Abstrakt
Ud over genetiske ændringer, er forekomsten af epigenetiske ændringer i forbindelse med ophobning af både genetiske og epigenetiske begivenheder, der fremmer udviklingen og progressionen af human cancer. Tidligere rapporterede vi et sæt kandidatgener, der omfatter en del af den nye “kræft methylome”. I den foreliggende undersøgelse, vi først testet 23 kandidatgener for promotor-methylering i et lille antal primære kolon tumorvæv og kontroller. Baseret på disse resultater, vi så undersøgt methylering hyppigheden af
Oncostatin M receptor-β Hotel (
OSMR
) i et større antal væv og afføring DNA-prøver indsamlet fra patienter med tyktarmskræft og kontroller. Vi fandt, at
OSMR
blev hyppigt methyleret i primær tyktarmskræft væv (80%, 80/100), men ikke i normale væv (4%, 4/100). Methylering af
OSMR
blev også påvist i afføringen DNA fra patienter med tyktarmskræft (38%, 26/69) (cut-off i TaqMan-MSP, 4). Påvisning af andre denatureret markører i afføringen DNA forbedret følsomhed med ringe effekt på specificitet. Promotor methylering medieret lyddæmpning af
OSMR
i cellelinjer, og CRC celler med lav
OSMR
udtryk var resistente over for væksthæmning af Oncostatin M. Vores data giver en biologisk rationale for dæmpning af
OSMR
i tyktarmskræft progression og fremhæve en ny terapeutisk mål i denne sygdom. Desuden detektion og kvantificering af
OSMR
promotor methylering i fækal DNA er en meget specifik diagnostisk biomarkør for CRC
Henvisning:. Kim MS, Louwagie J, Carvalho B, Terhaar tende Droste JS, Park HL, Chae YK, et al. (2009) Promotor DNA Methylering af
Oncostatin M receptor-p
som en roman diagnostisk og terapeutisk Marker i tyktarmskræft. PLoS ONE 4 (8): e6555. doi: 10,1371 /journal.pone.0006555
Redaktør: Jonathan Weitzman, Université Paris-Diderot, Paris 7, Frankrig
Modtaget: Februar 6, 2009; Accepteret: 30 juni 2009; Udgivet: 7 August, 2009
Copyright: © 2009 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute (U01-CA84986) og Oncomethylome Sciences, SA, og hollandske Cancer Society (projekt nummer RUG 2004-3161). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Under en licensaftale mellem OncoMethylome Sciences, SA og Johns Hopkins University, Dr. Sidransky har ret til en andel af royalty modtaget af universitetet på salget af produkter, der beskrives i denne artikel. Dr. Sidransky ejer OncoMethylome Sciences, SA bestand, der er underlagt visse restriktioner under University politik. Dr. Sidransky er en betalt konsulent til OncoMethylome Sciences, SA og er en betalt medlem af selskabets Scientific Advisory Board. Varigheden af dette arrangement bliver forvaltet af Johns Hopkins University i overensstemmelse med sin interessekonflikter politikker.
Introduktion
Kolorektal cancer (CRC) er en af de mest almindelige kræftformer blandt mænd og kvinder og tegner sig for 10% af alle nye kræfttilfælde og kræftdødsfald hvert år [1]. Den samlede 5-årige overlevelsesrate fra tyktarmskræft er steget i løbet af de sidste 20 år på grund af tidlig påvisning af øget screening. På trods af store fremskridt, er der stadig behov mere avanceret viden om den molekylære patogenese CRC eller vigtige miljømæssige /kostfaktorer i CRC udvikling. Desuden vil finde potentielle diagnostiske markører og terapeutiske mål for CRC støtte i tidlig påvisning og behandling af tyktarmskræft. De fleste CRC’er skyldes adenomatøs forstadier, og akkumulering af gain-of-funktion mutationer i proto-onkogener og tab af funktion mutationer i tumorsuppressorgener (GTS) fører til progression af adenomatøse læsioner til karcinom [2], [3], [4].
