PLoS ONE: Holdbar tumor udryddelse af kemoterapi zoledronsyre Gendanner Doxorubicin kemosensitivitet og immunogen celledød i multiresistent human Cancer Cells

Abstrakt

celle bliver udfordret af udviklingen af ​​multiresistens-resistens (MDR) og fiasko at inducere immunogen celledød. Formålet med dette arbejde var at undersøge, om MDR og immunogen celledød deler en fælles biokemisk vej vinder modtagelig for terapeutisk intervention. Vi fandt, at mevalonat pathway aktivitet, Ras og RhoA protein isoprenylering, Ras- og RhoA-nedstrøms signalvejen aktiviteter, Hypoxi Inducerbar Factor-1alpha aktivering var signifikant højere i MDR + sammenlignet med MDR- humane kræftceller, hvilket fører til øget P-glycoprotein udtryk, og beskyttelse mod doxorubicin-induceret cytotoksicitet og immunogen celledød. Zoledronsyre, en potent aminobisphosphonate rettet mod mevalonat vej, afbrød Ras- og RhoA-afhængige downstream signalveje, ophævede den Hypoxi Inducerbar Factor-1alpha-drevet P-glycoprotein udtryk, og restaureret doxorubicin-induceret cytotoksicitet og immunogen celledød i MDR + celler. Immunogen celledød recovery blev dokumenteret ved evnen af ​​dendritiske celler til at phagocytise MDR + -celler behandlet med zoledronsyre plus doxorubicin og rekruttere anti-tumor cytotoksiske CD8 + T-lymfocytter. Disse data viser, at MDR + -celler har en hyperaktiv mevalonat-vejen, som er målrettes med zoledronsyre til at antagonisere deres evne til at modstå kemoterapi-induceret cytotoksicitet og undslippe immunogen celledød

Henvisning:. Riganti C, Castella B, Kopecka J, Campia I, Coscia M, Pescarmona G, et al. (2013) zoledronsyre Gendanner Doxorubicin kemosensitivitet og immunogen celledød i multiresistent humane cancerceller. PLoS ONE 8 (4): e60975. doi: 10,1371 /journal.pone.0060975

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA

Modtaget: Januar 24, 2013; Accepteret: 1 Marts 2013; Udgivet: 12 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Riganti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC, www.airc.it, MFAG 11475 til Chiara Riganti, IG 13119 til Massimo Massaia); Italienske universiteter og forskning (www.miur.it; PRIN 2010-2011 til Massimo Massaia, FIRB 2012 til Chiara Riganti); Fondazione Internazionale Ricerche Medicina Sperimentale (www.cerms.it, til Amalia Bosia, Massimo Massaia); Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009 til Chiara Riganti, Amalia Bosia; Progetto Immonc til Massimo Massaia). Joanna Kopecka er modtageren af ​​en “Mario og Valeria Rindi” stipendium fra italiensk Foundation for Cancer Research (FIRC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mevalonat (MeV) pathway er et højt konserveret metabolisk kaskade som producerer steroler, såsom cholesterol, og isoprenoider, såsom farnesylpyrophosphat (FPP) og geranylgeranylpyrophosphat (GGPP). Sidstnævnte er nødvendige for isoprenylering og aktivitet af små G-proteiner, såsom Ras og Rho som styrer celleproliferation, cytoskelet remodeling og angiogenese [1].

Over-ekspression af MEV vej-enzymer er blevet korreleret med en dårlig klinisk resultat i flere humane cancere [2], [3]. Intracellulære cholesterolniveauer kan modulere modstand mod en række anticancerlægemidler, inden for en funktionel fænotype betegnet multilægemiddelresistens-resistens (MDR), som kan være konstitutiv eller induceret efter udsættelse for gentagne behandlinger med ikke-udryddelse kemoterapi [4]. Plasmamembran MDR + tumorceller er særligt rige på kolesterol, som letter aktiviteten af ​​P-glycoprotein (Pgp) [5], en integreret membran transportør ekstrudering kemoterapi lægemidler, såsom anthracycliner, taxaner, Vinca-alkaloider, epipodophyllotoxiner, topotecan og mitomycin C [4]. En anden kendetegnende for MDR + tumorceller er den øgede isoprenylering og aktivitet af G-proteiner, som også er afhængig af hastigheden af ​​Mev pathway aktivitet [6], [7].

