PLoS ONE: Vitamin D receptor Hæmmer respirationskæden, Bidrag til den metaboliske Switch, der er afgørende for Cancer Cell Proliferation

Abstrakte

Vi har for nylig beskrev mitokondrie lokalisering og import af vitamin D-receptoren (VDR) i aktivt prolifererende HaCaT celler for første gang, men dens rolle i organel fortsat ukendt. Mange metaboliske mellemprodukter, der understøtter cellevækst leveres af mitokondrier; følgelig identifikation af proteiner, der regulerer mitochondriske metaboliske veje er af stor interesse, og vi søgte at forstå, om VDR kan modulere disse veje. Vi genetisk tavshed VDR i HaCaT celler og studerede virkningerne på cellevækst, mitokondrie metabolisme og biosyntetiske veje. VDR knockdown resulterede i robust vækstinhibering, med akkumulering i G0G1 fase af cellecyklussen og nedsat akkumulering i M-fasen. Virkningerne af VDR silencing på proliferation blev bekræftet i adskillige humane cancercellelinier. Nedsat VDR udtryk konsekvent observeret i to forskellige modeller for celledifferentiering. Nedskrivningen af ​​tavshed HaCaT cellevækst blev ledsaget af kraftige stigninger i mitokondriemembranen potentiale, som sensibiliserede cellerne til oxidativ stress. Vi fandt, at transkription af underenheder II og IV cytochrom c-oxidase blev signifikant øget efter VDR nedregulering. Følgelig behandling af HaCaT celler med vitamin D nedreguleret begge underenheder, hvilket antyder, at VDR kan hæmme den respiratoriske kæde og omdirigere TCA mellemprodukter mod biosyntese, hvilket bidrager til den metaboliske kontakt, der er typisk for cancerceller. For at undersøge denne hypotese undersøgte vi forskellige acetyl-CoA-afhængige biosynteseveje, såsom mevalonat-vejen (målt som cholesterolbiosyntese og prenylering af små GTPaser), og histon acetyleringsniveauer; Alle disse veje blev hæmmet med VDR nedregulering. Disse data giver bevis af den rolle, VDR som gatekeeper af mitokondrie respiratoriske kæde aktivitet og en formidler af omdirigering af acetyl-CoA fra energiproducerende TCA cyklus mod biosyntetiske veje, der er afgørende for celleproliferation.

Henvisning: Consiglio M, DESTEFANIS M, Morena D, Foglizzo V, Forneris M, Pescarmona G, et al. (2014) Den D-vitamin receptor Hæmmer respirationskæden, Bidrag til den metaboliske Switch, der er afgørende for Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 9 (12): e115816. doi: 10,1371 /journal.pone.0115816

Redaktør: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Japan

Modtaget: August 9, 2014 Accepteret: November 27, 2014; Udgivet: December 29, 2014

Copyright: © 2014 Consiglio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministero dell’Istruzione Università e Ricerca. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

vitamin D-receptoren (VDR), sammen med de andre medlemmer af steroid hormon receptor familie, er generelt blevet beskrevet som en klassisk ligand-moduleret transkriptionsfaktor. De differentierende virkninger af VDR er udløst af ligand-induceret nuklear translokation og binding til vitamin D-responsive element (VDRE) sites på regulerede gener i association med heterodimerisering partnere, coaktivatorer og corepressorer. Forskelle i co-repressorkomplekset binding og DNA-methylering afspejler den dybe variabilitet af VDR antiproliferative responser i forskellige celle modeller [1]. Modstand mod de nukleare virkninger af D-vitamin er blevet rapporteret i flere modeller af kræft, herunder prostata, bryst og blære kræftformer, hvor øget co-repressorkomplekset udtryk og lokalisering er blevet anset for at være ansvarlig for ufølsomhed over for hormonet [2] – [4 ].