Ud over genetiske ændringer involverer mutationer af onkogener og GTS, kræftfremkaldende progression fra godartet neoplasme til adenocarcinom kan ske gennem epigenetiske ændringer i genpromotorer [5]. Afvigende genekspression er karakteristisk for menneskelige kræftformer, og ændringer i DNA-status methylering kan have dybtgående virkninger på ekspression af gener. GTS display både genetiske og epigenetiske inaktivering i humane tumorer, og den transkriptionelle lyddæmpning af GTS har etableret hypermethylering som en fælles mekanisme for tab af GTS-funktion i humane kræftformer [6], herunder tyktarmskræft [7], [8]. Således kan viden om methylering mønstre hele genomet med til at identificere de vigtigste GTS inaktiveret under tumordannelse [9], [10], [11].
Vi har tidligere rapporteret et sæt kandidatgener, der omfatter en del af den nye “kræft methylome” ved hjælp af en ny promotor struktur algoritme og microarray data genereret fra 22 cancer cellelinjer afledt form, 5 store cancertyper [12]. I denne tidligere undersøgelse, undersøgte vi nyligt identificerede cancer-specifikke methylerede gener i et panel på 300 primære tumorer, der repræsenterer 13 typer af kræft. På baggrund af de data, blev antallet af kendte cancer-specifikke methylerede gener er steget med ca. 40%.
I den foreliggende undersøgelse, vi re-undersøgt status methylering af kræft-specifikke methylerede gener i et større antal væv og afføring DNA fra patienter tyktarmskræft samt patienter uden kræft. Vi fandt, at
Oncostatin M receptor-β Hotel (
OSMR
) og
β-1,4-galactosyltransferase-1 Hotel (
B4GALT
) var meget methylerede i primære CRC væv, men sjældent i tilsvarende normale tilstødende slimhinde eller i ikke-maligne normale colon væv. Methylering af disse gener blev også påvist i afføringen DNA fra patienter coloncancer, men generelt fraværende fra patienter uden cancer. Desuden
OSMR
og
B4GALT
mRNA-ekspression i tyktarmskræft væv var signifikant nedreguleret i forhold til normale væv. Funktionelle undersøgelser afslørede en undertrykkende rolle for
OSMR
i tyktarmskræft progression. Derfor
OSMR
methylering er biologisk relevant og kan ofte påvises i primære CRC tumorer og matches skammel DNA.
Resultater
microarray analyse i tre humane coloncancer-cellelinjer ( HCT116, HT-29 og DLD1) identificerede 52 potentielle gen-mål baseret på reaktivering efter behandling med 5-aza-dC [12]. Af disse 52 gener,
sirtuin 2
(
SIRT2
) blev talt to gange i vores kandidat gen liste, fordi den har to forskellige gen identifikationsnumre (NM_012237 og NM_030593) i NCBI-databasen. Desuden
O6-methylguanin-DNA methyltransferase
(
MGMT
) blev tidligere rapporteret at huse kræft-specifikke promotor methylering på flere typer af kræft, herunder tyktarmskræft [9], så vi udelukket
MGMT
fra vores videre analyse (52 -2 = 50).
Udskilt frizzlede relateret protein 4
(
SFRP4
) er tidligere rapporteret at methyleres i tyktarmskræft [16], [17] og blev inkluderet som en positiv kontrol for gen methylering i vores undersøgelse.
neurotrophin tyrosinkinasereceptor type 2 Hotel (
NTRK2
) og
urokinase plasminogenaktivator
(
Plau
) blev også medtaget, fordi ingen rapporter om methylering af de to gener i tyktarmskræft er endnu ikke offentliggjort. Vi undersøgte derfor status methylering af i alt 50 gener ved bisulfit-sekventering eller C-MSP i colon cancer cellelinjer (HCT116, DLD1, RKO, og SW480) (figur S1). Som et resultat fandt vi 23 gener, der skal methyleres i mere end én cellelinje (tabel 1). Methylering i de øvrige 27 gener blev ikke påvist i nogen af de testede cellelinier.
