PLoS ONE: Serum-autoantistoffer i kronisk Prostata Inflammation i Prostata Cancer Patients

Abstrakt

Baggrund

Kronisk inflammation er ofte observeret på histologisk analyse af maligne og non-maligne prostata prøver. Det er en mistanke understøttende faktor for prostata sygdomme og deres progression og en hovedårsag til falske positive PSA test i kræftscreening. Vi antager, at betændelse inducerer autoantistoffer, som kan være nyttige biomarkører. Vi havde til formål at identificere og validere prostata betændelse i forbindelse serum autoantistoffer i prostata cancer patienter og evaluere udtryk for tilsvarende autoantigener.

Metoder

radikal prostatektomi eksemplarer af patienter med prostatacancer (N = 70) blev klassificeret i høje og lave inflammation grupper efter mængden af ​​væv infiltrerende lymfocytter. De tilsvarende pre-kirurgi blod serumprøver blev gennemgået for autoantistoffer ved hjælp af en low-density protein array. Udvalgte autoantigener blev identificeret i prostatavæv og deres ekspressionsmønster analyseret ved immunohistokemi og qPCR. Den identificerede autoantistof profil blev krydstjekket i en selvstændig prøve sæt (N = 63) ved hjælp af Luminex-perler proteinarray teknologi.

Resultater

Protein-array screening identificeret 165 autoantistoffer forskelligt rigeligt i serum af høj sammenlignet med lave betændelse patienter. Ekspressionsmønsteret for tre tilsvarende antigener blev etableret i benigne og cancer væv ved immunohistokemi og qPCR: SPAST genet (Spastin), STX18 (Syntaxin 18) og SPOP (speckle-typen POZ protein). Af disse blev SPAST genet signifikant forøget i prostatavæv med høj betændelse. Alle tre autoantigener blev udtrykkes forskelligt i primær og /eller kastrationsresistent prostata tumorer når de analyseres i en inflammation-uafhængig væv microarray. Cross-validering af betændelse autoantistof profil på en uafhængig prøvesæt ved hjælp af et Luminex-perle protein array, hentet 51 af de markant diskriminere autoantistoffer. Tre autoantistoffer var signifikant opreguleret i begge skærme, MUT, RAB11B og CSRP2 (p 0,05)., To, SPOP og ZNF671, tæt på statistisk signifikans (p = 0,051 og 0,076)

Konklusioner

Vi leverer dokumentation for en betændelse-specifikke autoantistoffer profil og bekræft udtryk for tilsvarende autoantigener i prostata væv. Dette understøtter evaluering af autoantistoffer som ikke-invasive markører for prostatabetændelse

Henvisning:. Schlick B, Massoner P, Lueking A, Charoentong P, Blattner M, Schaefer G, et al. (2016) Serum-autoantistoffer i kronisk prostata Inflammation i Prostata kræftpatienter. PLoS ONE 11 (2): e0147739. doi: 10,1371 /journal.pone.0147739

Redaktør: Aamir Ahmed, Kings College London, England

Modtaget: Juli 28, 2015; Accepteret: 7 januar 2016; Publiceret: 10. februar, 2016

Copyright: © 2016 Schlick et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er tilgængelige i avisen og dens støtte Information filer