Steroid receptorer også have en ikke-genomisk modalitet af handlen på plasmamembranen eller mitokondrie steder, og VDR er ingen undtagelse. Faktisk er de hurtige, ikke-genomisk virkninger af vitamin D synes at være medieret af VDR [5] – [7]. Mange steroid receptorer og nukleare transkriptionsfaktorer indtaste mitokondrie rum, hvor de enten udøver transkriptionel regulering af mitokondrie-DNA eller kontrol mitokondrisk biogenese og metabolisme [8] – [11]. Vi har for nylig beskrevet mitokondrie lokalisering af VDR i en human prolifererende keratinocytcellelinje (HaCaT) for første gang og viste, at mitokondriel import af receptoren medieres af permeabilitetsovergang pore kompleks [12]. Men funktionen af ​​VDR i dette organel stadig, at blive belyst. Mitokondrier er multifunktionelle organeller og mitokondrie-aktivitet er vigtig for celleproliferation og fysiologi. For eksempel mitokondrierne spiller væsentlige roller i cellulære energi (ATP) produktion via tricarboxylsyre (TCA) cyklussen koblet til oxidativ phosphorylering (OXPHOS), samt under apoptose via reaktive oxygenarter (ROS) generation og cytochrom c-frigivelse. Adskillige studier har indikeret, at mitokondriel dysfunktion bidrager til udvikling og progression af forskellige humane sygdomme, herunder cancer [13]. Et kendetegn for tumorceller er ændret metabolisme understøtter hurtig cellulær proliferation [14]. Mange metaboliske mellemprodukter, der understøtter cellevækst leveres af mitokondrierne [15]; følgelig identifikation af proteiner, der regulerer mitochondriske metaboliske veje er af stor interesse, og vi søgte at forstå, hvorvidt VDR kan modulere disse veje.

I den foreliggende undersøgelse, ved hjælp af vores tidligere beskrevet model (prolifererende HaCaT celle linje), vi genetisk tavshed receptoren og undersøgt virkningerne på cellevækst, mitokondrie metabolisme og biosyntetiske veje. De indsamlede data giver bevis for en ny rolle VDR som en negativ regulator af respiratorisk kæde aktivitet, og vi fremhæve konsekvenser for cellulær anabolisme og vækst produceret af VDR på mitokondrie respiration. Baseret på vores observationer, konkluderer vi, at VDR, ved at indskrænke mitokondrie respiratoriske aktivitet, gør det muligt for cellen at skåne metaboliske mellemprodukter, som kan benyttes fra oxidativ metabolisme mod en biosyntetisk skæbne, støtte cellevækst. Vi valideret den generelle rolle VDR som en forstærker af celleproliferation at udvide vores observationer til adskillige humane cancer cellelinjer.

Resultater

VDR lyddæmpning i HaCaT celler hæmmer celleproliferation

Fordi vi tidligere karakteriseret VDR mitokondrie import i HaCaT celler, vi brugte denne model til at undersøge VDR funktion ved hjælp af genetisk lyddæmpning. Hvis bekæmpelse VDR niveauer upon lentiviral levering af shRNA som var blevet rejst mod det humane VDR var bemærkelsesværdigt, hvilket fremgår af mRNA og protein analyser i fig. 1A og 1B, og udløste potent vækst anholdelse i HaCaT celler, som vurderet ved hjælp af en spredning assay, der fremhævede en tydelig nedgang i væksten i VDR-tavshed celler i forhold til at styre celler (fig. 1C). Celle vækststandsning var karakteriseret ved akkumulering af VDR knock down cellepopulation i G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen og et fald i M-fasen cellepopulationen (fig. 1D). Ingen tegn på apoptotiske eller lider celler var tydelige i de tavse celler, som påvist ved cellecyklus-analyse, der afslørede ikke en sub-G0 højdepunkt, og MTT toksicitet assay, som afslørede identisk levedygtighed i kontrol og bragt til tavshed celler (fig. 1E).