For at identificere gener, der huser cancer-specifik promotor methylering undersøgte vi status methylering af 23 gener i fem til ti par af matchede primære CRC (PT) og tilsvarende normale colon (PN) væv. Normale kolon mucosa væv fra ikke-kræftpatienter (NN) blev også inkluderet for at sammenligne methylering specificitet mellem kræft og ikke-kræftpatienter. Vi ekskluderede gener, der nærede methylering i NN med frekvenser højere end 30%. Som et resultat, vi fandt, at
3′-phosphoadenosin 5′-phosphosulfat syntase 2 Hotel (
PAPSS2
),
γ-tubulin gen 2 Hotel (
TUBG2
),
NTRK2
,
B4GALT1
, og
OSMR
samt
SFRP4
nærede kræftspecifikke methylering med høje frekvenser ( 30 %) (tabel 2). Alle 6 af disse gener ikke harbor methylering i alt NN testet, og forskelle i NN
vs.
PT og methylering
vs.
Unmethylation sager var statistisk signifikante. Repræsentative resultater af C-MSP, bisulfit-sekvensering, og COBRA i cellelinjer og væv er vist i figur 1A og figur S2.
A blev status for methylering af hvert gen undersøges i CRC cellelinjer og væv ved C -MSP efter PCR med methylering-specifikke primere. PCR-produkter blev kørt på 4% agarosegeler forud farvet med ethidiumbromid.
In vitro
methyleret, blev behandlet med bisulfit humant normalt lymfocyt DNA (NL) anvendt som en positiv kontrol for PCR, og destilleret vand (DW) blev anvendt som en negativ PCR-kontrol.
β-actin
blev anvendt til at bekræfte integriteten af DNA.
SLC39A4
SLC9A3R1
blev methyleret både i cellelinjer og væv, men
GANAB
,
Plau
og
UBE3A
ikke var . De øvrige 5 gener blev methyleret på en af tre cellelinier testet, og kun methyleret i CRC væv (PT). PN, parret normale colon væv fra patienter med tyktarmskræft; PT, parret CRC; NN, normal colon epitel fra patienter uden kræft. C-MSP resultater af
OSMR
i CRC-cellelinjer og væv blev vist i en tidligere rapport [12]. B, Scatter plots af methylering værdier på seks kandidatgener i væv og cellelinier (CL). De overordnede methylering værdier (TaqMan methylering værdier, TaqMeth V) og den optimale specificitet /følsomhed ved optimale cut-offs beregnet ud fra ROC-analyse er vist i tabel 3. Pile angiver de optimale afskæringsværdier for hvert gen. Ingen tilfælde af NN vises TaqMeth V over optimale cut-offs for
B4GALT1
OSMR
. HEK293, en ikke-tumorigen cellelinie, rummede et højt
B4GALT1
methylering (TaqMeth V, 101,12), men
OSMR
methylering blev ikke påvist i cellelinjen (TaqMeth V, 0,00 ). *, Prøver med et forhold lig med nul kunne ikke afbildes korrekt på en logaritmisk skala, så præsenteres her som 0,1. Alle assays blev udført in duplo format, og forsøg blev gentaget to gange. Data viste reproducerbare og overensstemmende resultater i tre eksemplarer. TaqMeth V er beskrevet i Materialer og Metoder. C, kvantitative methylering niveauer af
B4GALT1
OSMR
i primære kolon væv. Scatter plot af
B4GALT1
OSMR
promotor methylering. Pile angiver optimale afskæringsværdier for hvert gen (3,877 til
B4GALT1
og 22,01 for
OSMR
).
At studere promotor methylering af disse 6 gener ved TaqMan-MSP real-time analyse, vi designet primere og prober specifikt rettet mod CpG øer hvert gen (figur S3). Vi øgede prøven numre til over 25 par af primær CRC (PT) og tilsvarende normale colon (PN) væv, og til 13 normale kolon mucosa væv fra patienter ikke-cancer (NN). Fordelingen af methylering værdier for hver genet er vist i figur 1B. På grund af heterogene klonede patches kendt for at ekspandere ud over tumor grænser, blev et lavt niveau af methylering i PN også almindeligt forekommende. De overordnede methylering værdier (TaqMan methylering værdier, TaqMeth V) er vist i tabel 3.
