PLoS ONE: TRIM59 Fremmer spredning og Migration af ikke-småcellet lungekræft celler ved opregulering af Cell Cycle Relaterede Proteins

Abstrakt

TRIM protein familie er en evolutionært bevaret gen familie impliceret i en række kritiske processer, herunder inflammation, immunitet, antiviral og kræft. I et forsøg på at profilere udtrykket mønstre af TRIM superfamilien i flere ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer, fandt vi, at ekspressionen af ​​10 TRIM gener herunder TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59 , TRIM66 og TRIM70 var signifikant opreguleret i NSCLC cellelinjer sammenlignet med den normale menneskelige bronchial epitel (HBE) cellelinje, mens ekspressionen af ​​7 andre TRIM gener, herunder TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 var signifikant ned- reguleret i NSCLC cellelinier sammenlignes med den i HBE-celler. Som TRIM59 er blevet rapporteret til at fungere som en proto-onkogen, der påvirker både Ras og RB signalveje i prostatakræft modeller, vi her fokus på den rolle, TRIM59 i reguleringen af ​​NSCLC celledeling og migration. Vi rapporterede, at TRIM59 protein blev øget væsentligt i forskellige NSCLC cellelinjer. SiRNA-induceret vælte af TRIM59 hæmmede markant spredning og migration af NSCLC cellelinjer ved at arrestere cellecyklus i G2-fasen. Desuden TRIM59 vælte påvirkede ekspressionen af ​​et antal cellecyklusproteiner herunder Cdc25C og CDK1. Endelig har vi slået ned TRIM59 og fundet, at p53 protein ekspressionsniveauerne ikke opregulere, så vi foreslog, at TRIM59 kan fremme NSCLC cellevækst gennem andre veje, men ikke p53 signalvejen

Henvisning:. Zhan W, Han T , Zhang C, Xie C, Gan M, Deng K, et al. (2015) TRIM59 Fremmer spredning og Migration af ikke-småcellet lungekræft celler ved opregulering af Cell Cycle Relaterede Proteiner. PLoS ONE 10 (11): e0142596. doi: 10,1371 /journal.pone.0142596

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: April 27, 2015; Accepteret: 23. oktober 2015; Udgivet: November 24, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud til JB Wang fra National Natural Science Foundation of China (81372823, 31360282), Department of Education i Jiangxi-provinsen (Videnskab og Teknologi Luo Di-programmet), og et tilskud til MG Fu fra National Institutes of Health (AI103618).

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den tredelte motiv (TRIM) protein familie består af over 70 medlemmer, der er impliceret i en bred vifte af cellulære processer, herunder cellevækst [1], differentiering [2], udvikling [3], apoptose [4], inflammation og immunitet [5, 6]. Det mest slående træk ved TRIM superfamilieproteiner er særdeles konserveret rækkefølge domæner i RBCC motiv, som indeholder en ring domæne, en eller to B-kassemotiver og en coiled-coil-region [7, 8]. De fleste TRIM proteiner udgør en ny klasse af enkelt ring-finger E3 ubiquitin ligaser, der fremmer post-translationelle modifikationer af forskellige substrater, herunder selv [7]. TRIM proteiner også danne multimerisering ved hjælp af selv-association via coiled-coil-domæner, som stilladser til samling af multi-protein-komplekser, der identificerer subcellulære rum [9]. Gennem det seneste årti har meget opmærksomhed blevet høstet i at udforske rollen som TRIM proteiner i medfødte immunitet over for virusinfektioner [10]. I de seneste år, rapporterede flere grupper at TRIM proteiner også fungerer som onkogener eller tumor undertrykkere implicerer i forskellige kræft vækst. F.eks Raheja et al. rapporterede, at TRIM3 er en bona fide tumor suppressor, dens evne til at inhibere celleproliferation afhænger af NHL (opkaldt efter den NCL1, HT2A og LIN41 repeat) domæne og dets RING domænet [11]. TRIM16 inhiberer neuroblastom celleproliferation og migration in vivo og tumorigenicitet in vitro gennem ændringer ekspression af cyclin D1 og p27 [12]. TRIM28 vises opreguleret i mange cancertyper. I tidlige fase af lungetumorer, høj TRIM28 korrelerer med øget total overlevelse [1]. Desuden TRIM28 reducerer celledeling i model lunge cancer cellelinjer ved at bygge bro HDAC1 /E2F interaktioner [1]. For nylig, Zhou et al (2014) rapporterede, at i gastrisk tumor, TRIM59 interagerer med p53, fremme dens ubiquitinering og nedbrydning; TRIM59 kunne fremme gastrisk carcinogenese via denne mekanisme [13].