Subkonfluente HaCaT celler blev inficeret med lentivirale VDR shRNA 3 og shRNA kontrol partikler. Syv dage efter infektion og puromycinselektion blev VDR-ekspression evalueret i de cellulære ekstrakter. (A) mRNA-ekspressionsniveauer blev kvantificeret under anvendelse af real-time analyse af VDR-transkripter, og værdierne er udtrykt som fold ændringer i lyddæmpede celler sammenlignet med kontrollerne. (B) VDR-ekspression i de mitokondriske fraktioner (venstre paneler) og totale lysater (højre paneler) fra shRNA-transficeret kontrol og shRNA-transficerede VDR-celler blev analyseret under anvendelse western blotting. Tubulin påvist i totale ekstrakter og VDAC niveauer i mitokondrie fraktioner blev brugt som interne kontroller for protein lastning. Virkningerne af VDR silencing på proliferation blev vurderet ved anvendelse af en krystalviolet-assay i celler, der var blevet farvet på forskellige tidspunkter efter podning (C), samt ved hjælp af cellecyklusanalyse (D) i celler, der blev høstet på dag 7 efter infektion . (E) Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af MTT-assayet på dag 7 efter infektion, og værdierne er udtrykt som procentdelen af ​​absorbans shRNA kontrol. Dataene er udtrykt som middel ± SD af tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollen

differentierende og antiproliferative virkning af vitamin D in vitro er blevet beskrevet tidligere i litteraturen. Sådanne virkninger medieres af transkriptionel kontrol, som forud for nuklear translokation og ikke forekommer i vitamin D-stimulerede HaCaT celler [12]. HaCaT-celler synes at være resistent over for de nukleare antiproliferative virkninger af D-vitamin, og derfor fandt vi, at vitamin D behandling ændrede ikke vækstraten for HaCaT celler (som vist i S1 fig.). Således HaCaT celler repræsenterer en model af resistens over for de differentierende egenskaber af D-vitamin, og der er ikke nogen uoverensstemmelse mellem den nukleare antiproliferative rolle af vitamin D, der er beskrevet i litteraturen og de proliferative virkninger udøves af VDR i vores celle model. Resultaterne af vores lyddæmpende forsøg viser, at VDR i HaCaT celler øger cellevækst.

Mitokondriel lokalisering af VDR er et fælles træk ved menneskelige kræftceller, og receptor nedregulering hæmmer celleproliferation

I for at vurdere om mitokondrierne kan anses for at være en korrekt due af VDR, evaluerede vi sit udtryk i et panel af humane cancer cellelinjer og de førnævnte HaCaT celler (fig. 2A). I enhver cellelinie, som blev testet positive for VDR-ekspression blev de mitokondrielle ekstrakter analyseret via western blotting og afslørede tilstedeværelsen af ​​receptoren. Vi antager, at hvis VDR var kendetegnende for prolifererende celler og havde potentialet til at lette cellevækst, som foreslået af fænotypen observeret i lyddæmpede HaCaT celler, så kunne det let blive skånet, eller endog fjernet, i en differentieret tilstand. Således har vi evalueret VDR ekspressionsniveauerne i to modeller, der giver mulighed for undersøgelse af humane prolifererende celler og deres differentierede kolleger: Vi sammenlignede HaCaT prolifererende keratinocytceller fuldt differentieret primære keratinocytter og rhabdomyosarcom RD18 celler, der var blevet induceret til at differentiere ved betingede udtryk for mIR-206 [16]. Mitokondrielle ekstrakter af både differentierede cellepopulationer afslørede reduceret receptorekspression i forhold til niveauet fra prolifererende celler (fig. 2B).

(A) VDR-ekspression blev analyseret i et panel af adskillige humane cellelinjer under anvendelse western blotting i alt lysater (tot VDR) og mitochondriske ekstrakter (mitoc VDR). For RD og MCF7-celler, VDR detektion krævede en længere varighed af eksponering for ECL. (B) To modeller af cellulær differentiering blev anvendt til at vurdere VDR-niveauer i de samlede lysater og mitokondriske fraktioner: Menneske prolifererende HaCaT celler vs. humane primære differentierede keratinocytter og differentiering-inducerbar RD18 celler, der bærer en doxycyclin-inducerbar MIR-206-udtrykkende lentiviral vektor i fravær (ikke-inducerede: NI) eller nærvær af doxycyklin for fire (induceret: IND4) og seks dage (induceret: IND6). Tubulin påvist i totale ekstrakter og VDAC niveauer i mitokondrie fraktioner blev brugt som interne kontroller for protein lastning. Blottene er repræsentative for et sæt af tre uafhængige forsøg