B4GALT1
OSMR
nærede højere niveauer af den samlede methylering i PT end i PN og NN, og forskelle var signifikante for begge gener mellem PT og PN (
P 0,001
) og mellem PT og NN (
P 0,001
). Når methylering værdier blev sammenlignet inden for de enkelte par af PN og PT prøver, signifikant højere methylering niveauer af
PAPSS2 TUBG2
,
NTRK2
, og
SFRP4
blev fundet i 60% ( 18/30), 50% (15/30), 30% (9/30), og 36% (11/30) i henholdsvis PN end i tilsvarende tumorprøver (PT). Højere methylering niveauer af
B4GALT1
i PN prøver blev fundet kun i 4 tilfælde (13,3%, 4/30), og methylering af
OSMR
blev ikke fundet i nogen af de parrede normaler (0 %, 0/25).
Methylering af de 6 gener i væv viste særdeles diskriminerende receiver-operatør karakteristiske (ROC) kurve profiler, klart skelne CRC (PT) fra normal colon mucosa (NN) (
P 0,001
) (Figur S4A). AUROC (område under ROC) var over 0,76 i alle testede gener. For at maksimere sensitivitet og specificitet blev de optimale cut-offs for de 6 gener beregnet ud fra ROC analyse (PT
vs
. NN) og er vist i tabel 3. Ved cut-offs fastsat for optimal specificitet på 90% eller mere, skal følsomheden af hvert gen i PT var over 70%. Ingen tilfælde af NN vises TaqMeth V over optimale cut-offs for
B4GALT1
OSMR Hotel (100% specificitet). De følsomheder af
B4GALT1
OSMR
var 83% (25/30) og 80% (20/25), hhv. Disse resultater viser, at
B4GALT1
OSMR
harbour kræftspecifikke methylering i CRC med høj frekvens. Derfor har vi fokuseret på
B4GALT1
OSMR
til yderligere undersøgelse.
Vi undersøgte status methylering af
B4GALT1
OSMR
i 100 nye par CRC (PT) og tilsvarende normale (PN) væv ved TaqMan-MSP-analyse (fig. 1C). Den TaqMeth V i PT varierede 0-370,70 (median værdi 3.70) for
B4GALT1
0-749,27 (median værdi 59,24) for
OSMR
. Værdien i PN varierede 0-9,70 (median værdi 0,26) for
B4GALT1
til 190,68 (median værdi 1,54) for
OSMR
. De samlede methylering niveauer af
B4GALT1
OSMR
påvist i PT (22,33 ± 48,69 til
B4GALT1
og 116,83 ± 151,52 for
OSMR
, gennemsnit ± SD, n = 100) var også væsentligt højere end i PN (0,90 ± 1,37 for
B4GALT1
og 6,49 ± 21,52 for
OSMR
, gennemsnit ± SD, n = 100) (
P 0,001
). På de optimale cut-offs (værdier, 3,87 for
B4GALT1
og 22,01 for
OSMR
), beregnet i ROC-analyse (PT
vs
. PN) (figur s4b) , specificiteten af de to gener var over 96%. De følsomheder af
B4GALT1
OSMR
var 49% (49/100) og 80% (80/100), hhv. Tilsammen
B4GALT1
OSMR
blev ofte methylerede i primære CRC væv, men vist fraværende eller lave niveauer af methylering i tilsvarende normale væv.
Næste udførte vi en blindet analyse af gen methyleringsanalyse i afføring DNA opsamlet fra patienter med eller uden tyktarmskræft. Kliniske status af patienterne blev ikke afsløret, før analysen er afsluttet. Vi undersøgte også hypermethylering af
SFRP1
som en positiv kontrol til påvisning af gen-methylering i afføring DNA [18]. Resultaterne af ROC-analyse i afføringen DNA er vist i figur 2. Tabel 4 viser følsomheden /specificiteten af hvert gen for tyktarmskræft påvist i afføringen DNA-prøver.
SFRP1
methylering blev ikke påvist hos patienter med endoskopisk normal colon (0%, 0/15), og blev fundet i 55% (11/20) af CRC patienter, ved den optimale afskæringsværdi beregnet ud fra ROC-analyse. Methylering af
B4GALT1
OSMR
blev påvist i 64% (9/14) og 80% (16/20) af fæces DNA-prøver fra CRC patienter. Når methylering af
SFRP1
OSMR
blev kombineret, følsomheden var 60% (12/20), og specificiteten var 100% (0/15). Forskelsbehandling patienter uden kræft og CRC patienter med
SFRP1
eller
OSMR
methylering blev statistisk signifikant (
P 0,01
).