mere tyder, at en vellykket og holdbar tumor udryddelse celle er afhængig af evnen af ​​kemoterapi narkotika til at dræbe tumorceller på en måde, som er detekterbar af immunsystemet. Udtrykket immunogene celledød (ICD) er blevet opfundet til at beskrive evnen hos visse lægemidler, såsom doxorubicin (Dox), til at dræbe tumorceller og samtidigt inducere antitumor immunresponser udløses af døende tumorceller [8]. Molekylære vigtige begivenheder i Dox-induceret ICD er den ekstracellulære frigivelse af high-mobilitet gruppe 1 kasse (HMGB1) protein og celleoverfladen translokation af calreticulin (CRT) fra det endoplasmatiske reticulum, hvor det udøver calcium-sensor og chaperone funktioner. Disse hændelser udløser tumorcelle fagocytose med dendritiske celler (DC’er) og den efterfølgende DC-medieret rekruttering af andre immune subpopulationer med antitumoraktivitet [9], [10]. Interessant MDR + -celler er ofte resistente over for ICD [11], som angiver, at tumorceller har råd flere strategier til at overleve og formere sig under kemoterapi-behandlede vært.

Zoledronsyre (ZA) er en aminobisphosphonate meget udbredt i klinikker til forhindre knogleresorption og behandle knoglesygdom i faste tumorer, herunder bryst-, prostata-, lunge- cancer og myelomatose. ZA er en specifik hæmmer af FPP synthase i Mev pathway og udøver pleiotropiske virkninger i tumor- og ikke-tumorceller, såsom osteoklaster, makrofager, endotelceller og immunceller [12], [13]. Disse virkninger skyldes den intracellulære fratagelse af isoprenylated proteiner og /eller akkumulering af isopentenylpyrophosphat hvilket udnyttes til at aktivere Vγ9Vδ2 T-celler, en unik undergruppe af ukonventionelle T-celler med regulerings- og effektorfunktioner mod mikrober, stressede celler og tumorceller [14 ] – [16]

Tidligere data har vist, at ZA øger anti-proliferative effekt af Dox i narkotikarelaterede følsomme tumorceller [17], [18] og er blevet igangsat kliniske studier i brystkræftpatienter til. drage fordel af denne synergi [19]. Men det er i øjeblikket uvist, om ZA har indflydelse på MDR og /eller ICD i tumorceller. Formålet med denne undersøgelse var dobbelt: 1) for at undersøge aktiviteten af ​​Mev pathway og Ras /RhoA-nedstrøms signalveje i MDR- og MDR + tumorceller; 2) at vurdere forholdet, hvis nogen, mellem ZA-induceret Mev pathway inhibering, Dox-induceret cytotoksicitet og ICD modtagelighed. Vi fandt, at en hyper-aktiv Mev vej er ansvarlig for både kemo- og immun-resistens; Takket være inhiberingen af ​​Mev-pathway afhængige signaler, ZA restaureret Dox-induceret cytotoksicitet og ICD i MDR + celler.

Materialer og metoder

Kemikalier

føtalt bovint serum (FBS ) og dyrkningsmedium var fra Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Plast ware til cellekulturer var fra Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). ZA var en gave fra Novartis (Basel, Schweiz). De specifikke inhibitorer af farnesyltransferase FTI-277, geranylgeranyltransferase- GGTI-286 og af RhoA kinase Y27632 blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA). Elektroforese reagenser blev opnået fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Indholdet af cellemonolag og lysater protein blev vurderet med BCA kit fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Medmindre andet er angivet, blev alle andre reagenser købt hos Sigma Chemical Co.