Efter at have detekteret den udbredte mitokondrie ekspression af VDR, søgte vi at bekræfte, at VDR-ablation kompromiser cellulær proliferation.; således, afskaffede vi VDR-ekspression i alle de cancercellelinier anvende genetiske lyddæmpning. VDR-ekspression blev stille i alle de VDR-positive cellelinjer, såvel som de HaCaT celler og receptor-ekspression blev igen stærkt reduceret, som vurderet både i de samlede ekstrakter og de mitochondriale fraktioner (fig. 3A). Bemærkningerne i HaCaT celler blev kraftigt støttet af resultaterne af disse Knockdown eksperimenter, fordi udbredelsen af ​​alle cellerne markant blev hæmmet af VDR lyddæmpning. Faktisk var vi i stand til at demonstrere en generel reduktion i spredning på alle de tavse celler, som var svarende til den observeret i de HaCaT celler, da deres vækst blev evalueret mellem 72 timer og 5 dage som sammenlignet med vilde type celler (fig. 3B). Den tavshed fænotype blev bekræftet under anvendelse af en anden shRNA for VDR (shRNA 4, som beskrevet i metodeafsnittet), som var så effektiv i tavshed VDR som shRNA 3 og faldt også cellevækst (S2 fig.). Desuden, når vi afgivet shRNA der var ineffektiv med hensyn til VDR silencing (shRNA 2, som beskrevet i metodeafsnittet) proliferationen af ​​HaCaT celler blev ikke hæmmet (S2 fig.).

(A) cellerne blev inficeret med lentiviral VDR shRNA 3 eller shRNA kontrol og den lyddæmpende effekt blev undersøgt i både totalt og mitokondrielle ekstrakter anvendelse af Western blotting. Tubulin påvist i totale ekstrakter og VDAC niveauer i mitokondrie fraktioner blev brugt som interne kontroller for protein lastning. (B) Både tavse og kontrolceller blev underkastet proliferationsassays syv dage efter infektion og selektion. Cellerne blev farvet efter 72 timer eller fem dage efter podning, og værdierne for de tavse celler er udtrykt som procentdele af deres respektive kontroller. Dataene er udtrykt som middel ± SD af tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollen

VDR nedregulering forbedrer mitokondrie respiration

andet steroid receptorer er blevet angivet tidligere at regulere mitokondrie-transkription og aktivitet [17] – [19], hvilket fik os til at undersøge, om den VDR, som er lokaliseret i mitokondriske rum (svarende til sin familie analoger), styrer mitokondrie metabolisme. Først, vi vurderet den mitokondrie respiratoriske aktivitet HaCaT celler ved at måle variationer i membranpotentialet via JC-1 analyse ved hjælp cytofluorimetri. Som vist i fig. 4A, VDR lyddæmpning kraftigt forøgede mitochondriemembranpotential, og når vi udsættes disse celler for oxidativ stress (H

2O

2), deres potentiale blev forringet til et større omfang end vilde celler typen undergivet samme behandling (fig. 4A). Men når cellerne blev udsat for en anden, ikke-oxidativt stress (fx sorbitol-induceret osmotisk stress), mitokondrie potentiale både vildtype og vælte celler faldt i samme grad (fig. 4B). Baseret på disse observationer, konkluderede vi, at VDR inhiberede mitochondriemembranpotential og sandsynligvis behersket ROS produktion, beskytter cellen mod yderligere oxidativ stress. Tværtimod VDR tab øges det respiratoriske potentiale, men afsmeltet celler mere udsat for en oxidant-drevet potentielle kollaps. Denne mulighed blev støttet af forbruget væsentligt lavere glutathion (GSH) i vild type celler, som de fremgår af de højere niveauer af antioxidant molekyle, der blev målt i vildtypeceller sammenlignet med lyddæmpede celler (S3 fig.).

