PLoS ONE: Fucoidan fra Tang blæretang Forhindrer Migration og Invasion of Human Lung Cancer Cell via PI3K-Akt-mTOR Pathways

Abstrakt

Baggrund

For nylig har der været en øget interesse for farmakologisk aktive naturlige produkter, der er forbundet med retsmidler af forskellige former for sygdomme, herunder kræft. Fucoidan er et polysaccharid afledt af brunalger og har længe været anvendt som ingrediens i nogle kosttilskud produkter. Selvom fucoidan har været kendt for at have anti-cancer-aktivitet, har anti-metastatiske virkninger og dens detaljerede mekanisme af aktioner blevet dårligt forstået. Derfor målene med denne undersøgelse var at demonstrere de anti-metastatiske funktioner fucoidan og dets virkningsmekanisme bruger A549, en højt metastatisk human lungecancer cellelinje.

Metoder og vigtigste resultater

fucoidan inhiberer væksten af ​​A549-celler i en koncentration på 400 pg /ml. Fucoidan behandling af ikke-toksisk dosis (0-200 pg /ml) udviser en koncentrationsafhængig hæmmende virkning på invasion og migration af cancercellen via faldende dens MMP-2-aktivitet. At kende mekanismen af ​​disse inhiberende virkninger, blev Western blotting udført. Fucoidan behandling nedregulerer ekstracellulært signal-relateret kinase 1 og 2 (ERK1 /2) og phosphoinositid 3-kinase (PI3K) -Akt pattedyr mål for rapamycin (PI3K-Akt-mTOR) veje. Desuden fucoidan nedsætter cytosoliske og nukleare niveauer af Nuclear Factor-kappa B (p65).

Konklusioner /Betydning

Den foreliggende undersøgelse tyder på, at fucoidan udviser anti-metastatisk effekt på A549 lunge kræftceller via nedregulering af ERK1 /2 og Akt-mTOR samt NF-kB signalveje. Derfor kan fucoidan betragtes som en potentiel terapeutisk reagens mod metastase af invasive humane lungecancerceller

Henvisning:. Lee H, Kim JS, Kim E (2012) Fucoidan fra tang

blæretang

Forhindrer Migration og invasion of human Lung Cancer Cell via PI3K-Akt-mTOR Pathways. PLoS ONE 7 (11): e50624. doi: 10,1371 /journal.pone.0050624

Redaktør: Renping Zhou, Rutgers University, USA

Modtaget: 30 august, 2012; Accepteret: 23. oktober 2012; Udgivet: November 30, 2012 |

Copyright: © 2012 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastase er en førende årsag (op til 90%. ) af kræft-relaterede dødsfald. Udviklingen af ​​cancer metastaser består af flere processer, hvor kræftceller først løsnes fra den primære tumor, invadere omgivende væv og intravasate i blod og /eller lymfesystemet og ekstravasatet fra karsystemet og efterfølgende bosætte og kolonisere på målorganer. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) spiller en central rolle i tumormetastase, hvor MMP’er nedbryder ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, såsom collagen, proteoglycan, elastin, laminin, og fibronectin [1], [2]. Blandt disse er MMP-2 (gelatinase A) og MMP-9 (gelatinase B) udtrykt i overflod i forskellige maligne cancere og nedbryde type IV collagen, som er en væsentlig bestanddel af basalmembranen. Generelt MMP-2 er overudtrykt konstitutivt i stærkt metastatiske cancere, hvorimod MMP-9 induceres af nogle stimulerende faktorer såsom inflammatoriske cytokiner, epidermal vækstfaktor og phorbol-12-myristat-13-acetat [3]. Derfor kan MMP-2 spille en vigtigere rolle i migration på kræftceller og invasion.