Cellelinjer

Menneskelig tyktarmskræft HT29, lungekræft A549, og brystkræft MCF7 er Dox-følsomme, MDR- tumor cellelinjer (ATCC, Rockville, MD). Dox-resistente modstykker (HT29-DX, A549-DX og MCF7-DX) blev dannet ved at dyrke parentale celler i nærvær af stigende koncentrationer af Dox i op til 20 passager [11], [20], [21]. For det foreliggende arbejde, blev HT29-DX-celler dyrket i medium indeholdende 250 nmol /l Dox, A549-DX-celler i medium indeholdende 100 nmol /l Dox, MCF7-DX-celler i medium indeholdende 0,5 nmol /l, og repræsenterede modeller af erhvervet MDR. Den humane hepatom HepG2-cellelinje (ATCC) og HP06 og HMM cancerceller blev anvendt som prototypiske modeller af celler med en konstitutiv MDR-fænotype og blev beskrevet tidligere ([7], [11], [21], og i alle disse værker HMM celler blev navngivet MM98 celler). Primær HP06 celler (gave Prof. Anna Sapino, Biomedicinsk Institut og onkologi, University of Torino, Italien) blev afledt af det peritoneale metastaser af en kvindelig patient med en invasiv brystkræft, mens primære HMM celler (malignt mesotheliom Biologisk Bank, Azienda Ospedaliera Nazionale, Alessandria, Italien) blev afledt af pleural effusion fra en patient med histologisk bekræftet malignt mesotheliom, efter skriftligt informeret samtykke fra patienterne. Brugen af ​​HP06 celler blev godkendt af bioetiske komité ( “Comitato af Bioetica d’Ateneo”) på universitetet i Torino, Italien; brugen af ​​HMM celler blev godkendt af bioetiske komité ( “Comitato Etico Interaziendale”) af “Azienda Ospedaliera Nazionale SS. Antonio e Biagio e Cesare Arrigo “af Alessandria, Italien. Primære celler blev anvendt ved passagerne 2-4. Alle kulturer blev suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 1% L-glutamin, og holdt i en befugtet atmosfære ved 37 ° C og 5% CO

2.

Intracellulær Dox akkumulering Salg

Intracellulær Dox indhold blev påvist med et fluorimetrisk-baseret assay som beskrevet [20] og udtrykt som nmol Dox /mg celleproteiner ifølge en tidligere fremstillet kalibreringskurve.

realtid polymerasekædereaktion reaktion (RT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret og revers-transkriberet ved hjælp af QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). RT-PCR blev udført med IQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Det samme cDNA-præparat blev anvendt til kvantificering af

MDR1

gen, der koder for humant Pgp, og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), valgt som en husholdning gen. Sekvenserne af

MDR1 Salg primere var: 5′-TGCTGGAGCGGTTCTACG-3 ‘, 5′-ATAGGCAATGTTCTCAGCAATG-3’. Sekvenserne af GAPDH-primere var: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ‘, 5′-CATGGTGGAATCATATTGGAA-3’. Den relative kvantificering af hver prøve blev udført ved at sammenligne de

MDR1

PCR-produkt med GAPDH PCR-produkt med Bio-Rad Software Gene Expression Kvantificering.

De novo

syntese af kolesterol og isoprenoider

Celler blev mærket med 1 uCi /mL

3H-acetat (3600 mCi /mmol; Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) og syntesen af ​​den radiomærkede cholesterol blev FPP og GGPP målt som beskrevet [22]. Resultaterne blev udtrykt som pmol /mg celle proteiner, i henhold til de relative kalibreringskurver.

Ras og RhoA isoprenylering og aktivitet

At påvise isoprenylated membran-associerede Ras eller RhoA proteiner og den ikke- isoprenylated cytosoliske former blev celler lyseret i MLB-buffer (125 mmol /L Tris-HCI, 750 mmol /l NaCl, 1% volumen /volumen NP40, 10% v /v glycerol, 50 mmol /l MgCl

2, 5 mmol /l EDTA, 25 mmol /l NaF, 1 mmol /l Navo

4, 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /ml pepstatin, 10 ug /ml aprotinin, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid, pH 7,5) og centrifugeret ved 13 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. En alikvot af supernatanten blev udtaget til Western blot af total Ras og RhoA, mens den resterende del blev centrifugeret ved 100 000 x g i 1 time ved 4 ° C; både supernatanten (cytosoliske ekstrakter) og pelleten (membranfraktioner) blev solubiliseret i Laemli-buffer (125 mmol /L Tris, 4% vægt /vol SDS, 20% v /v glycerol og 1% vægt /vol β-mercaptoethanol) og underkastet Western blotting under anvendelse af et anti-Ras (Millipore, Billerica, MA) og et anti-RhoA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) antistof. Til bedømmelse Ras og RhoA aktivitet, GTP-bundne fraktion, tages som et indeks for aktive G-proteiner [23] blev målt under anvendelse af en pull-down assay (med Raf-1-GST-fusionsprotein, agaroseperler-konjugater, Millipore) og et ELISA-assay (med G-LISA ™ RhoA Activation assay Biochem Kit, Cytoskeleton Inc., Denver, CO), henholdsvis som tidligere beskrevet [22].