Finansiering:. undersøgelsen blev støttet af COMET K1 center Oncotyrol-center for Personlig Medicin, finansieret af Promotion Agency den østrigske Research (FFG) og Future Foundation of Country Tyrol, og Protagen AG. ONCOTYROL GmbH, Protagen AG og TARGOS Molekylær Patologi GmbH ydet støtte i form af løn til forfattere [BS, PM, GS], [AL, KM, CT, PA, SM, PSK], [DZ, MK], men havde ikke yderligere rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Alle andre Forfatterne erklærer nogen konkurrerende interesse. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser:. Undersøgelsen blev støttet af COMET K1 center Oncotyrol-Center for Personlig Medicin, finansieret af Promotion Agency den østrigske Research (FFG) og fremtiden Foundation i det land, Tyrol, og Protagen AG. Petra Massoner, Georg Schaefer og Bettina Schlilck var ansat i ONCOTYROL. Angelika Lueking, Klaus Marquart, Carmen Theek, Peter Amersdorfer, Stefan Müllner og Peter Schulz-Knappe var ansat af Protagen AG. Stefan Müllner er medstifter og CEO for Protagen AG. Dirk Zielinski og Matthias Kirchner var ansat i TARGOS Molekylær Patologi GmbH. Petra Massoner øjeblikket tilknyttet som et DAAD fyr med Roche Diagnostics GmbH dog hendes data, der indgår i undersøgelsen blev genereret før dette tilhørsforhold, studie præsenteret heri er uafhængig af fællesskabet eller andet arbejde i forbindelse med Roche Diagnostics GmbH. Protagen AG har patent på “Marker Sekvenser for Diagnosticering prostatakræft, og anvendelsen deraf”. Der er ingen varer i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

prostata er et site for hyppig godartet og ondartet sygdom med alderen som den vigtigste risikofaktor [1, 2]. Som en ulempe ved den konstant stigende levealder forekomsten af ​​prostata sygdomme, såsom prostatacancer, prostatahyperplasi (BPH) og prostatitis stiger så godt, og disse sygdomme udgør en voksende medicinsk og socialt problem, men også en stigende økonomisk byrde [3- 6]. Ofte, histopatologisk analyse af prostata biopsier og kirurgiske prøver afslører inflammation i forbindelse med prostata sygdom, i de fleste tilfælde en asymptomatisk, “kronisk” betændelse kendetegnet ved histologiske forandringer og immune celleinfiltrater [7-10]. Kronisk betændelse kan være en af ​​drivkræfterne for prostata sygdomsprogression og en væsentlig medvirkende faktor til specifikt antigen (PSA) prostatakræft test falsk-positive prostata [11-15].

Kilden til intraprostatisk inflammation er endnu ikke fuldt afdækket, infektion, autoimmunitet, celle skade, hormonelle udsving, eller kostfaktorer kan bidrage. Så meget som årsag til prostatitis er tilbage en udfordring for yderligere undersøgelser, dets relevans for patologiske processer er uklar [16]. Undersøgelser tyder et bidrag på kronisk inflammation på carcinogenese og udvikling af prostata sygdomme [17, 18]. Især proliferativ inflammatorisk atrofi (PIA), som betragtes en prostatakræft precursor læsion, er forbundet med inflammatoriske immuncellepopulationer infiltrater, som stimulerer proliferation, understøtter carcinogenese via forbedret oxidativ stress og celleskader og pioneer malign degeneration [19]. Selvom de fleste undersøgelser rettet indvirkning inflammation på carcinogenese og tumorprogression, er dette fænomen ikke begrænset til cancer, er immune celleinfiltrater også fundet hyppigt i hyperplastisk eller endda i histologisk normale prostatavæv [17].

I lyset af behovet for at fortsætte bestræbelserne præciserer konsekvenserne af betændelse på prostata sygdom, ville lettilgængelige biomarkører for prostata betændelse være en stor hjælp. Desuden er sådanne markører, der tillader en mindre invasiv måde til diagnose, prognose og behandling overvågning af kronisk prostatitis af forbedring patientpleje, øge specificiteten af ​​PSA test for detektion af prostatacancer og føre til en forbedring af prostatacancer forvaltning. I denne sammenhæng autoantistoffer er vigtige typer af markørmolekyler, som de er knyttet til aktiviteten af ​​immunsystemet. Antistoffer har ideelle egenskaber som potentielle markører, de er meget stabile og ikke undergår kortvarige variationer i koncentration, de er let tilgængelige via serum eller plasma prøver og i alle klinisk laboratorium er der meget følsomme detektionsmetoder til rådighed for deres kvantificering. For kræftpatienter blev det overbevisende demonstreret, at et anti-tumor-immunrespons kan udløses [20, 21]. Autoantistoffer mod kræft antigener er blevet identificeret hos patienter med forskellige solide tumorer enheder såsom for eksempel tumorer i brystet [22, 23], hoved og hals [24, 25], lunge [26, 27], spiserør [28], colon [29] og prostata [26, 30, 31].