HaCaT-celler blev inficeret med shRNA kontrol eller VDR shRNA 3 og det mitokondrielle membranpotentiale blev undersøgt under anvendelse JC-1 cytofluorimetrisk evaluering, i nærvær eller fravær af to forskellige stressfaktorer: (A) kontrol og bragt til tavshed celler blev behandlet med enten 10 mM H

2O

2 eller (B) 0,5 M sorbitol. I begge figurer er et repræsentativt billede fra cytofluorimetrisk analysen vist i toppanelet, mens resultaterne fra tre separate forsøg er plottet i grafen i det nederste panel. FL-2 /FL-1 blev beregnet og værdierne er udtrykt som en procentdel af den ubehandlede shRNA kontrol. * P 0,05 sammenlignet med den ubehandlede shRNA kontrol,

$ P 0,05 sammenlignet med den behandlede shRNA kontrol. (C) Real time analyse af COX II (COX II) og IV (COX IV) subunit udskrift udtryk i kontrol og bragt til tavshed celler. Fold ændringer afsættes på graferne som middel ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 og ** P 0,01 sammenlignet med shRNA kontrol. (D) HaCaT celler blev dyrket i nærvær eller fravær af 10 nM D-vitamin og COX II og COX IV transcript ekspression blev vurderet ved anvendelse real-time analyse efter 24 og 48 timers behandling. Værdierne afbildet på grafer repræsenterer gange ændring i transkript ekspression i behandlede versus ubehandlede celler og vises som middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg.

§ P 0,05 og

§§ P. 0,01 sammenlignet med de ubehandlede celler

Mitokondriel potentiale er lidt af den proton gradient, der er skabt af respiratorisk kæde aktivitet; Derfor besluttede vi at undersøge ekspressionen af ​​to underenheder af komplekse IV: cytochrom c oxidase (COX) subunits II og IV, hvis udskrifter er af mitokondrie (tidligere) og nuklear (sidstnævnte) oprindelse. Både nuklearrelaterede og mitokondrier kodede proteiner er nødvendige for dannelsen af ​​aktive respiratoriske komplekser. Mitokondrie RNA transskriberes som lange, polycistroniske precursor udskrifter, som senere behandles for at frigive de enkelte rRNA’er og mRNA. Derfor betragtede vi COX II at være en markør for mitokondrie-transkription aktivitet og COX IV for at være en markør for den nukleare bidrag til respiratoriske kæde modulation.

iagttoges Forøget ekspression af begge underenheder i lyddæmpede celler sammenlignet med kontrolceller ved hjælp af real-time PCR (fig. 4C). For at bekræfte, at VDR negativt påvirket COX transkription behandlede vi vildtype HaCaT celler med vitamin D og observerede, at niveauerne af alle transkripter blev reduceret (fig. 4D). Da transkriptionen af ​​subunit IV er nukleare, hvorimod den for subunit II kodes af mitokondrie-DNA (mtDNA), konkluderede vi, at D-vitamin transkriptionel kontrol udøves på begge niveauer, hvilket ikke er overraskende i betragtning af, at nuklear og mitokondriel transkription af respiratoriske kæde proteiner fintunet [20].

Fordi modulering af mitokondrie-transkription af VDR ikke tidligere er blevet beskrevet, overvejede vi muligheden for direkte binding af receptoren til mtDNA.

I silico

analyse blev udført med det formål at screene mtDNA at identificere D vitamin lydhør element (VDRE) sites. Vi anvendte en VDRE sekvens repræsenteret ved en samling af positionelle vægt matricer (som beskrevet i afsnittet Fremgangsmåder og vises i S1B tabellen) for at beregne affiniteten af ​​VDR for mtDNA-sekvensen. Kun to VDRE sites viste sig at have høj affinitet cutoffs (89% og 82% af den maksimale score) og begge var placeret i fordrivelse løkke (D-loop), en ikke-kodende og regulatoriske region. Vi identificerede også i alt 40 VDRE sites med lav affinitet scoringer ( 60% af den maksimale) grupperet i nogle få regioner (se tabel 1 for en beskrivelse af de højere affinitet VDRE sites og S1A tabel for den komplette liste). I nogle tilfælde er disse VDRE sites dannet af flere gentagelser, hvilket indikerer en betydelig tilstedeværelse af bindingssteder i disse regioner. Af note, blev størstedelen af ​​VDRE sites fundet på bagsiden strengen, hvilket sandsynligvis skyldes skævheden af ​​mtDNA nukleotid distribution. Desuden blev lav affinitet sites beriget på hypervariable segment 1 (p = 0,01425). Den høje affinitet af de identificerede VDRE sites giver mulighed for VDR-medieret direkte transkriptionel kontrol af mtDNA. Yderligere undersøgelser er planlagt til at undersøge de særlige kendetegn ved denne binding.