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden og en førende årsag til kræft død, tegner sig for mere end en million dødsfald årligt på verdensplan [4]. Især er det en meget aggressiv og metastatisk tumor sandsynligvis grundet secernerende højere niveauer af MMP’er sammenligner med andre kræftformer. Derfor viser inhiberingen af ​​MMP-2 i cancerceller som et interessant terapeutisk mål af meget metastatiske lunge- cancerceller. MMP’er ekspression reguleres af transkriptionsfaktorer (AP-1 og NF-kB) gennem upstream pathways herunder mitogenaktiveret kinaser (MAPK’er) og PI3K-Akt pathways [5]. MAPK’er består af tre kinaser, herunder ekstracellulære signal-relateret kinase 1 og 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal kinase /stress aktiveret protein kinase (JNK /SAPK), og p38. MAPK’er er impliceret i en række cellulære funktioner, såsom proliferation, migration og invasion [3]. Aktivering af PI3K kan stimulere sin nedstrøms mål, Akt, og derefter regulere cellevækst, vedhæftning, og invasion [6].

Der har været adskillige rapporter undersøger kræft kemoforebyggende eller terapeutiske midler fra naturlige produkter. Mange arter af marine alger har længe været anvendt i fødevarer kost og også dokumenteret som værende anvendt i traditionel orientalsk medicin i over 1000 år [7], [8]. De indeholder forskellige funktionelle bestanddele, såsom porphyran, gepsin, alginsyre, og oligosaccharid. Fucoidan, hvis molekylvægt gennemsnit er omkring 20.000, er en sulfateret polysaccharid udvundet af brun havalger og består af L-fucose og sulfat estergrupper. Det er tidligere blevet foreslået, at fucoidan har forskellige biologiske aktiviteter, såsom antibakteriel [9], antioxidant [10], anti-inflammatorisk [11], antikoagulerende [12], og antitumoraktiviteter [2]. I C57BL /6-mus transplanteret med Lewis lungeadenokarcinom celler, fucoidan fra

Fucus evanescens

produceret moderat antitumoraktivitet og anti-metastatiske virkninger og forstærkede den anti-metastatisk, men ikke antitumoraktiviteter af cyclophosphamid [13]. Desuden fucoidan inhiberede MMP-2/9 aktiviteter og invasivitet af HT-1080-celler og dannelse af vaskulære tubuli via undertrykkelse af ekspression og sekretion af et angiogenese faktor [14]. Men molekylære mekanisme for sit søgsmål er blevet sjældent forstået endnu.

(A) Subkonfluerende A549 celler blev inkuberet i 48 timer i fravær eller tilstedeværelse af fucoidan (0, 12,5, 25, 50, 100, og 200 ug /ml) i serumfrit RPMI-medium. De konditionerede medier blev opsamlet, og deres MMP-2-aktivitet blev estimeret ved anvendelse af gelatinezymografi. (B) MMP-2-aktivitet ved analyse af zymografi blev kvantificeret ved måling af båndintensiteter med Image J software. (C) det samlede cellelysater blev underkastet Western blot-analyse undersøgt med anti-MMP-2-antistof. (D) Ekspression af MMP-2 ved analyse af Western blot blev kvantificeret ved måling af båndintensiteter med Image J software. De viste data er gennemsnit ± SD af seks eksperimenter. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01

I den foreliggende undersøgelse, blev det undersøgt effekten af ​​fucoidan om migration, invasion og MMP-2 udtryk for A549 menneske lunge kræftceller og dens underliggende anti-metastatiske virkningsmekanismer.

Materialer og Metoder

Udarbejdelse af fucoidan og reagenser

fucoidan ekstrakt fra tang

blæretang

opnåedes fra Sigma (Sigma, St. Louis, Mo, USA). Fucoidan pulver blev opløst i PBS, derefter blev steriliseret under anvendelse af en 0,45 um pore filter (Sartorius Biotech GmbH, Gottingen, Tyskland) og opbevaret som »fucoidan ekstrakt (20 mg /ml) ‘ved 4 ° C indtil anvendelse. MTT reagenser og gelatine (G8150) blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RPMI 1640 medium uden phenolrødt, Trypsin-EDTA, penicillin-streptomycin-amphotericin B-opløsning (10.000 U /ml, 10 mg /ml og 25 ug /ml), føtalt bovint serum (FBS), og phosphatpufferopløsning (PBS) var fra Gibco BRL, Life Technologies (USA). LY294002 (PI3K-inhibitor) blev U0126 (ERK1 /2-inhibitor), og rapamycin (mTOR inhibitor) opnået fra Tocris Cookson Ltd. (Bristol, UK). For ERK1 /2, p38, JNK, Akt, mTOR (Ser2448), og NF-kB, total og /eller phosphorylerede protein-specifikke antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Invasion assaykit var fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