for nylig, anvendte vi protein microarrays for autoantistof profilering i blodet hos prostatacancerpatienter og ikke-cancer kontroller. Vi identificerede et panel af prostata cancer associeret autoantistoffer [31]. Udvidelse disse undersøgelser, vi her præsentere identifikation og validering af autoantistoffer i forbindelse med prostata immun celle infiltrater i patienter med prostatacancer. Derudover har vi vurderet udtrykket mønster af tilsvarende autoantigener i maligne og non-maligne prostata væv og spurgte, om mutationer kan udløse autoantistoffer.

Materiale og metoder

Retrospektiv prøve kohorte

Serumprøver blev opnået fra prostatakræft Bioressource af Institut of Urology, Innsbruck Medical University. Blodprøverne blev opsamlet inden for rammerne af den tyrolske prostatacancer tidlig påvisning program og blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse [32]. Informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i det medicinske universitet i Innsbruck (Study AM 3174, ændringsforslag 2). Alle prøver blev opnået forud for radikal prostatektomi kirurgi fra patienter med biopsi-verificeret, klinisk lokaliseret prostatacancer, som var mindst 40 år, og som havde modtaget nogen tidligere prostata-cancer terapi. Patient valg for lave og høje sager inflammation var baseret på en analyse af hele prostata kirtel prøver til infiltrerende lymfocytter. En kohorte af 70 patienter (38 høj, 32 lav infiltration) for screeningsundersøgelsen og 63 patienter (33 høj, 30 lav infiltration) til cross-validering studie blev rekrutteret.

autoantistof profilering

De anvendte assays for autoantigen profilering, en lav-densitet-protein array og en Luminex-bead proteinarray fik henholdsvis etableret som bredt anvendelige teknikker og ikke specifikt for kun prostatakræft. Ud fra følgende betragtninger Proteinarray teknik blev anvendt til den indledende screening undersøgelsen blev senere etablerede Luminex-perle teknik, der anvendes til en uafhængig krydsvalidering undersøgelse.

Valg af inkluderet autoantigene proteiner var baseret på vores tidligere autoantistoffer skærme i prostata kræft [31] og autoimmune sygdomme [33-35], og om offentliggjorte autoantigener fundet i forbindelse med kræft [36-42]. Desuden blev protein produktion effektivitet, protein kvalitet, og assay resultatkriterier anses for den endelige udvælgelse af autoantigene proteiner. 4012 proteiner blev udvalgt til protein array, 3061 proteiner til Luminex-bead proteinarray. Autoantigen paneler er opført i Støtte Information (S1 tabel). Perlen proteinanalyse blev inddelt i 8 subarrays som det maksimale tilgængelige antal individuelt farve-kodede LuminexMagPlex

TM perler (Luminex, MV’s-Hertogenbosch, Holland) er 500. Luminex-perle autoantistoffer assay blev oprettet for en bred anvendelse, uafhængigt af de indledende prostata lav /høj inflammation screening resultater og derfor ikke præcist matcher den indledende autoantigen panel. Baseret på det tilsvarende gen ID’er, blev 84% af autoantigenet proteinerne af Luminex-bead assay også repræsenteret i proteinet microarray.

autoantigen proteiner blev udtrykt i

E

.