I et forsøg på at profilere udtryk mønster af TRIM superfamilien i flere NSCLC cellelinjer, udtryk for flere TRIM gener, herunder TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant opreguleret i NSCLC cellelinjer sammenlignet med normal human bronchial epitel (HBE) cellelinje, mens ekspressionen af ​​andre TRIM gener, herunder TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 var signifikant nedreguleret i NSCLC cellelinjer sammenlignet med i HBE celler. Som TRIM59 er blevet rapporteret til at fungere som en proto-onkogen, der påvirker både Ras og RB signalveje i prostatakræft modeller [14], vi her fokus på den rolle, TRIM59 i reguleringen af ​​NSCLC celledeling og migration. Vi fandt først, at TRIM59 protein blev øget væsentligt i forskellige NSCLC cellelinjer. SiRNA-induceret vælte af TRIM59 betydeligt anholdt spredning og migration af NSCLC cellelinjer ved at arrestere cellecyklus i G2-fasen.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig bronkial epiteliale (HBE) celler var fra Sciencell Company og dyrkes i bronchial epitelcelle medium (ScienCell, 3211). Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinjer (H1299, H292, A549) var fra ATCC og SPC-A1-cellelinje var en gave fra Dr. Xuerong Wang gruppe (Department of Pharmacology, Nanjing Medical University). NSCLC cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco). Alle celler blev dyrket under en atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

RNA oprensning og Q-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, 15596 -026). CDNA-syntese blev udført under anvendelse PrimeScript RT reagenskit med gDNA viskelæder (Takara, RR047A). blev gennemført Q-PCR-forsøg ved hjælp SYBR Green Premix Ex Taq II kit (Takara, RR820A) og RT-PCR System-Applied Bio-system. Den relative mængde af mRNA-ekspression af målgener blev beregnet ved den sammenlignende Ct metoden under anvendelse af GAPDH som kontrol. Alle Q-PCR-reaktioner blev udført tre gange. Dataene blev erhvervet ved hjælp af ABI ViiATM 7 Real-Time PCR System instrument. Alle primere for de 72 TRIM gener valideret ved anvendelse universelle cDNA standarder (BD Clontech). Kvantificering blev udført ved ACt metode, med 18S eller actin anvendt til normalisering. mRNA med cyklustider ≥ 34 var fast besluttet på at blive opdaget. Normaliserede mRNA-niveauer udtrykkes som arbitrære enheder ved forvandlet cyklustider hjælp 2

ACt. Dataene var imod log2 og organiseret i en varme kort ved hjælp MEV software (Dana-Farber Cancer Institute, https://www.tm4.org/mev.html).

Lav serum assay og mætning tæthed assay

i lavt serum-assay blev celler udpladet med en tæthed på 10

5-celler i 12-brønds skåle og fik lov at adhærere natten over i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Den følgende dag blev celleantallet talt som dataene for dag 0 blev mediet ændret til RPMI 1640 suppleret med 1% FBS og derefter ændret hver anden dag i 6 dage. På de angivne tidspunkter, blev cellerne trypsiniseret og talt med et hæmocytometer. For mætningsdensitet assay 10

5-celler blev podet i plader med 12 brønde i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Mediet blev skiftet hver anden dag. Celletætheden blev bestemt ved tælling af cellerne på den sjette dag.