(A) A549-celler blev udpladet på 12-brønds og dyrket til 90% sammenflydning i RPMI indeholdende 10% FBS. Celler blev ridset med en pipettespids og derefter behandlet med fucoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml). (B) Cell migration afstand blev estimeret ved at måle bredden af ​​såret. De viste data er gennemsnit ± SD af seks eksperimenter. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01

(A) Virkninger af fucoidan på invasion kræftceller blev undersøgt ved hjælp af Cell Invasion Assay kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Til dette blev A549-celler podet på det øvre kammer af Matrigel-coated filter og inkuberet i fravær eller nærvær af fucoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml) i 48 timer. De invaderende celler på den nedre overflade af membranen blev visualiseret ved krystal-violet farvning og observeret med lysmikroskop. (B) Mængden af ​​invaderende celler blev kvantificeret ved hjælp Billede J software. De viste data er gennemsnit ± SD af tre eksperimenter. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01

Cell Culture

A549 celler fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 100 pg /ml penicillin-streptomycin-amphotericin B-opløsning ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator. Celler blev passeret tre gange om ugen ved behandling med trypsin-EDTA og dem af efter fem passager blev anvendt til eksperimenter.

(A) A549-celler blev behandlet med fucoidan 200 ug /ml for perioder med 0, 1 , 3, 6 og 9 timer, hhv. (B) A549-celler blev inkuberet i 6 timer med fucoidan i forskellige koncentrationer (0, 50, 100 og 200 ug /ml). Niveauerne af phospho-JNK 1/2, phospho-ERK 1/2, og phospho-p38 blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af specifikke monoklonale antistoffer. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (C og D) Den fosforylering niveau af ERK1 /2 blev kvantificeret ved analysen med Image J software. De viste data er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01

(A) A549 celler blev behandlet med fucoidan 200 pg /ml for perioder med 0, 1, 3, 6 og 9 timer, hhv. (B) A549-celler blev inkuberet i 6 timer med fucoidan i forskellige koncentrationer (0, 50, 100 og 200 ug /ml). Niveauerne af phospho-PI3K og phospho-Akt blev analyseret ved Western blotting under anvendelse af specifikke monoklonale antistoffer. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Phosphoryleringsniveauerne af PI3K (C og D) og Akt (E og F) blev kvantificeret ved analysen med Image J software. De viste data er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01

(A) A549 celler blev inkuberet i 24 timer med fucoidan i forskellige koncentrationer (0, 50, 100 og 200 pg /ml). Phosphoryleringsniveauerne af mTOR, p70S6K og 4EBP1 blev kvantificeret ved analysen med Image J software. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (B, C og D) De båndintensiteter (phosphoryleringsniveauerne) af hver signalmolekyler blev kvantificeret ved analysen med Image J software. De viste data er gennemsnit ± SD af tre eksperimenter. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01

(A) Celler blev forbehandlet med U0126 (10 eller 20 uM) (A), LY294002 (10 eller 20 uM ) (B), eller rapamycin (1 eller 2 uM) (C) i 2 timer og derefter inkuberet i fravær eller nærvær af fucoidan (25 ug /ml) i 48 timer. Ændringerne af MMP-2-aktiviteterne blev kvantificeret ved måling af båndintensiteter med Image J software. De viste data er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p 0,01

A549-celler blev inkuberet i 24 timer med fucoidan i forskellige koncentrationer (0, 50, 100 og 200 ug /ml). . (A) Den cytosoliske ekstrakt blev fremstillet og analyseret ved Western blotting med phospho-IkB og phospho- og total-NF-kB (p65). (B, C og D) Niveauet for phospho-IkB og fosfor tilsam- og total NF-kB blev kvantificeret ved analysen med Image J software. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol i cytosolisk fraktion og Lamin B blev ladningskontrol i nukleare fraktion. Bandet intensiteter af hver signalmolekyler blev kvantificeret ved analysen med Image J software. De viste data er gennemsnit ± SD af tre eksperimenter. Signifikant forskel fra kontrolgruppen, * p 0,05 og ** p 0,01

