGD peptid forøger virkningen af ​​co-administreret Gemcitabin i NSCLC xenograft. Disse resultater viste den mulighed, at iRGD forbedrer virkningen af ​​gemcitabin i NSCLC-patienter.

Effektiviteten af ​​iRGD er kun mærkbar i anvendelse af cellelinie. Den kliniske anvendelse skal overvejes nøje. Den nuværende forståelse af den mekanisme, hvormed iRGD øger den terapeutiske effekt af gemcitabin for NSCLC er begrænset. Selvom der ikke tydelige bivirkninger blev observeret i vores undersøgelse, at sikkerheden af ​​denne kombinationsbehandling stadig behov yderligere vurdering. Den CendR motiv af iRGD kan også anvendes af vira og mikrobielle toksiner for at få adgang til cellerne og spredning inden vævene i kroppen [49, 50]. iRGD kan også fremme optagelsen af ​​gemcitabin i normalt væv, der er beskadiget, og vævet reparation, der følger kan forårsage yderligere skader på kroppen.

Konklusion

Sammenfattende gennem et menneske NSCLC A549 nøgne mus xenograft model, blev det bekræftet, at iRGD kan fremme hæmningen af ​​tumorcelleproliferation og induktion af apoptose ved gemcitabin og derfor øge den terapeutiske virkning af gemcitabin in vivo. Samtidig administration af gemcitabin og iRGD kan være en roman strategi at styrke den kliniske terapeutiske effekt af gemcitabin i NSCLC-patienter.