En blindet test var udført for gen methyleringsanalyse i afføring DNA opsamlet fra patienter med eller uden tyktarmskræft.
SFRP1
var inkluderet til sammenligning methylering frekvensen af en kendt kræftspecifikke methyleret gen. Følsomhed /specificitet baseret på optimale cut-offs beregnet ud fra ROC-analyse er vist i tabel 4.
OSMR
methylering blev testet i et blindet måde i en mere uafhængig sæt af afføringsprøver (ingen overlapning med prøverne i tabel 4). Skammel DNA fra raske kontrolpersoner, der ikke havde nogen visuelle abnormalties i koloskopi blev medtaget til denne undersøgelse. Følsomheden af
OSMR
methylering i CRC patienter var 38% (26/69), og specificiteten var 95% (77/81) (tabel 5). Forskellen mellem CRC patienter og normale kontroller var statistisk meget signifikant (
P 0,001
). Desuden
OSMR
methylering blev påvist i 56% (15/27) og 44% (8/18) afføring DNA prøver fra CRC fase II og III patienterne. Desuden 34 af 41 tilfælde (83%) af fækal DNA fra confounding kontrol patienter uden CRC var fuldstændig negativ for
OSMR
methylering. Andre kliniske parametre i forstyrrende kontroller såsom diverticulosis blev hæmorider, og polypper ikke signifikant associeret med
OSMR
status methylering i afføringen (data ikke vist).
For at undersøge de transkriptionelle niveauer af
B4GALT1
OSMR
, udførte vi RT-PCR eller Real-time RT-PCR-analyse (fig. 3) ved hjælp af cDNA fremstillet ud fra CRC cellelinier (HCT116, HT29, DLD-1 , RKO, og SW480) og en ikke-tumorigen cellelinie, HEK293.
OSMR
udtryk blev kun observeret i cellerne, hvor methylering af
OSMR
blev ikke fundet (HCT116 og HEK293). Forhøjelse af
OSMR
udtryk med 5-aza-dC behandling blev tidligere rapporteret [12], hvilket indikerer, at ekspressionen af
OSMR
korrelerer tæt med promotor methylering. Basal udtryk for
B4GALT1
blev påvist i alle testede cellelinier, og alle disse cellelinjer også næret methylering af
B4GALT1
. Men
B4GALT1
blev yderligere forøget med 5-Aza-dC (figur S5A), hvilket indikerer, at dens udtryk var i det mindste delvist undertrykt af promotor methylering.
A, Angivelse af
B4GALT1
OSMR
i cellelinjer blev undersøgt ved RT-PCR-analyse. Methylering af
B4GALT1
i cellelinjer blev undersøgt ved C-MSP eller TaqMan-MFP. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. M, methylering; U, unmethylation. B og C, blev Real-time RT-PCR udført i fem par (a – e), normal (PN) og tumor cDNA fremstillet ud fra CRC patienter (PT) (
venstre
). Angivelse af
B4GALT1
(B) og
OSMR
(C) blev også sammenlignet mellem patienter med tyktarmskræft (T) eller uden cancer (NN) (
rigtige
). Relativ udtryk (Fold) blev beregnet ved at sammenligne forholdene mellem mRNA udtryk for
B4GALT1
OSMR
til en intern kontrol-gen, GAPDH. Eksperimenter blev udført in duplo, og værdier angiver middelværdier ± SD. *,
P 0,05
. Eksperimenter blev udført in duplo, og værdier angiver middelværdier ± SD. *,
P. 0,05
Vi derefter udført Real-time RT-PCR i cDNA fremstillet af tumor (PT) og tilsvarende normale væv (PN) af fem individuelle tyktarmskræft patienter (matches cDNA). I 3 af 5 tumor tilfælde,
OSMR
var signifikant nedreguleret (fig. 3C,
venstre
). Udtrykket af
B4GALT1
OSMR
i tumor var tre og fire gange lavere end i normale væv (NN), (fig. 3B og C,
højre
) . Ved immunohistokemisk farvning af et kolon normale og cancer væv microarray med et anti-OSMR antistof, påvises vi stærk ekspression af
OSMR
i alle ikke-maligne normale væv (NN) og tilstødende normale colon mucosa (PN) fra kolon kræftpatienter (fig. 4 og tabel 6). Men
OSMR
var knap påvist i næsten alle primære tumorer (PT) (svag udtryk i 4 af 10 tilfælde). Disse resultater tyder på en specifik reduktion af
OSMR
mRNA og protein i udvikling tyktarmskræft.