MTT Assay for Cell Levedygtighed

Cellernes levedygtighed blev målt ved MTT (3- (4,5. dimethyl-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) reduktion assay som beskrevet tidligere [15]. Kort fortalt blev A549-celler inkuberes ved en densitet på 4 x 10

4 celler /brønd i 24-brønds plader i 24 timer. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af fucoidan i 48 timer. Derefter blev MTT farvestof (5 mg /ml) tilsat til cellerne, og de blev inkuberet i yderligere 3 timer. Efter mediet var fjernet, blev DMSO tilsat til cellerne til opløseliggørelse af dannede formazan salte. Mængden af ​​formazan salt blev bestemt ved at måle den optiske densitet (OD) ved 540 nm ved anvendelse GENios® mikroplade-spektrofotometer (PowerWave

TMXS, BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA). Relativ cellelevedygtighed behandling blev beregnet som en procentdel af køretøj-behandlede kontrol ([OD af behandlede celler – OD af blank /OD af kontrol – OD af blank] x 100).

Wound Migration Assay

Cell migration assay blev udført under anvendelse af plader med 12 brønde som tidligere beskrevet [16]. A549-celler blev podet i 12-brønds plader (1 × 10

5 celler /ml) og dyrket til 80~90% konfluens til eksperimentet. Efter aspirering af medium blev celler skrabet med en 200 pi steril pipettespids for at skabe en lige bunden. De blev vasket to gange med PBS for at fjerne cellerester og derefter erstattet med komplet RPMI 1640. A549-celler blev behandlet med fucoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml) og inkuberet i 48 timer. Cellemigrering ind i sårområdet blev fotograferet ved stadier af 0 timer og 48 timer, henholdsvis for billedanalyse af hver behandling. Niveauet af celle migration blev bestemt ved anvendelse af en Hewlett-Packard scanner og NIH billede software (Billede J), ​​og det blev derefter udtrykt som en procentdel af hver kontrol for gennemsnittet af sår lukning område.

Cell Invasion Assay

invasive opførsel af A549 celler blev testet ved hjælp af celle invasion kammer kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) [17]. A549-celler blev resuspenderet i et serumfrit RPMI 1640 medium (5 x 10

4 celler /200 pi) i fravær eller nærvær af fucoidan (0, 50, 100 og 200 ug /ml). Cellerne blev podet på det øvre kammer af Matrigel-coated filter og et RPMI 1640 indeholdende 10% FBS blev tilsat 500 pi i det nedre kammer. Efter 48 timers inkubation blev ikke-invaderende celler fjernet fra den øvre overflade af filtermembranen. De invaderende celler på den nedre overflade af filtermembranen blev farvet med krystalviolet i 1 time og skyllet med vand og tørret. Mængden af ​​invaderende celler på den nedre overflade af filtermembranen blev bestemt ved anvendelse af et lysmikroskop og NIH Image-software (Image J).

gelatinezymografi

MMP-2-aktivitet blev bestemt ved gelatinezymografi [18]. Kort fortalt blev A549-celler podet (1 × 10

5 celler /brønd) og fik lov til at vokse til konfluens i 24 timer og opretholdt i RPMI 1640 med 10% FBS. Cellerne blev vasket med PBS og inkuberet med forskellige koncentrationer af fucoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml) i serumfrit RPMI 1640 i 48 timer. Supernatanten blev opsamlet og blandet med ikke-reducerende prøvebuffer og derefter elektroforeret i 10% polyacrylamidgel indeholdende 0,1% (vægt /volumen) gelatine. Efter elektroforesen blev gelen vasket i 30 minutter to gange med 2,5% Triton X-100 og inkuberet i yderligere 18 timer ved 37 ° C i den enzymatiske reaktion af MMP’er i zymografi reaktionsbuffer (200 mM NaCl, 10 mM CaCI

2 , 50 mM Tris-HCI, pH 7,4). Gelen blev derefter farvet med Coomassie blue R-250 (0,125% Coomassie blue R-250, 50% methanol, 10% eddikesyre) og affarvet (methanol /eddikesyre /vand, 40/10/50, vol /vol /vol ).