coli

og rekombinante proteiner blev oprenset under anvendelse af en procedure affinitetsoprensning His-mærke. Generering af plane protein microarrays blev udført som tidligere [31] beskrevne. Kort fortalt blev proteiner spottet i firdobbelte på nitrocellulose-belagt FAST slides (GE Healthcare). Muse og humane IgG’er ved forskellige koncentrationer blev tilsat til anvendelse som immun påvisningsmetoder kontroller og for data normalisering. En automatiseret station (HS 4800 Pro, Tecan) blev anvendt til at udføre microarray autoantistof analyse. Array objektglas blev blokeret med 2% (vægt /volumen) bovin serum (BSA) i TBS indeholdende 0,1% (v /v) Tween 20 (TBST) og blod serumprøver blev tilsat i en 1: 100 fortynding i 2% (vægt /v) BSA /TBST. Efter inkubation ved stuetemperatur i 16 timer sekundære (muse-anti-humant-IgG, 1: 5000, Sigma) og tertiær (Cy3-mærket æsel-anti-muse IgG, 1: 500, Jackson ImmunoResearch) blev antistof-inkubationstrin udføres i 2% (vægt /volumen) BSA /TBST ved stuetemperatur i 1 time. Efter hver inkubation blev objektglassene vasket 3 gange med TBST. Forarbejdede proteinarrays blev scannet på en konfokal microarray-læser (ScanArray 4000, Perkin Elmer Life Science) og analyseres ved hjælp af GenePix Pro 6.0 microarray billedanalyse software (Molecular Devices).

Luminex-perle teknik til autoantigen profilering var godtgjort, fordi den har flere fordele i forhold til det oprindeligt anvendte Proteinarray teknik såsom højere dynamikområde, lavere variationskoefficienter, forøget stabilitet på grund af kovalent binding af proteiner og bedre ydeevne i high-throughput analyse. For perlen autoantigen arrayet 3061 autoantigener blev udvalgt. His-mærke affinitetsoprensede rekombinante proteiner blev kovalent koblet til magnetiske carboxyleret farvekodede MagPlex

TM mikrokugleblærer efter producentens protokol (Luminex). For hver enkelt koblingsreaktion op til 12,5 ug antigen og 8,8 x 10

5 individuelt kodede perler blev anvendt. Koblingen effektivitet og perle stabilitet blev overvåget. En perle undergruppering bestod af op til 384 forskellige antigen-coatede perler og otte kontrolperler. På grund af det samlede antal antigener, blev otte forskellige subarrays etableret og anvendt til analyserne. Protein-coatede perler blev fordelt i 96-brønds mikrotiterplader og inkuberet med fortyndet (1: 100) serumprøver i 22 timer ved 4 ° C. På hver analyse plade blev tre referencesera målt tjener som kvalitetskontrol. Ubundne antistoffer blev fjernet ved vask. Bundne humane antistoffer blev kvantificeret ved probing med phytoerythrin (PE) -mærket anti-humant detektionsantistof (gede-anti-human-PE, Jackson /Dianova) efterfulgt af flere vaskecyklusser og måling af det fluorescerende signal på en FlexMap3D indretning (Luminex) (DD gate 7,500 til 15,000; stikprøvestørrelse: 80 pi, 1000 hændelser pr perle regionen; timeout 60 sek)..

data forbehandling og biostatistiske analyse

Plane proteinarrays

efter median baggrund subtraktion, blev den mediane fluorescensintensitet af 4 replikater spots beregnet for hver autoantigen og normaliseret til plettede IgG kontrol. Cut-offs blev bestemt individuelt for hver autoantigen og beregnet som den gennemsnitlige signal intensitet af den lave betændelse kontrol kohorte plus 3 standardafvigelser. Høj betændelse kohorte prøver med værdier over cut-off blev klassificeret som positive, og alle antigener blev sorteret efter faldende antal positive prøver. N-gange forøgelse eller reduktion af en specifik autoantistof blev bestemt på grundlag af den normaliserede middelværdi signalintensitet i høj sammenlignet med den lave inflammation kohorte. Ranking af top kandidat markører var baseret på fold-ændring og korrigeret p-værdien.

Bead proteinarrays.

Den målte mediane perle fluorescensintensitet for hver autoantigen blev anvendt til yderligere beregninger. I sjældne tilfælde, hvor mindre end 10 perler blev hentet til måling blev denne værdi sat til mangler. Disse værdier blev erstattet af medianværdien af ​​denne autoantigen målt i alle prøver. Autoantigener med mere end 20% manglende værdier blev udelukket fra yderligere analyse. Efter log2 transformation fraktil normalisering [43, 44] blev brugt til at normalisere prøver på hver enkelt plade.