Stærk udtryk for
OSMR
blev påvist i alle ikke-maligne normale væv (NN) og tilstødende normale colon mucosa (PN). I modsætning hertil
OSMR
blev sjældent påvist i de neoplastiske celler fra patienter med tyktarmskræft. Tumor kvaliteter er angivet.
For at undersøge betydningen af DNA methylering i regulering af
OSMR
udtryk, vi transficeret en pGL3-
OSMR
-Pro2 -Luciferase konstruktion i tre cellelinier; en
OSMR
-negativ cellelinje, SW480, og to
OSMR
-positive cellelinjer, HCT116 og HEK293. Konstruktionen blev behandlet med eller uden
Sss
jeg methylase før transfektion. Aktivitet af
OSMR
promotoren blev ikke detekteret i SW480, men en høj grad af promotoraktivitet blev påvist i HCT116 og HEK293-celler (fig. 5A). Induktion af CpG methylering med
Sss
jeg methylase faldt aktiviteten til minimale niveauer.
A, Analyse af
OSMR
promoter aktivitet ved luciferase reporter assay i OSMR-positive (HCT116 og HEK293) og – negative (SW480) celler. Promotoren konstruktion blev forbehandlet med eller uden
Sss
jeg methylase i 8 timer før transfektion. Den højeste aktivitet blev påvist i HEK293-celler. Data er udtrykt som fold forøgelse i forhold pGL3-basisk aktivitet. Eksperimenter blev udført tre gange, og værdier angiver middelværdier ± SD. Middelværdier er vist. B, An siRNA pool målretning
OSMR
og ikke-targeting kontrol blev forbigående transficeret ind HCT116, og celler blev behandlet med rhOSM (50 ng /ml) (
venstre
). HCT116-celler blev behandlet med eller uden Stat3 inhibitor peptid (Stat3 Inh, 100 uM), der virker som en meget selektiv, potent blokker af STAT3-aktivering (
højre
). Cellevækst blev bestemt ved MTT-assayet. Data er udtrykt som absorbans ved 570 nm. Eksperimenter blev udført tre gange, og værdier angiver middelværdier ± SD.
*, P 0,05
. C, 5-aza-dC (5 uM) blev forbehandlet i 48 timer i SW480 og DLD-1-celler, og derefter co-behandlet med rhOSM i 48 timer. Cellevækst blev bestemt ved MTT-assayet. *, 5-Aza-dC-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede kontrol (
P 0,05
); #, 5-Aza-dC /rhOSM- behandlede celler i forhold til 5-Aza-dC behandling alene (
P 0,05
). D, phosphoryleringen af
Stat3
Erk
som reaktion på rhOSM (50 ng /ml) blev analyseret ved Western blotting i HCT116 og SW480 cellelinier. rhOSM øget phosphoryleret
Stat3
Erk
i HCT116 celler, men ikke i SW480 celler (som mangler LIFR-se E nedenfor). Lige protein belastning blev overvåget af alt
Stat3
,
Erk
og
β-actin
evaluering i prøverne. Re-aktivering af
OSMR
med 5-Aza-dC behandlingen blev bestemt på SW480 og DLD-1 celler ved flowcytometri (figur S6). E. Angivelse af
LIFR
gp130
blev undersøgt i CRC cellelinier ved RT-PCR.
LIFR
blev udtrykt i HCT116 celler, men tavshed i de fleste andre CRC testede cellelinjer.
gp130
,
OSMR
heterodimer blev allestedsnærværende udtryk i alle testede cellelinier. Promotor methylering status for disse to sidstnævnte gener blev ikke undersøgt.