RhoA kinaseaktivitet

RhoA kinase aktivitet blev evalueret med CycLex Rho kinase Assay Kit (CycLex Co, Nagano, Japan) efter producentens anvisninger [22].

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i MLB buffer, lydbehandlet og centrifugeret ved 13 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. 10 ug cellelysater blev underkastet Western blotting og probet med de følgende antistoffer: anti phospho- (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 (Millipore); anti-ERK 1/2 (Millipore); anti-Hypoxi inducible factor-1α (HIF-1α, BD Bioscience, San Jose, CA); anti-Pgp (Santa Cruz Biotechnology Inc.); anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc.), efterfulgt af de sekundære peroxidasekonjugerede antistoffer (Bio-Rad). Proteiner blev påvist ved forøget kemiluminescens (PerkinElmer, Waltham, MA).

For at vurdere HIF-1α phosphorylering, den helcellelysat blev immunpræcipiteret med et polyklonalt anti-HIF-1α antistof (Santa Cruz Biotechnology Inc.), derefter probet i 1 time med et biotin-konjugeret anti-phosphoserin-antistof (Sigma Chemical Co.) efterfulgt af polymere streptavidin-peberrodsperoxidase-konjugater (Sigma Chemical Co.).

HIF-1α transkriptionel aktivitet

nukleare proteiner blev ekstraheret under anvendelse af kerneekstrakt Kit (Active Motif, Rixensart, Belgien). Aktiviteten af ​​HIF-1 på 10 ug kerneekstrakter blev vurderet med Transam ™ HIF-1 Transcription Factor Assay Kit (Active Motif). For hvert sæt af eksperimenter, blank (med dobbelt-destilleret vand), negativ kontrol (med muteret oligonukleotid) og konkurrence assay (ved hjælp af 20 pmol af vildtype oligonukleotidet med nukleare ekstrakter af HMM celler dyrket på 3% O

2 for 24 h) blev medtaget. I hypoxiske betingelser, HIF-1-aktivitet var 257,53 ± 3,77 mU /mg prot; i konkurrence-assayet, blev det tilsvarende HIF-1-aktivitet reduceret til 33.14 ± 1.39 mU /mg prot (n = 5). Dataene blev udtrykt som mU absorbans /mg celle proteiner.

chromatin Immunfældning (chip) eksperimenter for at måle bindingen af ​​HIF-1α på “Hypoxi Responsive Element” af

MDR1

promotor var udført som rapporteret andetsteds [24].

Cytotoksicitetsassay

lactatdehydrogenase (LDH) -aktivitet blev målt i det ekstracellulære medium og i cellelysatet som beskrevet [20]. For at måle den ekstracellulære frigivelse af HMGB1 blev 20 pi af cellerne dyrkningsmediet kogt, opløst ved SDS-PAGE og sonde med et anti-HMGB1 antistof (Sigma Chemical Co.). Blots blev præ-farvet med røde Ponceau at kontrollere lige belastning af proteiner. ATP frigivelse blev målt på 100 pi af cellekulturmedium med ATP Bioluminescent Assay Kit (FL-AA, Sigma-Aldrich Co.), under anvendelse af en Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT). Resultaterne blev udtrykt som nmol ATP /ml, ifølge den tidligere indstillede titreringskurven.

Analyse af celleoverflade CRT

Celler blev inkuberet i 45 minutter (4 ° C) med et anti- CRT-antistof (Affinity Bioreagents, Rockford, IL), som rapporteret i [11] og analyseret ved anvendelse af en FACS-Calibur-system (BD Biosciences). For hver analyse 100.000 hændelser blev indsamlet. Procentdelen af ​​CRT-fluorescerende levedygtige celler (propidiumiodid-negative) blev beregnet med Cell Quest software (BD Biosciences). Kontrolforsøg inkluderet inkubere celler med ikke-immune isotypiske antistoffer efterfulgt af passende sekundære antistof. Flowcytometri resultater blev bekræftet ved biotinyleringsbetingelserne assays [25], under anvendelse af Cell Surface Protein isolation kit fra Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). Punktet af biotin i celler blev udelukket ved at kontrollere fraværet af cytosoliske proteiner (GAPDH, actin) i biotinylerede ekstrakter (ikke vist).

dendritiske celle (DCS) generation og

in vitro

fagocytose assay

DCs blev genereret fra perifere blodprøver opnået fra raske donorer venligt leveres af den lokale Blood Bank (Fondazione Strumia, Torino, Italien), som tidligere rapporteret [11]. Celler blev høstet på dag 6 og bekræftet som umodne DC’er ved morfologi og immunofænotype.