Fremstilling af cellelysater

Efter fucoidan behandlinger, A549-celler blev skyllet to gange med iskold PBS, og derefter tilsættes 100 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 150 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM natriumorthovanadat, 1 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, 1 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin). Lysis blev udført på is med rocking i 3 min, og cellerne blev skrabet ved anvendelse gummiskraber i Eppendorf mikrocentrifugerør. De skrabet Cellerne fik lov til at lysere i yderligere 30 minutter på is med periodisk omhvirvling. Cellerester blev fjernet ved centrifugering (22.000 x

g

, ved 4 ° C i 30 minutter), og den resulterende supernatant blev opsamlet og bestemt for dets proteinkoncentration ved anvendelse af et Bio-Rad proteinassay-reagens (Bio-Rad, CA USA). Prøver blev kogt med SDS-prøvebuffer i kogende vand i 5 min.

Western Blotting

proteinkomponenter (50 ug) blev separeret på 12% SDS-polyacrylamidgel, overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Bio-Rad, CA USA), og efterfølgende udsat for immunoblotanalyse under anvendelse af specifikke primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Efter vask blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) i 1 time ved stuetemperatur. Blottene blev derefter visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens-metoden (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) på blå lysfølsom film (Fujifilm Corporation, Tokyo, Japan). Hvis det er nødvendigt, blev blottede membraner strippet og testet igen ved hjælp af andre primære antistoffer. Densitometri analyse blev udført med en Hewlett-Packard scanner og NIH billede software (Billede J).

Statistisk analyse

Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (standardafvigelse). Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​forskellen mellem de to middelværdier. *

P

0,05 og **

P

. 0,01 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Fucoidan hæmmer aktiviteten af ​​MMP -2 i A549 human lunge cancerceller

for at bestemme ikke-cytotoksisk koncentration af fucoidan, A549-celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af fucoidan (0-1000 pg /ml) i 24 timer eller 48 timer, og derefter cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse MTT assay (data ikke vist). Fucoidan viste ikke nogen signifikant toksisk virkning på A549-celler i koncentrationsområdet 0-200 ug /ml. Ved højere koncentrationer (400-1000 ug /ml), dog fucoidan inhiberede celleproliferation og nedsat cellelevedygtighed i en koncentrationsafhængig måde. Derfor angår den foreliggende undersøgelse anvendte behandling af fucoidan ved koncentrationer lig med eller lavere end 200 ug /ml, hvor der blev observeret nogen signifikant cytotoksisk virkning af A549-celler.

Nedbrydningen af ​​ekstracellulær matrix (ECM) er afgørende for cellulær invasion, hvilket indikerer den uundgåelige inddragelse af matrix-nedbrydende proteinaser for processen. Derfor blev det vurderet effekten af ​​fucoidan på MMP-2-aktivitet, som et centralt molekyle af ECM nedbrydning ved gelatinezymografi. Som vist i figur 1A, fucoidan undertrykt MMP-2-aktivitet i en koncentrationsafhængig måde. På den anden side, virkningen af ​​fucoidan på MMP-9-aktivitet var usikkert, eftersom der kun er et ekstremt lavt niveau af iboende MMP-9-aktivitet detekteres i A549-celler (data ikke vist). MMP-2-aktivitet blev reduceret med 36%, 53% og 72% ved 50, 100, og 200 ug /mL, efter behandling med fucoidan i 48 timer (fig. 1B). De opnåede ved zymografi resultater blev yderligere bekræftet ved Western blot analyse. MMP-2-ekspression blev gradvist faldt med stigende koncentrationer af fucoidan (fig. 1C). Proteinniveauet blev reduceret med 38%, 48% og 60% ved 50, 100, og 200 ug /ml. Reduktionen af ​​MMP-2-aktivitet var sandsynligvis på grund af faldet i MMP-2-ekspression (fig. 1B og 1D).