Oncostatin M (OSM) er en interleukin-6 (IL-6) -type cytokin, men mere aktiv end IL-6 til inhibering af proliferation af adskillige faste tumorcellelinier [19], [20]. For nylig er en korrelation af resistens over for vækstinhibering ved OSM specifikke tab af
OSMR
og Stat3 signalering blev rapporteret [15]. For at undersøge CRC celle modstand mod væksthæmning af OSM, vi forbigående transficeret en siRNA pulje målrettet OSMR og en ikke-målrettet kontrol siRNA i
OSMR
udtrykkende HCT116 celler, og udført en standard cellevækst assay efter behandling af celler med en rekombinant human OSM (rhOSM). Vi observerede en betydelig vækst hæmning af rhOSM i HCT116 celler, og hæmning blev vendt af knock-down af
OSMR
(fig. 5B, til venstre). En Stat3 inhibitor peptid (Stat3 Inh), der ophævede STAT3-aktivering (fig. 5D) blokerede rhOSM-induceret vækstinhibering i HCT116-celler (fig. 5B, højre). Konsekvent, undertrykkelse af cellevækst ved rhOSM blev ikke observeret i SW480 og DLD-1 celler med
OSMR
promotor methylering (fig. 5C). Interessant, inhibering af cellevækst med 5-aza-dC behandling i SW480 og DLD-1 celler (*,
P 0,05
) var signifikant forøget ved behandling af rhOSM (#,
P 0,05
). Endelig observerede vi, at rhOSM aktiveret Stat3 phosphorylering i HCT116-celler, uanset OSMR ekspressionsniveauer (fig. 5D, venstre). Ekspression af
gp130
LIFR
mRNA blev observeret i HCT116-celler (fig. 5e), hvilket indikerer, at aktivering af Stat3 i HCT116-celler med meget lav OSMR ekspression forårsaget af siRNA transfektion kan være gennem gp130 /LIFR (type I OSM receptor) -medieret signalering. Erk phosphorylering steg i HCT116-celler transficeret med siRNA målretning
OSMR
, og det basale niveau af phospho-ERK i SW480 celler med
OSMR
methylering var højere end i HCT116-celler (fig. 5D). 5-Aza-dC delvist faldt aktiveret Erk i SW480-celler, og rhOSM genvundet basal Erk phopshorylation i nærvær af 5-aza-dC. Således methyleret
OSMR
markant nedsat tumor-hæmmende signaler fra rhOSM og centrale nedstrøms signalering begivenheder.
Diskussion
Promotor methylering af vigtige regulerende gener driver kræft proces og i rette kontekst kan tjene som en diagnostisk markør og et terapeutisk mål. Kræft-specifik methylering tjener som en vigtig biomarkør for tidlig påvisning af kræft. Sådanne markører kan supplere cytopatologiske vurdering af vævsbiopsier eller potentielt stå på egne som markører for sygdom i forskellige kropsvæsker såsom afføring. Til dette formål, methylering hyppigheden af gener identificeret i primære væv har vigtige kliniske implikationer.
En række gener er almindeligt hypermethyleret i kolorektal cancer (CRC), herunder
hMLH1
,
p16INK4a
,
p14ARF
,
RAR-β
,
APC
,
MGMT
,
cyklin A1
,
CDX1
,
MYOD1
,
COX-2
og
WT-1
[21], [22], [23]. Men generne methyleret kun i neoplastiske væv med høj frekvens (over 40%) er sjældne. I denne undersøgelse identificerede vi
PAPSS2
,
TUBG2
,
NTRK2
,
B4GALT1
OSMR
[12], [ ,,,0],24] som gener, der huser cancer-specifik promotor-methylering i human colorectal cancer. Den teoretiske følsomhed hver methylerede gen var over 70%, og de særlige forhold var over 90% af TaqMan-MFP. Methylering frekvensen af hvert gen rækker med kun et par andre gener methylerede ved høj frekvens i CRC (
cyclin A1, CDX1, RAR-β, MYOD1, p15INK4b og COX-2
) i en cancer-specifik måde [ ,,,0],10].
Undersøgelser om
B4GALT1
OSMR
er blevet rapporteret i human cancer.
B4GALT1
er lokaliseret både i Golgi komplekset og på celleoverfladen [25], og udtrykkes konstitutivt i alle væv, herunder human colorectal slimhinde [26] med undtagelse af hjernen [27]. Rolle celleoverfladen
B4GALT1
i human cancer er blevet rapporteret; det er en østrogen-regulerede gen i MCF-7 celler [28], og niveauet blev ændret i stærkt metastatiske lunge- cancerceller sammenlignet med dets mindre metastatiske parentale celler [29].