Klassificeringen af ​​de fem bedste resultater autoantistoffer identificeret med perlen vifte teknik til differentiering af de lave og de høje betændelse kohorter var baseret på en logistisk regressionsmodel med gruppen variabel (høj /lav inflammation) som den afhængige variabel og de gennemsnitlige fluorescens værdier af autoantistofferne som de påvirkende faktorer. P-værdier for enlige påvirkende faktorer blev bestemt på grundlag af Wald test, og derudover parameterestimater, og de respektive 95% konfidensintervaller (CI) tosidet blev beregnet. Odds ratio (OR) blev givet sammen med de respektive 95% konfidensintervaller tosidede. Klassificeringen præstation blev vurderet på grundlag af de følsomhed, specificitet og AUC-værdier, der blev opnået med denne model [43, 45]

Funktionel annotation og sti analyse

Efter kortlægning af de øverste 165 autoantistoffer testet positiv med proteinet mikroarray til gener, blev et sæt af 136 gener opnået og anvendt til gen-ontologi analyse. Funktionel annotation klyngedannelse blev udført ved hjælp af DAVID-databasen (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [46, 47].

Tissue Microarray (TMA) og immunhistokemi

Til konstruktionen af et væv microarray (Inflammation-TMA) fikseret i formalin og paraffin indlejret humane vævsprøver (n = 70) udviser høje eller lave mængder væv infiltrerende lymfocytter blev valgt fra autoantistof screening kohorte. Kliniske og patologiske egenskaber er opsummeret i tabel 1 i kolonnen “Screening og barn”. Brugen af ​​arkiverede prøver stammer fra radikal prostatektomi prøver taget på University Hospital Innsbruck blev godkendt af den etiske komité for Medicinsk Innsbruck Universitet. For hvert tilfælde tre kræft væv kerner og tre godartede kerner med en diameter på 0,6 mm blev udstanset af donor væv og overføres til modtageren TMA blok [48]. TMA blev samlet ved hjælp af en manuel væv arrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI). Basal cellemarkør P63 og tumorcellemarkøren α-methylacyl-CoA racemase (AMACR) farvninger anvendes til at styre histologisk diagnose og SPAST genet, STX18 eller SPOP farvninger henholdsvis blev udført på en Discovery-XT-farvning indretning (Ventana, Tucson, AZ) Instrumentvariabel standardprotokoller. Target antistoffer, leverandører, varenumre, og anvendte koncentrationer var som følger: anti-SPAST genet, Atlas Antistoffer (Stockholm, Sverige), # HPA017311, 01:50; anti-STX18, Atlas-antistoffer, # HPA003019, 1: 150; anti-SPOP, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), # SAB1406659, 01:50; anti-P63, Sigma-Aldrich, # P3362, 1: 200; anti-AMACR, Dako (Wien, Østrig), # M3616, 1: 200, anti-CD45, Dako, # M0701, 1:. 300

Evaluering af immunhistokemiske farvning intensiteter blev overvåget af en erfaren uropathologist (GS). Billeder er erhvervet ved hjælp af en Axio Imager Z2 mikroskop (Zeiss) og TissueFAXS software (TissueGnostics). Kvantitativ immunhistokemisk analyse blev udført under anvendelse af HistoQuest immunhistokemi analyse software (TissueGnostics). For hver TMA spotte den gennemsnitlige intensitet og procentdelen af ​​positivt farvede celler blev evalueret, og en score blev beregnet ved at gange de to værdier for hver TMA kerne. Mean score-værdier blev beregnet ud fra tre cancer og tre godartede væv kerner af hver patient. Mann Whitney U test blev anvendt til analyse af forskelle mellem de to grupper.

En anden TMA (Targos-TMA), som omfatter 111 vævsprøver fra histologisk normal prostata (BE), benign prostatahyperplasi (BPH), prostata carcinom (CA) samt klinisk diagnosticeret kastrering ildfaste tumorer (CRPC), blev konstrueret og farvet som beskrevet ovenfor. Brugen af ​​disse vævsprøver stammer fra radikal prostatektomi kirurgi på hospitalet Kassel blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelser. Farvninger blev evalueret af en uafhængig patolog (M. K.), ved hjælp af en semikvantitativ pointsystem (H-Score), som kombinerer fire intensitet kategorier med den anslåede procentdel af farvede celler [49]. Mann Whitney U test blev anvendt til analyse af forskelle mellem grupperne.