Fucoidan Undertrykker Migration af A549 celler

Cell migration er et mål af metastatiske potentiale af cancerceller. Virkninger af fucoidan på cellemigrering blev undersøgt under anvendelse af et sårhelende assay. A549-celler behandlet med fucoidan viste reduktion af migration (Fig. 2A). Som vist i figur 2B, blev cellemigrering inhiberes med op til 25%, 46% og 57% ved 48 timer i nærvær af 50, 100, og 200 ug /ml fucoidan hhv. Tilsammen viste disse data, at fucoidan kan undertrykke den vandrende egenskab lunge kræftceller.

Fucoidan Hæmmer Invasion af A549 celler

For at belyse hæmmende virkning af fucoidan på invasion af A549 celler, var det testet ved hjælp invasion kammer kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), hvor celler invaderer tværs ekstracellulær matrix, såsom Matrigel-coated filter i kammeret. Som illustreret i figur 3A, er antallet af celler med invasion (krystal-violet farvning) reduceres bemærkelsesværdigt i en koncentrationsafhængig måde, hvilket tyder fucoidan kan inhibere invasion af A549-celler. De inhibitoriske virkninger af fucoidan på cancercelleinvasion var 35%, 68% og 86% ved koncentrationer på 50, 100, og 200 ug /ml fucoidan, (fig. 3B). Disse resultater viste, at fucoidan direkte kan hæmme den invasive potentiale for lungekræft celle.

Fucoidan Hæmmer MMP-2 Aktivitet ved Blokering ERK1 /2 og PI3K-Akt Pathways i A549 Cells

Vores resultater viste, at fucoidan dramatisk inhiberer migration, invasion og MMP-2-aktivitet i A549-celler. Men signalet mekanismer der er ansvarlige for den inhiberende virkning af fucoidan på metastase mangler at blive belyst. Adskillige beviser antyder, at MAPK’er (JNK 1/2, ERK 1/2, og p38) spiller en vigtig rolle i cancer cellemigrering, invasion, og MMP-2-aktivitet [5]. I betragtning af den stærke anti-metastatiske potentiale fucoidan, blev det testet, om det kan regulere signalet transduktioner af MAPK’er i metastatiske lunge- kræftceller. Resultaterne af figur 4 viste, at fucoidan reduceret phosphorylering af ERK1 /2 i en koncentrations- og tidsafhængig måde, det havde næsten ingen eller marginal, om nogen, virkning på p38 og JNK1 /2. Som vist i figur 4A og 4C, en tidsafhængig undersøgelse viste at fucoidan gradvis phosphorylering af ERK1 /2 fra 1 time til 9 timer efter behandlingen. Figur 4B og 4D viste, at fucoidan signifikant hæmmet phospho-ERK1 /2 i en koncentrationsafhængig måde med en maksimal inhiberende virkning ved den højeste koncentration (200 ug /ml). Udover MAPK’er har cellesignalering af PI3K /Akt også blevet foreslået som en central aktør i reguleringen af ​​MMP-2-aktivitet [19]. Vores nuværende undersøgelse viste, at fucoidan markant inhiberede phosphoryleringer af PI3K og dets nedstrøms target, Akt, i en koncentrations- og tidsafhængig måde (fig. 5). Baseret på disse resultater, fucoidan kraftigt inhiberede metastatisk aktivitet af humane lungecancerceller, eventuelt ved de undertrykkelse af ERK1 /2 og PI3K-Akt pathways.

fucoidan blænder mTOR Signaling

Det har været rapporterede, at PI3K er forbundet med en række cellulære processer, herunder proliferation, differentiering, apoptose, cellemotilitet, invasion og angiogenese [20], [21]. Signalering af mTOR er opstået især som en kritisk effecter af PI3K signaltransduktionsvej i forskellige humane cancere [22]. Baseret på vores fund, at fucoidan undertrykker PI3K-Akt pathway i humane lunge kræftceller, blev det undersøgt, om fucoidan modulerer mTOR og dens downstream signalmolekyler. Som vist i figur 6A og 6B, fucoidan inhiberede phosphorylering af mTOR i en koncentrationsafhængig måde. Derudover 4E-BP1 og p70S6K, to umiddelbare downstream mål for mTOR og indikatorer for mTOR-aktivitet, blev også signifikant undertrykt (fig. 6C og 6D).