Kolonidannelse assay

Kolonidannelse assay blev udført med H1299 celler, der blev dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 60 mm plader og transient transficeret med kontrol siRNA, TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2 eller ubehandlet som en positiv kontrol. Efter transfektion blev cellerne trypsineret, talt og 500 celler blev podet i 6-brønds skåle og fik lov at adhærere natten over. Den følgende dag blev mediet ændret til RPMI 1640 + 5% FBS. Alle celler blev derefter dyrket i 2 uger, med medium skiftes hver anden dag. Plader blev fikseret med 4% formaldehyd og farvet med 2% krystalviolet. Billederne blev opnået ved et digitalt kamera.

SiRNA

vælte af TRIM59 blev udført ved hjælp af to forskellige Stealth Select RNAi dobbelthuse (Life Technologies Company). Målrettede oligonukleotidsekvenser var: siRNA-1: GCCUCUCUAUCUGUUUACCAAAGUU; siRNA-2: UCCUCGUGUACUGCCAUGCUCUCAU; Stealth RNAi negativ kontrol duplex fra Life Technologies Company blev anvendt som kontrol. De RNAi nucletides blev kortvarigt transficeret i enten HBE celler eller NSCLC celler ved hjælp SuperFectin siRNA Transfektion Reagent (Pufei, Shanghai, 2103-100) og den relative banke ned effektivitet blev bestemt ved TRIM59 antistof.

Scratch sårheling assay og transwell migration assay

Cell migration blev målt under anvendelse en ridse assay [15]. H1299-celler blev udpladet i 6-brønds plader for at skabe et konfluent monolag af 90-100% konfluens, derefter monolaget blev skrabet i en lige linje til at skabe en “scratch” af en 200 pi pipettespids. Efter at have fjernet snavs og tilføje frisk medium indeholdende 2% FBS, blev cellerne fotograferet ved hjælp af fasekontrast mikroskop (Olympus IX71, forstørrelse: 200 ×; mål: LCAch20XPh, ingen filter, kamera: DP72, eksponering og billedanalyse: cellSens software, pixelstørrelse: 1.4 megapixel monokrom CCD). Afstanden migration blev vurderet ved hjælp af billede J software (National Institutes of Health, https://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). En migration blev beregnet ved celle relative migration område for hver behandling.

Transwell migration assay blev udført ved hjælp af 8 pm porestørrelse transwell kamre (BD Falcon). I alt 10

5-celler i 0,2 ml medium suppleret med 1% FBS blev udpladet i det øvre kammer. Den nedre kammer i transwell anordningen var fyldt med 500 pi RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. Efter inkubation ved 37 ° C i 10 timer blev celler, der forbliver på den øvre overflade af membranen fjernet. Cellerne på den nedre overflade af membranen blev fikseret, farvet med krystalviolet og derefter talt under et lysmikroskop (Olympus IX71, forstørrelse: 40 ×; mål: UplanFl4XPh, ingen filter, kamera: DP72, eksponering og billedanalyse: cellSens software ; pixelstørrelse: 1.4 megapixel monokrom CCD). I alt 400 celler blev afbildet.

Cell cyklus analyse

Frisk tilberedt celler blev høstet og re-suspenderet i 0,5 ml PBS. Derefter blev cellerne fikseret med 70% alkohol på is i mindst 2 timer. Efter centrifugering blev supernatanten bortkastet, og sediment blev vasket med PBS i gang. Cellepelleten blev resuspenderet i 5 ml PBS og derefter celler blev talt. Resuspenderede 2 × 10

5 celler med 400 pi guava cellecyklus reagens (Millipore, 4700-0160). Efter inkubering i vandbad ved 37 ° C i 15 minutter blev cellecyklus analyseret af Millipore Guava easyCyte ™ flowcytometer (Millipore).