Den øgede potentiale membran, der blev observeret i de tavse celler, kombineret med den inducerede ekspressionen af ​​COX udskrifter, viste, at det respiratoriske kæde blev forstærket i tavshed HaCaT celler.

samlet set vores resultater viser, at VDR spiller en rolle i den negative modulation af respiratoriske kæde udtryk og respiratoriske aktivitet, hvor begge moderate membran potentiale og er beskyttende mod oxidativt stress.

VDR nedregulering minimerer acetyl-CoA udnyttelse i biosyntetiske veje

i et forsøg på at forbinde den reducerede cellevækst og den øgede mitokondriepotentiale der blev observeret i VDR vælte celler, vi den hypotese, at intens aktivitet af respirationskæden stimulerer TCA cyklus i lyddæmpede celler. I hvilende celler, den grundlæggende funktion af mitokondrier er at producere ATP via en TCA-cyklus-feeding elektrontransportkæden og oxidativ phosphorylering med henblik på at levere energi til en række forskellige cellefunktioner; i modsætning hertil kræftceller er ikke stærkt afhængige af OXPHOS for deres energibehov og re-direct TCA cyklus mellemprodukter at bevare deres biosyntetisk funktion. Således i prolifererende celler, er mitokondrielle veje rewired at understøtte proliferation.

Vores data antydede, at VDR, hvilket reducerer de metaboliske krav respirationskæden kan omprogrammere TCA cyklus og deres mellemprodukter kan anvendes i biosyntetiske processer . For at teste denne hypotese analyserede vi de biosynteseveje afhængige af acetyl-CoA omdirigeret fra mitokondrie katabolisme. Først vi overvejet produkter af mevalonat kaskade, nemlig kolesterol, ubiquinon og isoprenic enheder vigtige for post-translationelle modifikationer af proteiner. Kolesterol og ubiquinon

de novo

syntese blev målt i HaCaT celler. Kontrol- og VDR vælte celler blev mærket med [

3H] acetat og indholdet af cellerne lipid blev analyseret under anvendelse TLC. VDR lyddæmpning faldt

de novo

syntese af kolesterol (fig. 5A), mens ubiquinon biosyntetiske lå upåvirket af silencing (fig. 5B). Syntesen af ​​isoprenic enheder blev målt som prenylering status to små GTPaser: RhoA og Ras. VDR nedregulering resulterede i nedsat prenylering af begge proteiner, hvorimod deres samlede ekspression forblev uændret (fig. 5C).

HaCaT-celler blev inficeret med shRNA kontrol eller VDR shRNA 3 og biosyntetiske veje blev undersøgt syv dage efter infektion. Mevalonsyre pathway blev evalueret som

de novo

syntese af cholesterol (A) og ubiquinon (B). Værdierne repræsenterer middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. (C) isoprenoidenheder fremstillet efter samme vej blev analyseret som prenyl del inkorporering i den lille GTPaser RhoA og Ras. Kontrol og bragt til tavshed celler blev høstet og lysaterne blev underkastet TX-114 fasen-ekstraktion med henblik på at adskille de prenylerede former. Total og prenylerede proteiner blev analyseret under anvendelse western blotting. VDAC og actin udtryk viste tilsvarende protein belastning af de hydrofobe fase og samlede ekstrakter, hhv. (D) histonacetylering niveauer blev evalueret ved western blotting-analyse under anvendelse af et anti-acetyl H4-antistof og tubulin som en loading kontrol. Blottene er repræsentative for et sæt af tre uafhængige forsøg.