Fucoidan Hæmmer MMP-2 Aktivitet ved Blokering ERK1 /2 og PI3K-Akt-mTOR veje i A549 celler

for at bekræfte, om hæmning af MMP-2-aktivitet ved fucoidan hovedsagelig afhænge af dens undertrykkelse af ERK1 /2 og PI3K-Akt-mTOR veje blev A549 celler forbehandlet i tilstedeværelse eller fravær af U0126 (en ERK-inhibitor), LY294002 (a PI3K inhibitor) eller rapamycin (a mTOR inhibitor) i 2 timer, derefter undersøgt for virkningen af ​​fucoidan behandling (fig. 7). Sammenlignet med de respektive køretøjer kontroller, individuelle behandlinger med U0126 (fig. 7A, spor 3 og 4), LY294002 (fig. 7B, spor 3 og 4) eller rapamycin (fig. 7C, bane 3 og 4) gav en signifikant reduktion af MMP-2-aktivitet. Resultaterne er i overensstemmelse med dem ved fucoidan eksperimenter af den foreliggende undersøgelse ved, at MMP-2-inhibering kan være medieret af de modulationer af ERK1 /2, PI3K-Akt og /eller mTOR veje. Som i detaljer beskriver, at samtidig behandling af U0126 (10 uM og 20 uM) og fucoidan yderligere reduceret MMP-2-aktivitet med 66% og 75% sammenlignet med U0126 alene (46% og 65%) (fig. 7A). På samme måde, de kombinerede behandlinger af LY294002 og fucoidan desuden undertrykt MMP-2-aktivitet med 65% og 86% i sammenligning med LY294002 alene (27% og 43%) (fig. 7B). Men i modsætning til andre, rapamycin og fucoidan samtidig behandling gav ikke en yderligere reduktion af MMP-2-aktivitet sammenlignet med rapamycin alene (fig. 7C). Det er ikke forstået endnu tydeligt, hvorfor der var hverken additive eller synergistiske virkninger af rapamycin med fucoidan. Sammenfattende er inhiberingen af ​​MMP2 ved fucoidan behandling eventuelt udvises af modulationer af ERK1 /2 og /eller PI3K-Akt-mTOR pathways. Disse resultater foreslog terapeutiske potentiale af fucoidan som en anti-metastatisk middel til patienter humane lungecancer.

Fucoidan Reducerer Nuclear translokation af NF-KB

NF-KB-vejen er blevet påvist at stole ved sekventielt aktiveret kinase kaskader [23]. Ved aktivering, NF-KB translokerer fra cytoplasmaet ind nucleus og regulerer ekspressionen af ​​en bred vifte af målgener, herunder MMP’er [5]. Da NF-KB kan spille en central rolle i MMP-2 genekspression, blev virkningerne af fucoidan vurderet på kBa og NF-KB signaltransduktion. Som vist i figur 8A og 8B, fucoidan inhiberede phosphoryleringen af ​​kBa i en koncentrationsafhængig måde, mens det samlede kBa omvendt blev forhøjet med fucoidan. Være i overensstemmelse med dette, blev phospho-p65, en indikator for NF-KB-aktivering gennem kBa nedbrydning, faldt med behandlingen af ​​fucoidan (fig. 8A og 8C), som er ledsaget af en stigning i total p65 i den cytosoliske fraktion og dens falde i nukleare fraktion (fig. 8A og 8D). Resultaterne viste, at fucoidan signifikant inhiberede aktivering af NF-KB i A549-celler.