MDR- HT29 og MDR + HT29-DX og HMM celler blev grøn-farvet med PKH2-FITC (Sigma Chemical Co.), vasket to gange og inkuberet med i et forhold på 1:01 i 18 timer ved 37 ° C. Co-kulturer blev derefter farvet i 20 minutter ved 4 ° C med APC-konjugeret HLA-DR-antistof (Miltenyi Biotec, Tetrow, Tyskland) for at markere DC’er. To-farve flowcytometri blev udført med en FACScan cellesorteringsapparat og CellQuest software (Becton Dickinson). Mindst 10.000 begivenheder blev akkumuleret specifikt backgating på DC morfologi (område 1: FSC versus SSC). Tumorcelleresistens fagocytose blev vurderet som procentdelen af ​​dobbeltstrengede farvet (FITC plus APC) celler. Tumor celler udtrykker ikke betydelige mængder af HLA-DR, og de er udelukket fra region 1 ved deres morfologi. I hvert sæt af eksperimenter blev en fagocytose-assay udført ved co-inkubering DC’er og tumorceller ved 4 ° C i stedet for 37 ° C, og procentdelen af ​​dobbeltstrengede farvede celler opnået efter inkubation ved 4 ° C blev subtraheret fra værdierne observeret ved 37 ° C. Fagocytose rate blev udtrykt som en fagocytisk indeks, beregnet som tidligere rapporteret [9].

I fluorescensmikroskopi assays blev PKH2-FITC grønskede tumorceller inkuberet i 6 timer eller 24 timer ved 37 ° C med 1 × 10

5 DC’er ved en 1:01 ratio. Co-kulturer blev cytospun ved 1500 x g i 5 minutter på glas følgesedler, fikseret med 4% vægt /volumen paraformaldehyd, vasket og farvet med en mus polyklonalt anti-MHCII antistof (Thermo Fisher Scientific Inc.). Efter vask blev prøverne inkuberet med et Alexa Fluor 350-conjuganted gede-anti-muse-IgG-antistof (Invitrogen) i 1 time ved stuetemperatur, vasket, monteret med Gel Mount Vandig Montering og undersøges under et fluorescensmikroskop, som beskrevet ovenfor.

DC-medieret CD8 + T-cellestimulering

efter tumorcelle fagocytose, DC’er blev vasket og co-dyrket med autologe T-celler, isoleret fra CD14-celler ved immunomagnetisk sortering med Pan T-celle Isolation Kit (Miltenyi Biotec). DC og T-celler blev co-dyrket i 10 dage i et forhold på 1:05 i komplet medium suppleret med IL-2 (10 U /ml). På dag 10 blev CD107 ekspression på CD8 + -T-celler bestemt ved flowcytometri til bestemmelse af aktiveringen af ​​tumorspecifikke cytotoksiske T-celler [26]. Mindst 100.000 hændelser i lymfocyt porten blev erhvervet og analyseret af tofarvet flowcytometri. Tumorcelledød induceret af CD8 + T-celler blev også kvantificeret ved CFSE-mærkning, måling af procentdelen af ​​HT29-DX-celler dobbelt-positive for CFSE og propidiumiodid som tidligere beskrevet [14], [15].

Statistiske analyse

Alle data i tekst og figurer er givet som middelværdi ± SD. Resultaterne blev analyseret ved en envejs variansanalyse (ANOVA) med

P

0,05 som betydningen cut-off. Den r koefficient blev beregnet med Fig.P software (Fig.P Software Inc., Hamilton, Canada).