Endelig blev tilgængeligheden af ​​acetylgrupper enheder til biosyntetiske formål evalueret som histonacetylering og VDR lyddæmpning også faldet denne proces, som blev målt som histon H4 acetylering (fig. 5D).

Tilsammen indikerer disse observationer, at efter VDR lyddæmpning, den forøgede respiratoriske kæde aktivitet oxiderer metaboliske mellemprodukter, forhindrer deres anvendelse i biosyntetiske veje. Vi viste den eksemplariske omledning af acetyl-CoA, inkorporeringen af ​​som reduceres under kolesterol biosyntesen, prenylering begivenheder og histon remodeling.

Diskussion

Vores tidligere arbejde i HaCaT celler demonstrerede VDR mitokondrie lokalisering og den mekanisme af import. I den foreliggende undersøgelse identificerede vi en påfaldende vigtig ny rolle for receptoren i organel funktion og cellulær metabolisme, fordi vi påvist, at VDR aktivitet dybt påvirkninger proliferation.

Mitochondriale funktioner er tidligere blevet beskrevet for andre steroidreceptorer, flere af som stimulerer mitokondrielle respiration og anses derfor for at være enten differentiere hormonreceptorer (dvs. skjoldbruskkirtlen receptoren, østrogen receptor beta og androgen receptor) eller udgifter energi forstærkere og udbydere (dvs. den glukokortikoid receptor) [17], [21], [22]. Hormonel stimulus påvirker transkriptionen af ​​mitokondrier kodet OXPHOS både indirekte ved at inducere nukleare signaler (såsom mitokondrielle transkriptionsfaktorer, som positivt regulerer transkription af mitokondrie-genomet), og gælder, ved at lokalisere i organel og interaktion med responselementer i mitokondrie-DNA [ ,,,0],23]. Til dato VDR funktion i mitokondrier forbliver ukarakteriserede.

I den foreliggende undersøgelse, vi påvist, at VDR fremmer proliferation, som dens silencing kraftigt påvirker væksten i HaCaT og andre cancercellelinjer, der udtrykker et mitokondrie VDR. Startende med de tidligere karakteriserede HaCaT celler og udvide vores analyse til andre cellulære modeller, fandt vi, at mitokondrie lokalisering af receptoren er en udbredt karakteristisk for prolifererende celler, og sammenslutningen af ​​VDR med spredning blev forstærket af resultaterne af vores analyse af differentierede celler. Vi observerede nedsat mitokondrie VDR niveauer i to forskellige modeller for differentierede celler (primære kulturer af keratinocytter repræsenterer fysiologisk differentiering, mens miR-206-inducerede RD18 celler repræsenterer en miRNA-drevet differentieret tilstand). Efter vores mening er dette en interessant observation, der berettiger yderligere undersøgelse af den metaboliske effekt og molekylære mekanismer, der styrer VDR nedregulering i hvilende celler.

Forrige litteratur beskrev differentierende egenskaber af D-vitamin, der traditionelt medieret af nukleare virkninger af VDR på transkription. Men cancerceller er ofte resistente over for de antiproliferative og differentierende egenskaber af vitamin D, som følge af den øgede associering VDR med corepressorer på kromatin [24]. Dette er blevet rapporteret for hudkræft, blandt andre [25]. Den humane prolifererende keratinocytcellelinje HaCaT reagerer ikke på den antiproliferative virkning af vitamin D (S1 fig.), Og vi tidligere vist, at nuklear translokation af VDR, hvilket er en forudsætning for transskriptionel aktivitet, ikke induceres ved ligand stimulation [12 ], hvilket således indikerer ineffektive, eller svage, nuklear VDR signalering i disse celler. Derfor HaCaT celler repræsenterer en god model, der kan bruges til at undersøge de mitokondriske virkninger af VDR-aktivitet i en baggrund var de differentierende egenskaber af D-vitamin er blevet tabt.