RNA isolering og qPCR

Total RNA blev ekstraheret fra benigne og maligne områder af frosne vævssnit fra begge patientgrupper (høj /lav inflammation, n = 66) under anvendelse af AllPrep DNA /RNA Micro Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Tyskland). RNA-koncentrationer og renhed blev bestemt spektrofotometrisk. Revers transkription (RT) blev udført på 500 ng af total RNA under anvendelse iScript vælge cDNA syntesekit (Bio-Rad, Hercules CA, USA) og tilfældige hexamere primere (Promega, Madison WI, USA). QPCR (40 cykler) blev udført i triplikater under anvendelse 8NG total RNA ækvivalenter cDNA for hver 10 pi reaktion. Følgende Taqman assays (Applied Biosystems, Foster CityCA, USA) blev anvendt: PTPRC, Hs04189704_m1; STX18, Hs01099207_m1; SPOP, Hs00737433_m1; SPAST genet, Hs00208952_m1; TBP, Hs00427620_m1. Target genekspression blev normaliseret til husholdning gen TBP. Den relative ekspression ratio (R) blev beregnet på grundlag af Taqman assay effektiviteten af ​​målgenet og reference-genet og tærskelcyklen (Ct) afvigelse af hver prøve med en kontrolprøve (kalibrator, cDNA blanding af 3 godartede og 3 maligne vævssnit, 20 ng qPCR indgang) ved hjælp af følgende formel:. R = [E

target ^ ACt (kalibrator-prøve)] /[E

henvisning ^ ACt (kalibrator-prøve)] [50]

Søg for SPOP mutationer

Fifty-tre cDNA prøver stammer fra RNA isolering af høj /lav betændelse vævsprøver beskrevet i det foregående afsnit blev brugt til mutation skærmen SPOP. En primer par (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Tyskland) flankerer regionen tilbagevendende SPOP mutationer er designet ved hjælp af den open source-software Primer 3: Fwd, 5′-AAGGGTTCCAAGTCCTCCAC-3 ‘; Rev, 5’-CGGCACTCAGGAACCTTTAC-3 ‘[51]. PCR-amplifikation blev udført på 100 ng af total RNA ækvivalent med Taq DNA Polymerase (Peqlab, Erlangen, D) i alt 100 pi under anvendelse af følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 2 min; 40 cykler ved 95 ° C i 1 min, 62 ° C i 30 sek og 72 ° C i 1 min; forlængelse ved 72 ° C i 7 min. PCR-produkt mængde og størrelse blev kontrolleret på 1,2% agarose Flash Gels (Lonza, Rockland, USA). DNA blev oprenset under anvendelse af Qiagen PCR ekstraktionskit og sekventeret under anvendelse af de samme primere ifølge en standard Sanger sekventering protokol (Mycrosynth, Balgach, CH).

Da hyppigheden af ​​detekterede SPOP mutationer var signifikant lavere end den rapporterede i litteraturen [51], blev resultaterne bekræftet af den oprindeligt beskrevet af Blattner et al. [52], blev DNA isoleret fra benigne og maligne områder af frosne vævssnit under anvendelse af AllPrep DNA /RNA Micro Kit. Efter en indledende præ-PCR-amplifikation skridt for at berige målregioner blev en høj opløsning smeltende analyse (HRM) udføres. Dette assay er målrettet exon 6 og 7 i SPOP gen, der indeholder alle tidligere afslørede mutationer i prostatacancer (aminosyrer 80 til 106 og aminosyrer 120 til 140). Prøven, der viste en bemærkelsesværdig ændring i den smeltende kurve blev sendt ud for Sanger sekventering for at bekræfte og yderligere specificere sin ændring.