Immunfluorescensfarvning

Celler blev udpladet i 24-brønds plader og fik lov at vokse i 18-24 timer. Celler blev fikseret med afkølet methanol i 5 minutter ved stuetemperatur og skyllet med PBS i tre gange. Derefter celler blev blokeret med 5% normalt gedeserum, 0,3% Triton X-100 i PBS ved stuetemperatur i 1 time. Anti-PCNA-antistof (Abcam, ab92552) inkubation blev udført i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev rhodamin-konjugeret gede-anti-kanin-antistof (Proteintech, SA00007-2) påført ved stuetemperatur i 1 time på et mørkt sted. Celler blev vasket med PBS i tre gange og derefter monteret med DAPI Fluoromount-G mounting medium (Southern Biotech, 0100-20). Endelig blev cellerne fotograferet med en fluorescens mikroskopi (Olympus IX83, forstørrelse: 200 ×; mål: LUCPlanFl20XPh; filter indstilling og timing: DAPI: BA420 filter og 220ms, PCNA: BA590 filter og 360ms, kamera: DP80, eksponering og billedanalyse: cellSens software, pixelstørrelse: 12.5 megapixel CCD). Total 600 celler blev afbildet.

Protein isolation og western blot

Proteinerne fra væv og celler blev separeret ved standard 10% SDS-PAGE efterfulgt af at overføre proteinerne til en PVDF-membran. Proteinerne blev opdaget af følgende primære antistoffer: TRIM59 (Sigma, R06835), cyclin B1 (Proteintech, 55.004-1-AP), Cdc25C (Proteintech, 16.485-1-AP), CDK1 (Proteintech, 19.532-1-AP) , p53 (Proteintech, 10.442-1-AP), PCNA (Abcam, ab92552) og β-actin (Santa Cruz, sc-4778) og efterfulgt af inkubation med et sekundært antistof. Farvning blev udført med ECL western blot påvisningsreagens. Antistof til p-actin var tjente som den endogene kontrol. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Statistisk analyse

I hvert eksperiment blev tre uafhængige gentagelser udført. Alle data blev udtrykt som middel ± SD. Statistisk vurdering blev gennemført under anvendelse af Student t-test. Den tværpolitiske forskel blev sammenlignet ved anvendelse af envejs variansanalyse efterfulgt af Dunnetts test. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. *,

s

0,05 vs. kontrol; **,

s

0,01 vs. kontrol; ***,

s

. 0,001 vs. kontrol

Resultater

TRIM59 er stærkt udtrykt i NSCLC cellelinjer

Lungekræft er den mest fælles cancer blandt mænd verden over. De vigtigste primære typer af lungekræft er småcellet lungecarcinom (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). NSCLC er ikke godt respons på kemoterapi og har højere dødelighed end SCLC [16]. I et forsøg på at profilere udtrykket mønstre af TRIM gen familie i NSCLC cellelinjer, valgte vi fire NSCLC cellelinjer, herunder H1299, SPC-A1, A549 og H292. Den menneskelige bronchial epitelcelle (HBE) blev serveret som kontrol. MRNA-niveauer af TRIM-genfamilien i disse cellelinjer blev målt ved Q-PCR og analyseret ved MEV software (S1 tabel). Udtrykket af adskillige TRIM gener, herunder TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant opreguleret i NSCLC cellelinjer sammenlignet med HBE-celler (Fig 1A og 1B), mens ekspressionen af ​​andre TRIM gener, herunder TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 var signifikant nedreguleret i NSCLC cellelinjer sammenlignet med i HBE-celler (fig 1A og S1 fig). MRNA ekspressionsniveauer af andre 12 TRIM gener blev ikke detekteret enten i NSCLC cellelinier eller HBE-celler. Som TRIM59 er blevet rapporteret til at fungere som en proto-onkogen, der påvirker både Ras og RB signalveje i prostatakræft modeller [14], vi her fokus på TRIM59 i NSCLC for yderligere forskning.