Discussion

Det er velkendt, at MMP’er giver adgang for tumorceller til det vaskulære og lymfatiske kar, som støtte tumorvækst og udgør en flugtvej til videreformidling [24]. Endvidere MMP’er fremme malign transformation i tidlige stadier af cancer og undertrykke cancerceller apoptose og forbedre angiogenese samt ødelægge kemokiner balance af vært anti-tumor forsvarssystem [25]. Derfor blokering af MMP aktivitet og udtryk kan føre til udviklingen af ​​en effektiv terapi i metastaserende kræftpatienter. Selv om mange forskere har gjort en stor indsats for at udvikle potentielle anticancer agenter for MMP inhibitorer, de fleste kliniske forsøg er ikke blevet gennemført endnu [26].

På jagt efter effektive metastatiske undertrykkere, en bred vifte af naturlige produkter og deres farmakologiske ingredienser kan være en god kilde til at finde lovende kandidater, der har flere fordele i forhold syntetiske kemikalier på bivirkninger og farmakofor mangfoldighed. Nogle af dem fra forskellige naturlige ressourcer er blevet allerede karakteriseret som potentielle lægemidler med anti-metastatisk aktivitet [27]. Blandt dem er fucoidan blevet afsløret at have anti-proliferative og cytotoksiske virkninger på MCF-7 brystcancerceller, men ikke humane mammae epitelceller (HMECs) [28]. For nylig er fucoidan blevet påvist at inhibere metastase via MMP-2 /-9 suppression samt undertrykke ekspressionen og sekretionen af ​​en vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [14]. Den anti-metastatisk aktivitet af fucoidan blev også vist i dyremodellen for eksperimentel transplanteret Lewis lungecarcinom (LLC) [13]. Men den hæmmende mekanisme på kræft metastaser er ikke klart belyst i detaljer endnu. For første gang, i denne undersøgelse, er det i det mindste delvist identificeret anti-metastatisk molekylære mekanisme af fucoidan.

Status for cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse MTT-assay i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af fucoidan . Fucoidan hæmmede cellevækst ved 400 ug /ml, men ikke på mellem 0 og 200 ug /ml, hvor det effektivt inhiberede migration og invasion uden væsentlig cytotoksisk virkning. Derfor er de anti-invasive og anti-migrerende virkninger af fucoidan observeres fra den foreliggende undersøgelse var ikke afhængig af dens anti-proliferation virkning. Forøgelsen af ​​MMP-2-aktivitet er blevet godt karakteriseret i stærkt metastatiske humane lungecancer-celler [29]. Imidlertid MMP-9 er stadig usikkert, da der kun er et ekstremt lavt niveau af MMP-9 detekteret i A549 humane lungecancer-celler. Baseret på vores nuværende undersøgelse, anti-metastatiske virkninger af fucoidan synes at være medieret af sin hæmmende aktivitet på MMP-2. (Fig. 1, 2 og 3). Vores resultater viser, at fucoidan virkning er mere som undertrykkelsen af ​​MMP-2-sekretion og /eller ekspression snarere end direkte inhibering af dets aktivitet.

ERK1 /2-vejen er involveret i invasive eller vandringsadfærd af et antal af maligne lidelser, såsom coloncancer, melanom, brystcancer og prostatacancer, og dette er veletableret i tidligere undersøgelser [30] – [32]. Desuden ERK1 /2 regulerer fokal adhæsion og cytoskelet reorganisering via phosphoryleringer af særlig cytoskelet og fokale adhæsionsproteiner, herunder paxillin, FAK, myosin let kæde-kinase [33]. Som vist i figur 4, er den anti-metastatisk virkning ved fucoidan grund af dens inaktivering af ERK1 /2-vejen i A549 humane lungecancerceller. Foruden ERK1 /2, har den PI3K-Akt signalvej blevet vist at regulere invasion og metastase af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) samt udviklingen og forløbet af forskellige andre tumorer. Det vil sige, PI3K overekspression er stærkt korreleret med udviklingen, invasion og metastase af NSCLC [34]. Flere andre undersøgelser har også vist, at målretning af PI3K-Akt signalvejen med antisense, siRNA eller småmolekylære inhibitorer resulterer i nedregulering af tumorinvasion og tumorigenese i maligne cancerceller [6], [35].