PLoS ONE: actincytoskelettet Regulering af Epithelial Mesenchymale Transition i metastatisk kræft Cells

Abstrakt

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er forbundet med tab af celle-celleadhæsionsmolekyle E-cadherin og afbrydelse af celle- celle vejkryds samt med erhvervelse af vandrende egenskaber, herunder omlægning af actincytoskelettet og aktivering af RhoA GTPase. Her viser vi, at depolymerisering af actincytoskelettet af forskellige metastatiske cancercellelinjer med Cytochalasin D (Cyt D) reducerer cellestørrelse og F-actin niveauer og inducerer E-cadherin ekspression ved både protein og mRNA-niveau. Induktion af E-cadherin var dosisafhængig og var parallel tab af mesenkymale markører N-cadherin og vimentin. E-cadherin-niveauer steg 2 timer efter tilsætning af Cyt D i celler, der viser en E-cadherin mRNA respons, men først efter 10-12 timer i HT-1080 fibrosarkom og MDA-MB-231 celler, i hvilke E-cadherin mRNA-niveauet var kun minimalt påvirket af Cyt D. Cyt D behandling inducerede den nukleare-cytoplasmatisk translokation af EMT-associerede Snai 1 og SMAD1 /2/3 transkriptionsfaktorer. I ikke-metastatiske MCF-7 brystcancerceller, som udtrykker E-cadherin og repræsenterer en kræftcelle model for EMT, actin depolymerisering med Cyt D induceret forhøjet E-cadherin mens actin stabilisering med jasplakinolid reduceret E-cadherin niveauer. Forhøjede E-cadherin niveauet på grund af Cyt D var forbundet med reduceret aktivering af Rho A. Angivelse af dominant-negative Rho En mutant øget og dominant-aktiv Rho En mutant faldt E-cadherin niveauer, og også forhindret Cyt D induktion af E-cadherin. Reduceret Rho En aktivering nedstrøms for actin remodeling inducerer derfor E-cadherin og reverserer EMT i cancerceller. CYT D behandling inhiberede migration og, ved højere koncentrationer, induceret cytotoksicitet af både HT-1080 fibrosarcomaceller og normale HS27 fibroblaster, men kun induceret mesenchymal-epithelial overgang i HT-1080 cancerceller. Vores undersøgelser tyder på, at actin remodeling er en opstrøms regulator af EMT i metastatiske cancerceller

Henvisning:. Shankar J, Nabi IR (2015) actincytoskelettet Regulering af Epithelial Mesenchymale Transition i metastatisk kræftceller. PLoS ONE 10 (3): e0119954. doi: 10,1371 /journal.pone.0119954

Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: Juli 18, 2014 Accepteret: 26 januar 2015; Udgivet: Marts 10, 2015

Copyright: © 2015 Shankar, Nabi. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en Cancer Research Society tilskud (IRN), en canadisk Breast Cancer Foundation Postdoc Fellowship (JS) og et canadisk Cancer Society Research Institute Innovation Grant (MR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ivan Nabi er en PLoS ONE Editorial Board medlem og det ændrer ikke forfatterne ‘ tilslutning til PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er en cellulær program kræves under normale udviklingsprocesser såsom embryogenese og væv remodellering og også i udviklingen af sygdomme, såsom cancer [1]. Under denne proces afbrydelse af celle-celle- og celle-ekstracellulær matrix (ECM) sammenvoksninger udgivelser epitelceller fra det omgivende væv. De frigivne celler forvandle mesenkymale, migrerende celler med en forbedret evne til at bevæge sig gennem meshwork af tre-dimensionelle ECM. Lokaliseret udtryk for vækstfaktorer såsom TGF-β og EGF inducerer EMT gennem aktivering af Wnt og Notch signalveje og nedstrøms aktivering af transkriptionsfaktorer såsom Smad, sneglen, ZEB og Twist. Ekspression af epitelcelle-celleadhæsionsproteiner såsom E-cadherin nedreguleres mens mesenchymal celle-celleadhæsionsproteiner såsom N-cadherin, vimentin og det ekstracellulære matrixproteiner fibronectin og collagen, opreguleres [1,2,3].

Kortikal organisering af actinfilamenter er kendetegnende for epitelceller henviser actin stress fibre findes i mesenchymale celler. Aktincytoskelettet remodellering er medieret af Rho GTPaser og repræsenterer en grundlæggende mekanisme kritisk for cellemigrering under processer såsom cancermetastase. Med hensyn til EMT, aktivering af RhoA fører til ROCK-afhængige aktincytoskelettet remodellering og afbrydelse af E-cadherin baseret celle sammenvoksninger [4,5,6,7,8,9]. Adskillige aktincytoskelettet-associerede proteiner, såsom α-actinin, myosin let kæde, integriner, tropomyosiner og moesin er blevet vist at være opreguleret i EMT [3,7,10,11,12,13,14]. Aktincytoskelettet regulatorer blev også identificeret som kritiske determinanter for lymfom progression i et tab af funktion RNAi skærm af mus tumormodeller [15]. Ekspression af actin regulatoriske proteiner, såsom ARP2 /3 og Wave2 korrelerer med dårlig prognose i bryst- og levercarcinomer understøtter en rolle for aktincytoskelettet dynamik og organisering som kritiske regulatorer af cancer progression [16]. En nylig undersøgelse har også impliceret øget myosin IIB ekspression og myosin IIA tung kæde phosphorylering i styrkelsen mamma epithelcellevandring og invasion i TGF-β-induceret EMT [17].