Resultater

Serum autoantistofniveauer er forhøjet i patienter med prostatacancer med immun celle infiltration af prostata

i et forsøg på at identificere prostata kronisk inflammation associeret autoantistoffer, blev prostatacancer udviser en lav eller en høj antal infiltrerende immunceller i deres radikal prostatektomi prøver underkastet analyse. For at identificere høje og lave inflammation patientkohorter, tog vi fordel af antallet af infiltrerende immunceller hele prostata. For hver patient tyve til tredive væv slides repræsenterer forskellige områder af prostata blev farvet for pan leukocytmarkør CD45 at definere tumorinfiltrerende lymfocytter. En erfaren uropathologist foretaget klassificeringen i to grupper (høj /lav inflammation) i henhold til en histopatologisk system til kronisk prostata betændelse [53] klassificering. Patientprøver med ingen eller mild inflammation blev angivet som “lav inflammation gruppe” og dem med moderat og høj inflammation som “high betændelse gruppe”. Kliniske parametre, herunder alder, betændelse markør C-reaktivt protein (CRP), Gleason score, prostata volumen, PSA og frit PSA var ligeligt fordelt mellem den høje og den lave betændelse grupperne (tabel 1, S1 Fig).

de serum autoantistof profiler af 38 høje inflammation og 32 lav inflammation (kontrol) patienter blev opnået for tilsvarende præoperativ blod serumprøver anvendelse af en 4012 rekombinant protein-array (fig 1A). Udvælgelse af antigenet testplade var baseret på egne og rapporterede data om autoantigener associeret med prostatacancer, andre former for cancer og inflammation sygdomme såsom dissemineret sklerose eller lupus erythematosus, henholdsvis [31, 36-42] (S1 tabel). blev påvist autoantistoffer for 3919 autoantigener i mindst én af patienterne og antallet af patienter testet positive for autoantistoffer svarende til en individuel autoantigen mellem 0 og 69 70 (S1 tabel). I betragtning af antallet af positive prøver i begge grupper genereret en liste over 15 autoantistoffer mest forskelligt stede i høj sammenlignet med den lave inflammation gruppen (fig 1B). De top-rangerede autoantistoffer mod spastin (SPAST genet, giI40806168) og pletter typen POZ protein (SPOP, giI56117827) var til stede i 37% og 42% af sera stammer fra høje betændelse patienter mens påvises i mindre end 3% og 10% af sera fra lave patienter betændelse kontrol. Evaluering af fold-ændring for hver af de 997 autoantistoffer i høj sammenlignet med den lave kontrol inflammation gruppe, afslørede signifikant øget forekomst (p 0,05) af 165 autoantistoffer på åbent inflammation patienternes kohorte (figur 1C, S2 tabel). Ingen af ​​dem var udelukkende bestemmes inden den høje betændelse gruppen. Interessant, intensiteten på kun én autoantistof (bindende antigen FEZF2, giI157388917) var signifikant nedsat (log2-foldchange: -2,66, p-værdi: 0,002). I højt i forhold til den lave betændelse kontrolgruppen

et rutediagram over den anvendte strategi til påvisning og krydsvalidering af autoantistof (AAB) underskrifter forbundet med kronisk prostata inflammation. Radikal prostatektomi prøver blev klassificeret i to (høj /lav inflammation) grupper baseret på omfanget af immuncellepopulationer infiltrationer i hele prostata. De tilsvarende præ-kirurgi blod serumprøver blev analyseret for autoantistoffer (AAB) med en plan proteinarray (screening, n = 70). En krydsvalidering undersøgelse teste robustheden af ​​den identificerede AAB panel blev baseret på Luminex-bead Proteinarray teknologi (krydsvalidering, n = 63). Statistisk sammenligning af serum autoantistof profiler i de lave og høje betændelse grupper blev brugt til at identificere og validere forskelligt rigelige aABS. De prostata væv ekspressionsmønstre og udtrykket i forskellige prostatakræft progression stadier blev etableret for tre udvalgte tilsvarende autoantigener (AAGs). B Bar diagram for positivt klassificerede observationer af de 15 mest forskelligt detekteret autoantistoffer i høj betændelse sammenlignet med den lave betændelse gruppen. Data er udtrykt som procent af det samlede antal af positive prøver i hver gruppe. C Beregning af folden ændring for hver autoantistof afslørede en betydelig stigning på 165 antigener i høj betændelse prostatakræft (øverste højre panel, p 0,05, fold forandring 2, Mann-Whitney test) og et fald på kun én (øverste venstre panel ). D Grafisk fremstilling af de ti bedste rangerede funktionelle klynger tildelt for inflammation forbundet autoantistoffer ved hjælp af DAVID funktionelle annotation værktøj. Baren størrelse svarer til den procentdel af identificerede tilsvarende gener relateret til en bestemt funktionel kategori (P 0,05).