(A) mRNA ekspressionsniveauer af 60 TRIM familie gener i fire NSCLC cellelinier (H1299, H292, SPC-A1 og A549) og normal human bronchial epitel (HBE) cellelinie blev bestemt med Q-PCR. Dataene blev organiseret i en varme kort ved hjælp af MEV software. De relative ekspressionsniveauer af generne blev vist i farveskalaen af ​​0-4.0435486 i grøn-rød-sort farve ordning. (B) De mRNA ekspressionsniveauer af TRIM gener, herunder TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant opreguleret i NSCLC cellelinjer sammenlignet med i HBE celler. (C) Skematisk visning af TRIM59. TRIM59 indeholder et RING finger domænet (RING), en B-box2 domæne (B2), to coiled-coil-domæner (CC) og et transmembrandomæne (TM). (D) Ekspressionen af ​​TRIM59 i 14 typer af normale væv blev kontrolleret ved western blot med TRIM59 antistof. (E) Ekspressionen af ​​TRIM59 protein i fire NSCLC cellelinier og HBE cellelinie. Lysater fra cellelinierne blev underkastet immunoblotanalyse med TRIM59 antistof.

Humant TRIM59 er et protein af 403aa indeholdende et RING-domæne, et B-box-domænet, to coiled-coil-domæne og et transmembrandomæne i sin C-terminale (figur 1C). Western blot viste, at TRIM59 var stærkt beriget i knoglemarv og milt, lavt niveau i muskel og lunge, ikke påvises i andre væv, der blev undersøgt (Fig 1D). Desuden western blot bekræftede yderligere, at TRIM59 proteinniveauet var signifikant højere i alle NSCLC cellelinier, der blev undersøgt end i HBE (Fig 1E). Tilsammen disse resultater tyder på, at TRIM59 er overudtrykt i NSCLC cellelinier og kan inddrage i reguleringen af ​​NSCLC vækst.

TRIM59 fremmer spredning af NSCLC celler

For at undersøge funktionen af ​​TRIM59 i NSCLC celler, vi købte tre siRNAs, der er målrettet til menneskelig TRIM59 fra Life Technologies Company. Disse siRNA’er blev transficeret ind H1299 cellelinje. Efter 48 timer blev proteinniveauet af TRIM59 detekteret ved western blot. Som vist i de nederste figurer i figur 2A, både siRNA-1 og siRNA-2 effektivt slået ned TRIM59 i forskellige cellelinier sammenlignet med virkningen af ​​kontrol siRNA. Dernæst vi undersøgt virkningerne af siRNA-induceret vælte af TRIM59 på den lave vækst i NSCLC cellelinjer serum. Som vist i de øverste tal i figur 2A, alle NSCLC-celler var yderst effektive til at vokse i lavt serum, men når TRIM59 blev slået ned, var de ikke i stand til at vokse under disse betingelser.

(A) lavt serum-assay . De angivne NSCLC cellelinier transient transficeret med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontrol siRNA eller utransficerede blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 1% FBS. På de angivne tidspunkter blev celler trypsiniseret og talt. Dataene repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg (middel ± SD) (Top tal). Immunblot af TRIM59 at kontrollere knockdown effektivitet TRIM59 siRNAs i de angivne cellelinjer (nederst tal). (B) mætningsdensitet assay. De angivne NSCLC-celler transient transficeret med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontrollere siRNA eller utransficerede blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS i 6 dage, trypsiniseret og talt. Dataene repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg (middel ± SD). (C) Kolonidannelse assay. Fem hundrede H1299 celler transient transficeret med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontrollere siRNA eller utransficerede blev podet i plader med 6 brønde i RPMI 1640 med 5% FBS. Efter to uger blev celler fikseret og farvet med krystalviolet. Repræsentative brønde blev fotograferet og vist.

Lignende resultater blev opnået ved undersøgelsen relative evne TRIM59 at aktivere NSCLC-celler til at øge deres mætningsdensitet. Cellerne behandlet med TRIM59 siRNA var signifikant mindre tæt end den behandlet med kontrol siRNA eller ubehandlet. Tilsvarende siRNA-induceret vælte af TRIM59 signifikant hæmmede væksten af ​​NSCLC-celler, men ikke signifikant påvirket væksten af ​​HBE-celler (Fig 2B). Dernæst udførte vi de kolonidannelse eksperimenter. Som vist i fig 2C vælte af TRIM59 dramatisk nedsatte kolonidannelse i H1299-celler. Taget sammen antyder disse resultater, at TRIM59 er essentiel for proliferation, kolonidannelse af NSCLC cellelinier. En nylig undersøgelse antydede, at TRIM59 fremmer gastrisk tumorvækst mindste delvist gennem p53 [13]. Som H1299 celler er en p53 sletning cellelinje (ATCC information), vores resultater foreslog, at TRIM59 kan målrette andre proteiner til at fremme cellevækst i NSCLC.