Resultater

Sammenhæng mellem

MDR1

udtryk og Mev pathway aktivitet

Intracellulær Dox fastholdelse,

MDR1

mRNA-niveauer, og kolesterol syntese blev målt som markører for Pgp aktivitet Pgp udtryk, og Mev pathway aktivitet i HT29, A549, MCF7-celler (MDR- celler) , HT29-dx, A549-dx, MCF7-DX-celler (erhvervet MDR + -celler) og HepG2-celler, HP06, HMM celler (konstitutive MDR + celler) henholdsvis. Både erhvervet og konstitutive MDR + celler bibeholdt betydeligt mindre Dox (figur 1A) og viste højere

MDR1

mRNA-niveauer (figur 1B) end MDR- celler. Cholesterolsyntese var også signifikant højere i MDR + end i MDR- celler (figur 1C). Forskellene mellem erhvervet og konstitutive MDR + celler var ikke statistisk signifikante, selvom sidstnævnte tendens til at fastholde mindre Dox, at udtrykke mere

MDR1

mRNA-niveauer, og at generere mere kolesterol end førstnævnte. Der blev observeret en meget signifikant sammenhæng mellem hastigheden af ​​kolesterol syntese og

MDR1

mRNA-niveauer (Figur 1D).

A. Intracellulær doxorubicin (Dox) koncentrationer i MDR- celler (HT29, A549 og MCF7), i de tilsvarende erhvervede MDR + modstykker (HT29-DX-celler, A549-DX celler, MCF7-DX), og konstitutive MDR + celler (HepG2, HP06, HMM ). Markant blev fundet lavere koncentrationer i celler med erhvervet MDR

vs

MDR- celler (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,001; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,001), og i celler med konstitutive MDR

vs

MDR- celler (middelværdi af intracellulær doxorubicin i HepG2 /HP06 /HMM

vs

middelværdi i HT29 /A549 /MCF7: ° p 0,001). B.

MDR1

mRNA-ekspression. Væsentlige højere

MDR1

niveauer blev observeret i celler med erhvervet MDR

vs

MDR- celler (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,002; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,001), og i celler med konstitutive MDR

vs

MDR- celler (middelværdi af

MDR1

niveauer i HepG2 /HP06 /HMM

vs

middelværdi i HT29 /A549 /MCF7: ° p 0,001). C. Rate af kolesterol syntese. Signifikant højere aktivitet blev målt i celler med erhvervet MDR

vs

MDR- celler (HT29-dx

vs

HT29: * p 0,002; A549-dx

vs

A549: * p 0,002; MCF7-dx

vs

MCF7: * p 0,002), og i celler med konstitutive MDR

vs

MDR- celler (middelværdi af kolesterol syntese i HepG2 /HP06 /HMM vs gennemsnitsværdi i HepG2 /HP06 /HMM: ° p 0,001). D. Direkte sammenhæng mellem hastigheden af ​​kolesterol syntese og ekspressionsniveauerne af

MDR1

i individuelle cellelinjer (r

2 = 0,95). Til paneler A, B, og C søjler repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige forsøg.

ZA inhiberer Mev-afhængige signaleringsveje i MDR + celler

ZA blev anvendt til at undersøge effekt af Mev pathway hæmning i HT29, HT29-DX og HMM celler, som blev udvalgt som prototypiske modeller af MDR- overtog MDR + og konstitutive MDR + tumorceller hhv.

ZA inducerede en dosis- (figur 2A, venstre panel ) og tidsafhængig (figur 2A, højre panel) reduktion af cholesterol syntese med en signifikant inhibering ved 1 pmol /L, som var mere tydelig i MDR + HT29-DX og HMM celler end MDR- HT29-celler (figur 2A). Én pmol /L ligner også serumkoncentrationen observeret i patienter, der fik ZA ved klinisk godkendte doser [27], [28] og derfor denne koncentration blev anvendt gennem hele undersøgelsen.

MDR- HT29, og MDR + HT29 -dx og HMM celler blev dyrket uden (CTRL) eller med zoledronsyre (ZA). Til paneler B-E, ZA (1 pmol /l) blev anvendt i 48 timer, FTI-277 (10 pmol /l, FTI), GGTI-286 (10 pmol /l, GGTI), Y27632 (10 pmol /l, Y276) i 24 timer. A.

Venstre panel

: dosisafhængig inhibering af cholesterolsyntese i celler behandlet med 0,01-10 umol /L ZA i 24 timer. Inhibering var statistisk signifikant i HT29 (* p 0,001), HT29-dx (° p 0,01) d HMM celler (

◊p 0,005)

vs

basislinieværdier (0).