Genetisk silencing af VDR i HaCaT celler produceret to virkninger, der havde med: reduceret proliferation, der svarede til en stigning i respirationskæden ekspression og mitochondriemembranpotential. Vi havde bevis for, at VDR afbalancerer elektron kæde aktivitet, hvilket resulterer i dobbelte fordele for cellen: beskyttelse mod oxidativ stress og støtte til spredning ved let tilgængelige biosyntetiske mellemprodukter. Den tidligere konklusion blev nået, da vi observerede øgede sårbarhed af tavshed celler til en stærk oxidativ fornærmelse, ledsaget af en nedsat intracellulær GSH pool. Den sidstnævnte fortolkning, den anden store fund af vores arbejde, blev foreslået af eksperimenterne henblik på at evaluere den biosyntetiske kapacitet tavse HaCaT celler. Vi analyserede forskellige biosynteseveje der er afhængige af acetyl-CoA af mitokondrie oprindelse. Acetyl-CoA er en vigtig byggesten for den endogene biosyntese af fedtsyrer og kolesterol og er involveret i isoprenoid-baserede protein-ændringer; acetyl-CoA er også påkrævet for acetylering reaktioner, der modificerer proteiner, såsom histonacetylering. Vi fandt, at VDR knock down celler udviste en indskrænket biosyntetisk hastigheden af ​​mevalonat-vejen, målt som den reducerede produktion af kolesterol og prenylgrupper molekyler, der skal anvendes i protein modifikation. Vi udelukkede, at vi i vore eksperimenter blev sletning positiv modulation af 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A (HMG-CoA) reduktase, et nøgleenzym i mevalonat kaskade fordi niveauerne af et af produkterne af vejen, ubiquinon (CoQ), blev ikke påvirket af VDR lyddæmpning. I stedet har vi tilskrives den hæmmet biosyntetiske sats til nedsat acetyl-CoA tilgængelighed, og denne mulighed blev valideret af den iagttagelse, at VDR lyddæmpning også aftaget histonacetylering. Ufølsomhed ubiquinon syntese til et fald i acetyl-CoA-niveauer, hvilket er kritisk for andre lipider, kan skyldes forskelle i Km-værdier under branche-point enzymer i mevalonat-vejen. Princippet i den klassiske flow omdirigering hypotese angiver, at variationer i størrelsen af ​​forstadiet pool primært vil påvirke cholesterolsyntese fordi Km af squalensynthase for dets substrat er høj, hvorimod alle de andre gren-point enzymer udviser lav Km værdier og hastighedsbegrænsende enzymer af CoQ biosyntetiske gren kan have de laveste Km-værdier. Desværre, fuldstændige oplysninger om CoQ syntese i animalsk væv mangler at blive belyst.

Vi konkluderede, at VDR, ved at indskrænke mitokondrie respiratoriske aktivitet, Reservedele mitokondrielle metaboliske mellemprodukter, som kan ledes over oxidativ metabolisme mod en biosyntetisk skæbne . De slutprodukter, der viste sig at blive påvirket af denne kontakt i nærværende undersøgelse er afgørende for spredning; navnlig kolesterol, som kontinuerligt inkorporeret i membraner, og adskillige rapporter viser, at cholesterogenesis er langt forhøjet i forskellige cancerceller [26] – [28]. Desuden prenylering er en post-translationel modifikation af flere små GTPaser og er afgørende for docking og aktivitet af disse enzymer; hæmmer GTPase aktivitet forstyrrer proliferation, som er blevet grundigt rapporteret for de to små GTPaser, der blev analyseret i den foreliggende undersøgelse, RhoA og Ras, prenyleringen af ​​som er nødvendig for deres evne til at inducere malign transformation, invasion og metastase [29] . Endelig histonacetylering status er et vigtigt aspekt af spredning, fordi det repræsenterer en epigenetisk strategi kontrollerende kromatin remodeling. follows:

5′-CCGGCCTCCAGTTCGTGTGAATGATCTCGAGATCATTCACACGAACTGGAGGTTTTT-3′,

5′-CCGGCTCCTGCCTACTCACGATAAACTCGAGTTTATCGTGAGTAGGCAGGAGTTTTTG-3′,