TRIM59 fremmer migration af NSCLC celler

I betragtning af evne TRIM59 til at fremme NSCLC cellevækst og kolonidannelse, vi er interesseret i at undersøge de potentielle følger for NSCLC celle migration. At udforske disse mulige effekter, blev sårheling assay udføres. Resultaterne viste, at H1299-celler migreret og det åbne rum, som “sår” er næsten helet efter 36 timer. Imidlertid blev helingen af ​​det åbne område markant svækket, da TRIM59 blev slået ned (fig 3A). For yderligere at bevise dette virkninger, vi også gjorde Transwell assay, som vist i fig 3B, antallet af migrerede celler blev stærkt reduceret, når TRIM59 blev slået ned. Derfor banker ned TRIM59 hindrede H1299 celle migration.

(A) H1299 celler forbigående transficeret med TRIM59 siRNA-1, kontrollerer siRNA eller utransficerede blev dyrket til at skabe en sammenflydende monolag af 90-100% sammenløb, så monolag blev skrabet i en lige linje til at skabe en “bunden”. Omfanget af cellemigrering blev fotograferet på de angivne tidspunkter (venstre tal). De tværgående scratch sår blev fornyet overvejelse og analyseret ved hjælp af billede J-software på 3 forskellige steder fra hvert sår område af huller ved hvert tidspunkt. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (til højre). (B) H1299 celler transient transficeret med kontrol siRNA eller TRIM59 siRNA-1 eller TRIM59 siRNA-2 og dyrket med RPMI 1640 indeholdende 10% FBS i 48 timer. Derefter blev cellerne trypsineret og podet i Transwell kamre. Efter inkubation i 10hrs blev cellerne fikseret, farvet, fotograferet og talt i fem tilfældige udsigt.

Knocking ned af TRIM59 arresterer NSCLC cellecyklus i G2-fase

Knocking ned TRIM59 hæmmede NSCLC cellevækst indikerer, at TRIM59 kan forstyrre celle cyklus-relaterede begivenheder i NSCLC celler. For at undersøge effekten af ​​TRIM59 vælte på cellecyklus, vi transficeret TRIM59 siRNA eller kontrol siRNA i HBE eller H1299 celler blev cellecyklus analyseret ved flowcytometri efter propidiumiodidfarvning. Som vist i fig 4A og 4B, banker ned af TRIM59 steg markant andelen af ​​G2 /M-fase og faldt andelen af ​​S eller G0 /G1 faser sammenlignet med virkningen af ​​kontrol siRNA behandlede eller ubehandlede H1299 celler. Til mere præcist definere TRIM59 vælte anholdelse cellens cyklus af H1299 enten i G2 eller M fase, vi næste undersøgt PCNA ved immunfluorescensfarvning og western blot. Som vist i figur 4C, fandt vi, at vælte TRIM59 i H1299 celler dramatisk nedreguleret farvningen af ​​PCNA. Morever, western blot resultat viste også, at PCNA proteinniveauet blev nedreguleret (Fig 4D). Tilsammen disse resultater foreslog, at nedsat celle proliferative aktivitet i TRIM59 vælte celler forårsaget af arrestere cellecyklus i G2-fasen. Interessant, banker ned af TRIM59 har nogen indlysende effekt på cellen cyklus af HBE-celler (Fig 4A og 4B), kan dette forklare, hvorfor banke ned af TRIM59 ikke havde signifikante hæmmende på væksten af ​​HBE celler, fordi ikke havde nogen effekt på celle cyklus.