B4GALT1
fremmer apoptose ved at inhibere epidermal vækstfaktor receptor pathway [30] og øger cycloheximid-induceret apoptose i humane leverkarcinom celler [31]. Protein kinase B /Akt hæmmer apoptose ved nedregulering af
B4GALT1
[25]. Desuden blev forøget epitelcelleproliferation af huden og tyndtarmen og unormal differentiering i intestinale villi fundet i
B4GALT1
deficiente mus [32], hvilket antyder, at
B4GALT1
spiller en vigtig og undertrykkende rolle i proliferation af epitelceller. Således kunne dets inaktivering ved promotor methylering medføre udslip af normale cellulære kontroller og cancer progression.
OSMR er en receptor for Oncostatin M (OSM), et interleukin-6 (IL-6) -type cytokin identificeret som en potent suppressor af tumorceller. Menneskelig OSM blev oprindeligt beskrevet af dets evne til at hæmme melanom proliferation in vitro [33], [34], og dens mål for væksthæmning omfatter lungecarcinomer [35], ovariecarcinomer [36], og brysttumorer [37]. Resistens over for vækstinhibering ved OSM i metastatiske melanomcellelinier korrelerede med et specifikt tab af OSMR, sammenholdt med et lavere histonacetylering i OSMR promotorregionen, hvilket antyder, at metastatiske melanomceller kunne undslippe vækstkontrol af OSM ved epigenetisk inaktivering af OSMR [15]. Vi opdagede, at promotor methylering stærkt korrelerer med OSMR udtryk og også fundet en korrelation af resistens over for væksthæmning af OSM med tab af OSMR i CRC-cellelinjer. , Promotor methylering er således en central regulator af OSMR ekspression og alle disse resultater støtter en undertrykkende funktion for OSMR i human cancer
Menneskelig OSM danner to typer af heterodimere signaling komplekser.; gp130 /leukæmi inhibitorisk faktor receptor (LIFR) (type I OSM receptorkompleks) [39] og gp130 /OSMR (type II OSM receptorkompleks) [40]. gp130 /LIFR kan aktiveres af LIF eller OSM, men gp130 /OSMR aktiveres ved kun OSM. Den type II receptor kompleks aktiverer OSM-specifikke signalveje via JNK /SAPK og Stat1 /Stat5 veje, mens både type I og type II-komplekser aktiverer Stat3 og Erk som fælles signalveje i brystkræftceller [41]. Desuden kan type I og type II receptor signalering udviser antagonistiske funktioner [42]. Vi fandt, at OSM-medieret cellevækstinhiberingen ikke blev observeret i HCT116 celler med lav OSMR niveau trods Stat 3 phosphorylering. Da HCT116 celler udtrykte gp130 og LIFR, rhOSM sandsynligvis phosphorylerer Stat3 gennem type I OSM receptor-medieret signalering, men i mangel af gp130 /OSMR denne effekt er ikke tilstrækkeligt til at mægle vedvarende vækst undertrykkelse [41]. Til støtte for denne opfattelse, har rhOSM ikke øge Stat3 fosforylering i SW480 celler, som mangler LIFR udtryk
Fra et klinisk synspunkt, vores resultater har potentielle umiddelbare diagnostiske og terapeutiske implikationer og fortjener yderligere opmærksomhed. I en blindet test udført i afføring DNA fra CRC patienter,
B4GALT1
OSMR
methylering lykkedes detekteres med høj frekvens og dermed har potentiale for at identificere personer med tyktarmskræft. Da vi testede en ekstra kendte methylerede gen,
SFRP1
[18], i kombination med
OSMR
følsomheden af analysen øges; 60% (12/20) af tyktarmskræft blev påvist i afføringen DNA med perfekt specificitet (
P 0,001
). Disse data tyder på, at promotor methylering af
OSMR
kan tjene som en sand indikator for tilstedeværelsen af tyktarmskræft.
Terapeutisk begge gener giver forjættende spor for nye tilgange i behandlingen af CRC.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.