Right panel

: tidsafhængig hæmning af kolesterol syntese i celler behandlet med 1 mmol /l ZA for 24-72 timer. Inhibering var statistisk signifikant i HT29 (* p 0,001), HT29-dx (° p 0,0001) og HMM celler (

◊p 0,001)

vs

basislinieværdier (0). For begge paneler: HT29-dx /HMM

vs

HT29: * p 0,001. B. MDR + celler syntetiseret højere mængder af FPP (

venstre panel

) og GGPP (

højre panel

) end MDR- celler (* p 0,005). ZA sænket betydeligt FPP syntese

vs

ubehandlede (CTRL) celler (HT29: * p 0,001; HT29-dx: ° p 0,002; HMM:

◊p 0,001) og GGPP syntese

vs

ubehandlede (CTRL) celler (HT29: * p 0,02; HT29-dx: ° p 0,001; HMM:

◊p 0,005). C. MDR + celler viste en ulige fordeling mellem isoprenylated membranbundne (

M

) og ikke isoprenylated cytosol (

C

) Ras (

venstre panel

) og RhoA (

højre

panel) i forhold til MDR- celler. ZA behandling øget mængden af ​​cytosolisk Ras og RhoA.

T

: mængde af Ras og RhoA i helcellelysater. D. ZA faldt Ras-aktivitet, målt som Ras-GTP beløb, og phospho- (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 beløb. GAPDH data er vist at bekræfte ækvivalent protein loading. E. MDR + celler havde signifikant højere mængder af RhoA-GTP (

åbne barer

) og RhoA kinase (

skraverede søjler

) end MDR- celler (* p 0,005); ZA faldt både RhoA-GTP og RhoA kinase

vs

ubehandlede (CTRL) celler (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:

◊p 0,02). De i paneler C og D resultaterne er repræsentative for 3 eksperimenter. I panel A, B og E resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD af 3 eksperimenter.

Ifølge hyperaktiv Mev pathway, MDR + HT29-dx og HMM celler viste højere FPP (figur 2B , venstre felt) og GGPP (figur 2B, højre panel) syntese end MDR- HT29-celler. Både MDR- og MDR + celler havde påviselige mængder af isoprenylated, membranbundet Ras og ikke-isoprenylated, cytosolisk Ras, selv om førstnævnte var stort set fremherskende i MDR + celler som følge af den øgede FPP forsyning begunstige Ras isoprenylering (figur 2C, venstre panel ). Membranbundet og cytosoliske RhoA viste også et lignende mønster i MDR + HT29-dx og HMM

vs

MDR- HT29-celler som følge af den øgede GGPP produktion og RhoA isoprenylering (figur 2C, højre panel).

Overskuddet af membranbundne Ras og RhoA resulterede i øget aktivitet af de tilsvarende nedstrøms signalveje: intracellulære niveauer af GTP-bundet Ras (figur 2D), en markør for Ras-aktivering, og ERK1 /2 phosphorylering (figur 2D ), samt mængden af ​​GTP-bundne RhoA (Figur 2E) og aktiviteten af ​​RhoA kinase (figur 2E) var højere i MDR + HT29-dx og HMM celler end MDR- HT29 celler.

ZA behandling ophævet forskellene mellem MDR- og MDR + -celler. Ved at hæmme FPP og GGPP syntese (Figur 2B), ZA faldt mængderne af membranbundne Ras og RhoA (figur 2C), intracellulære Ras-GTP og RhoA-GTP indhold og aktiviteten for deres nedstrøms signalveje (Figur 2D-E ). Disse virkninger var mere tydelig i MDR + HT29-dx og HMM celler end MDR- HT29 celler i henhold til deres Mev pathway aktivitet.

ZA nedsætter Pgp udtryk ved at reducere HIF-1α aktivering via Ras /ERK1 /2- og RhoA /Rho-a kinase nedregulering

HIF-1α, en mester regulator af flere gener, herunder

MDR1

[29], kan blive konstitutivt aktiveret, selv under normoxiske betingelser upon Serin fosforylering af RhoA kinase [30 ] og MAP-kinaser [31]. Phosphorylerede (pHIF-1α) og ikke-phosphorylerede HIF-1α kunne ikke påvises ved Western blot i MDR- HT29 celler, hvorimod både pHIF-1α og HIF-1α blev udtrykt i MDR + HT29-dx og HMM celler (figur 3A). HIF-1α var transkriptionelt aktiv i MDR + celler, som vist med signifikant højere mængder af nuklear HIF-1 bundet til dens specifikke DNA målsekvens (figur 3B). ZA havde ingen effekt på MDR- celler, mens det reduceret mængden af ​​pHIF-1α og sænkes alt HIF-1α niveauer og aktivitet i MDR + celler (figur 3A-B).