HBE og H1299-celler blev transient transficeret med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontrollere siRNA eller utransficerede blev dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 48 timer. (A) Adhærerende celler blev opsamlet og cellecyklus-analyse blev udført ved flowcytometri. Indsatserne viste andelen af ​​celler for hver fase og er markeret med forskellige farver (lyserød: G0 /G1-fase, grøn: S fase, og grå: G2 /M fase). (B) Forholdet mellem cellerne i hver fase blev talt. (C) H1299 celler blev fikseret og farvet med anti-PCNA-antistof (rød) og DAPI (blå). (D) De protein ekspressionsniveauer af PCNA i H1299 celler blev kontrolleret ved Western blot.

Knocking ned af TRIM59 aftager udtryk for cellecyklusproteiner

For at belyse mekanismen i cellen cyklus standset ved TRIM59 vælte, udførte vi Q-PCR for at kontrollere mRNA niveauerne af multiple gener, som spiller vigtige roller i G2 /M-fasen. Som vist i fig 5A, blev mRNA-niveauerne af Cdc2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 og Cdc25C signifikant reduceret i TRIM59 siRNA behandlede celler sammenlignes med den i kontrol siRNA behandlede celler. Endvidere har vi undersøgt de proteinniveauer af cyclin B1, Cdc25C og CDK1 ved western blot. Som vist i fig 5B, Cdc25C og CDK1 men ikke cyclin B1 blev signifikant reduceret i TRIM59 siRNA behandlede celler sammenlignet med virkningen af ​​kontrol siRNA behandlede celler. Disse opdagelser sammen tyder på, at TRIM59 er vigtig for cellecyklusregulering ved at påvirke cellecyklusproteiner.

H1299 celler transient transficeret med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2 eller kontrol-siRNA blev dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 48 timer. (A) mRNA ekspressionsniveauer af G2 /M-fase gener CDC2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 og Cdc25C blev testet ved kvantitativ realtids-PCR. (B) Protein ekspressionsniveauer af CDK1 (også kendt som CDC2), blev Cdc25C og cyclin B1 kontrolleret ved western blot med viste antistoffer.

TRIM 59 fremmer NSCLC cellevækst ikke gennem p53 signalvej

Zhou et al (2014) rapporterede, at i gastrisk tumor, TRIM59 interagerer med p53, fremme dens ubiquitinering og nedbrydning; TRIM59 kunne fremme gastrisk carcinogenese via denne mekanisme [13]. For at undersøge mekanismen for TRIM59 fremmer cellevækst i NSCLC celler, vi bankede ned TRIM59 og kontrolleres protein niveauer af p53 i NSCLC cellelinjer og HBE celler. For H1299 celler, er det en p53 deletion cellelinie, kunne ikke påvises p53-protein. Interessant nok for HBE, H292 og A549 celler, er de cellelinjer til p53 vildtype [17], blev p53 protein niveauer påvirkes ikke af TRIM59 bankede ned. Men for SPC-A1 celler, p53 protein niveauer blev reduceret ved TRIM59 blev slået ned (figur 6). Tilsammen kan de foreslåede vi, at TRIM59 kan fremme NSCLC cellevækst via andre veje, men ikke p53-signalvejen.

Fire typer angivet NSCLC-celler og HBE-celler transient transficeret med TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, kontrol siRNA eller utransficerede blev dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS i 48 timer. De protein ekspressionsniveauerne af p53 blev kontrolleret ved Western blot ved hjælp af anti-p53 og anti-TRIM59 antistoffer.