Vi spekulerede på, om de 165 autoantistoffer væsentligt forstærket af kronisk inflammation er forbundet med forskellige funktionelle klynger og derfor kortlagt dem til deres tilsvarende gener til at udføre en funktionel annotation clustering hjælp af DAVID database. Adskillige berigede molekylære funktioner og biologiske processer blev identificeret. Af de ti bedste annotation udtrykkene “protein lokalisering” dannede den største klynge indeholder 14 associerede gener, der koder for proteiner involveret i vesikulær handel (GDI1, MYH9), endo- (cdc42) og exocytose (STX18), kromatin binding (CHMP5) og cytotoksisk T -celle aktivering (CTLA) .Den klynge “makromolekylært kompleks underenhed organisation” er sammensat af gener, der er nødvendige for DNA-reparation (SF3B3), proteinsyntese (EIF2A), T-celle-proliferation (FADD), og mikrotubulus demontering (STMN1, SPAST genet). Samlet, vi observeret, at autoantistoffer overrepræsenterede i høje inflammation patienter hovedsagelig var rettet mod strukturelle antigener og celleproliferation associerede proteiner (Fig 1D, tabel 2).

antigener af serumafledte autoantistoffer udtrykkes i prostata

for at belyse, om antigener identificerede autoantistoffer udtrykkes og muligvis dysreguleret i prostata væv, undersøgte vi udtrykket mønster af distinkte målproteiner. For at tre kandidatlande antigener, Spastin (SPAST genet), pletter typen POZ protein (SPOP), og syntaxin 18 (STX18), blev udvalgt efter følgende kriterier: (i) autoantistoffer er blandt toppen differentielt rigelige inflammationsassocierede dem i henhold til p-værdier og fold ændring (S2 tabel); (Ii) antistoffer for IHC er kommercielt tilgængelige og de tilsvarende antigen niveauer er tilstrækkelige til immunhistologisk påvisning ifølge det humane protein Atlas (www.proteinatlas.org); (Iii) foreninger med forskellige typer cancer var blevet rapporteret (tabel 3). En væv microarray herunder vævsprøver af høj og lav inflammation patienter af autoantistoffet skærmen blev genereret og anvendt til immunhistokemisk påvisning af disse autoantigene proteiner.

SPAST genet, SPOP og STX18 blev fundet udtrykt i epitelet af godartet og kræft områder i begge patientkohorter. Kvantificering af Immunofarvning intensiteter afslørede en signifikant øget SPAST genet ekspression i den høje inflammation sammenlignet med lave inflammation prostata vævsprøver. Men SPOP og STX18 immunoreaktiviteter var uændret mellem høje og lave betændelse patientprøver (Fig 2A).

En Immunohistokemiske farvninger af repræsentative væv microarray pletter fra høje og lave betændelse patientkohorter. SPAST genet, STX18 og SPOP udtrykkes i epitelet af godartede (BE) og cancer (CA) områder i begge kohorter. Kvantitativ analyse blev udført ved anvendelse af HistoQuest immunhistokemi analyse software (TissueGnostics). En score blev beregnet ved at multiplicere farvningsintensitet og procentdelen af ​​positivt farvede celler. n = 25 pr gruppe. * P 0,05, Mann-Whitney-test. Bar, 100 um.