A. Påvisning af phosphoryleret (pHIF-1α) og total HIF-1α i MDR- HT29, og MDR + HT29-dx og HMM celler efter 48 timers inkubation uden (CTRL) eller med en pmol /L ZA (ZA). B. HIF-1-aktivitet var højere (* p 0,001) i MDR + HT29-DX og HMM celler end HT29-celler. Efter ZA behandling (som rapporteret i A), et signifikant fald i HIF-1-aktivitet blev observeret i HT29-dx (° p 0,001) og HMM celler (

◊p 0,001). C. chromatin immunopræcipitation af HIF-1α på

MDR1

promotor i MDR- og MDR + celler, behandles som rapporteret i en.

pro MDR1

: PCR-produkt fra immunopræcipiterede prøver.

Input

: PCR-produkt fra ikke immunopræcipiterede prøver (genomisk DNA).

ikke Ab

: prøver inkuberet i fravær af anti-HIF-1α antistof. “-“: blank. D. Western blotting påvisning af Pgp i celler behandlet som beskrevet i AE Intracellulær doxorubicin blev målt spectrofluorimetrically: betydeligt blev fundet lavere koncentrationer i HT29-dx og HMM

vs

HT29-celler (* p 0,002), signifikant højere koncentrationer i ZA-behandlede celler

vs

ubehandlede (CTRL) modstykker (HT29-dx: ° p 0,02; HMM:

◊p 0,02). Resultaterne vist i panel A resultater, C og D er repræsentative for 3 eksperimenter. For paneler B og E søjlerne repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige forsøg.

HIF-1α blev konstitutivt bundet til Hypoxi Respons Element af

MDR1

promoter i MDR + celler HT29-dx og HMM celler, men ikke i MDR- HT29-celler (figur 3C). Dette forklarer, hvorfor udtryk for PGP protein var kun påvises i MDR + celler (Figur 3D), og hvorfor disse celler viste signifikant lavere Dox retention end MDR- celler (Figur 3E).

ZA behandling effektivt ophævet HIF-1α -bindende til

MDR1

promotor (figur 3C) og Pgp udtryk (figur 3D), og væsentligt forøgede intracellulære Dox niveauer i MDR + HT29-dx og HMM celler, som blev sammenlignelig med det i MDR- HT29 celler ( Figur 3E). Intracellulær Dox tilbageholdelse i MDR + celler var signifikant forøget, når ZA blev administreret før Dox, men hverken

omvendt

, eller når de to lægemidler blev brugt sammen (Figur S1).

For at give yderligere bevis at ZA-induceret Pgp nedregulering i MDR + -celler var afhængig af pHIF-1α suppression via ERK1 /2 og RhoA kinaseinhibering, blev udført side om side eksperimenter i nærvær af specifikke inhibitorer af ERK1 /2-kinaser (PD98059) , RhoA kinase (Y27632) og HIF-1 (YC-1). I MDR + HMM celler disse inhibitorer viste de samme virkninger ZA i form af pHIF-1α niveauer (figur 4A), HIF-1 transkriptionel aktivitet (figur 4B), Pgp-ekspression (figur 4C), og Dox tilbageholdelse (figur 4D).

A. Phospho (Ser) -HIF-1α (pHIF-1α) og total HIF-1α ekspression i HMM celler lades ubehandlet (CTRL) eller behandlet i 24 timer ved 10 umol /L med ERK1 /2 kinaseinhibitor PD98059 (PD), RhoA kinaseinhibitor Y27632 (Y27), HIF-1α inhibitor YC-1 (YC), og 1 pmol /L ZA i 48 timer. GAPDH data er vist at bekræfte ækvivalent per bane protein loading. B. HIF-1-aktivitet i HMM celler ubehandlet (CTRL) eller behandles som rapporteret i panel A. Alle forskelle mellem behandlede

vs

ubehandlede celler er statistisk signifikant (* p 0,01).