Diskussion og konklusioner

TRIM proteiner omfatter en stor superfamilie og er vigtige regulatorer af cellulære processer, herunder inflammation, immunitet, celleproliferation og apoptose, og antiviral [1, 4-6, 10]. Formålet med denne undersøgelse er at identificere de TRIM proteiner, som er potentielt involveret i reguleringen af ​​spredning, kolonidannelse og migration af NSCLC celler. Vi anvendte Q-PCR til profil ekspressionsniveauerne af 72 TRIM gener i fire NSCLC cellelinier og en normal human bronchial epitel (HBE) cellelinie. Vi fandt, at ekspressionsniveauerne af 10 TRIM gener herunder TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 og TRIM70 var signifikant opreguleret i NSCLC celler sammenlignet med i HBE celler, hvorimod ekspressionsniveauerne af andre 7 TRIM gener herunder TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 var signifikant nedreguleret i NSCLC celler sammenlignet med i HBE celler. Selv om de fleste af TRIM proteiner er mindre karakteriserede nogle TRIM proteiner spiller en vigtig rolle i de cellulære processer i forbindelse med kræft. For eksempel har TRIM3, TRIM16, TRIM29 og TRIM36 blevet rapporteret at fungere som tumorsuppressorer [18-21]. Interessant nok blev TRIM7 identificeret som glycogenin-interagerende protein og er involveret i reguleringen af ​​cellulære glukosemetabolismen [22]. Som den unikke egenskab i cancer cellemetabolisme er afgørende for vækst og migrering af cancerceller, ville det være vigtigt for yderligere at undersøge den rolle, TRIM7 i den cellulære metabolisme af NSCLC-celler. Desuden har TRIM67 blevet rapporteret at fungere som en Ras-inhibitor [23]. Den nedregulering af TRIM67 i NSCLC celler kan bidrage til over-aktivering af Ras-signalering og over væksten af ​​NSCLC celler.

Vi karakteriseret yderligere den biologiske funktion af TRIM59 i proliferation, koloni dannelse og migration af NSCLC celler . SiRNA-induceret vælte af TRIM59 betydeligt svækket væksten, koloni dannelse og migration af NSCLC celler, men ikke signifikant påvirket væksten af ​​HBE celler. Men in vivo forsøg behøver udføres for at verificere disse resultater. Khatamianfar et al. nylig identificeret TRIM59 som et tidligt signal transducer i to (SV40Tag og Ras) onkogen veje i murine prostatakræft modeller. Desuden Zhou et al. også rapporteret, at TRIM59 fremmet gastrisk tumorigenese gennem nedregulering af p53 protein overflod og undertrykkelse af p53 downstream signaler. For at kontrollere om TRIM59 fremmer spredning af NSCLC celler også gennem p53 vej, vi bankede ned TRIM59 og kontrolleres p53 udtryk. For H1299 celle, er det et p53 deletion cellelinie, for andre cellelinier, ingen virkninger eller endog p53 faldet. Så TRIM59 regulerer proliferation og migration af NSCLC celler ved at målrette andre proteiner end p53.

Som konklusion har vi identificeret, at TRIM59 er en potentiel vigtig regulator for spredning og migration af NSCLC celler. SiRNA-induceret vælte af TRIM59 hæmmede markant spredning og migration af NSCLC cellelinjer ved at arrestere cellecyklus i G2-fasen. Endvidere TRIM59 vælte påvirkede ekspressionen af ​​et antal cellecyklusproteiner herunder Cdc25C og CDK1. Men brug in vivo fysiologiske rolle og mekanismer i TRIM59 protein, som skal undersøges nærmere.

Støtte Information

S1 Fig. MRNA ekspressionsniveauer for TRIM gener, herunder TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 og TRIM76 var signifikant nedreguleret i NSCLC cellelinjer sammenlignet med i HBE celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0142596. S001

(TIF)

S1 tabel. Profilen for ekspressionsmønstre af TRIM gen familie i NSCLC cellelinjer.

Vi valgte fire NSCLC cellelinjer, herunder H1299, SPC-A1, A549 og H292. Den menneskelige bronchial epitelcelle (HBE) blev serveret som kontrol. MRNA-niveauer af TRIM-genfamilien i disse cellelinjer blev målt ved Q-PCR. MRNA-ekspression niveau af TRIM gener med cyklustider ≥ 34 var fast besluttet på at blive opdaget. TRIM17, TRIM40, TRIM42, TRIM43, TRIM48, TRIM49, TRIM50, TRIM51, TRIM63, TRIM60, TRIM64 og TRIM77 var uopdaget. Mean: gennemsnittet; SD: standard fejl; CT:. Cyklustid

doi: 10,1371 /journal.pone.0142596.s002

(XLSX)