Vi viste tidligere, at reduceret ekspression af pseudopod- beriget proteiner resulterede i reducerede aktincytoskelettet dynamik og cellestørrelse, der var forbundet med en tilbageførsel af EMT i seks metastatiske cancer cellelinjer [18]. Vi viser nu, at depolymerisering af actincytoskelettet af cancerceller med cytochalasin D (Cyt D) inducerer nuklear-cytoplasmatisk translokation af EMT-associerede transkriptionsfaktorer, øget E-cadherin ekspression, reduceret celle form og størrelse og reduceret aktivering af RhoA. I MCF-7 brystcancerceller, induktion af E-cadherin af actin depolymerisering kræver RhoA inaktivering mens dominerende aktive RhoA inducerer E-cadherin. Dette antyder, at actin cytoskeleton remodeling opstrøms for RhoA signalering spiller en rolle i EMT.

Materialer og metoder Salg

Antistoffer og reagenser

Mus E-cadherin (# 610.182) og N -cadherin (# 610.920) antistoffer var fra BD Transduction Laboratories; anti-β-actin var fra Sigma, anti-vimentin (ab11256) var fra ABCAM. SMAD1 /2/3 (Sc-7960), SNAI 1 (Sc-28199), RhoA (Sc-418), c-myc (Sc-789) antistoffer var fra Santa Cruz. Alexa488-, Alexa568-, og Alexa647-konjugerede sekundære antistoffer og rhodamin- og Alexa568-konjugeret phalloidin var fra Molecular Probes. Reagenser til real-time PCR var fra Applied Biosystems; RNA isolation kit var fra Qiagen. Cytochalasin D og jasplakinolid var fra Calbiochem (Millipore). RhoA plasmider var en slags gave fra Nathalie Lamarche (McGill University). RhoA perler, MLB lysepuffer og Rac1 mAb var fra Millipore (Upstate).

Celledyrkning, western blot og immunfluorescensmikroskopi

Menneskelig MDA-231, MDA-435, DU145, HT1080, U251 , U87F-7, MCF-7 og HS27 cellelinier var fra American Type Culture Collection. MDA-231, MDA-435, og DU145 blev opretholdt i komplet RPMI 1640 og HT-1080, U251, U87, MCF-7 og HS27-celler i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 2 mmol /l L-glutamin og 25 mmol /l HEPES-puffer til RPM1 og natriumpyruvat til DMEM, henholdsvis ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. Til Western blots, blev cellelysater fremstillet, proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse Bradford reagens og lige store mængder cellulært protein er blevet anbragt. For immunofluorescens blev celler dyrket på dækglas fikseret med 3% paraformaldehyd og antistof-mærket som tidligere beskrevet [18]. Billeder blev opsamlet med x 60 eller × 100 planapochromat mål (blændetal, 1,35) af en FV1000 Olympus konfokalmikroskop.

Rho GTPase aktivitet assay

RhoA pull-down blev udført i overensstemmelse med producentens protokol (Millipore) og niveauer af RhoA GTP og total RhoA blev detekteret ved western blotting ved anvendelse af RhoA (Santa Cruz Biotechnology) antistof. Før behandling med Cyt D-celler blev transient transficeret med RhoA plasmider ved anvendelse Effectene (Qiagen) ifølge producentens protokol.

cellevandring og cytotoksicitetsassays

Cirka 3 × 10

4 HT1080 og HS27 celler blev overført til ikke-overtrukne (migration) 8-um cellekultur indsatser (BD Falcon) i medium indeholdende 2% serum. Samlingen blev anbragt i plader med 24 brønde indeholdende komplet medium. Celler lodes binde til filteret i 4-6 timer og derefter behandlet med forskellige koncentrationer af Cyt D og, som en vehikelkontrolgruppe, 1% DMSO, i 12 timer. Efter 12 timer blev ikke-migrerende celler fjernes fra toppen af ​​filteret med en vatpind og migrerende celler på bunden af ​​filteret fikseret og farvet med 0,5% krystalviolet, for cytotoksicitet assays, ca. 7.500 celler til både HT-1080 og Hs27 blev udpladet i plader med 96 brønde natten over og behandlet med forskellige koncentrationer af Cyt D eller 1% DMSO i 10 timer og derefter vandopløselig tetrazolium (WST-1-reagens) blev tilsat til de enkelte brønde. 2 timer efter tilsætning af reagenset, blev absorbans aflæst ved 450 nm. Alle forsøgene blev udført tre gange.

Real-time PCR

RNA blev isoleret fra hver af cellelinie ved anvendelse af RNeasy Plus mini kit (Qiagen) og blev revers-transkriberet under anvendelse af High kapacitet cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Genekspression blev kvantificeret under anvendelse af real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) på en ABI 7500 hurtigt system med brugerdefineret Taqman prober for hvert gen under anvendelse af Taqman-genekspression Assays (Applied Biosystems). Relative ekspression blev bestemt ved anvendelse af en standardkurve og genekspression normaliseret til 18S rRNA overflod.

Statistisk analyse

Statistiske tests blev udført for at bestemme niveauet af signifikans mellem kontrol- og behandlede grupper. Alle resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SEM af mindst tre forsøg. To gruppesammenligninger (kontrol vs behandlet eller tidspunkter i forhold til tid 0) blev udført under anvendelse af uparret Student t-test (fig. 1, 2, 3, 4 og 5). For flere gruppe sammenligninger (fig. 6), One-way ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligning test blev udført for at fremskaffe statistiske data.

(A) DU145, MDA-231, MDA-435, HT 1080, U251 og U87-celler udpladet i 24 timer var ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 100 pM Cyt D (Cyt D behandlet) i 12 timer, fikseret og immunofluorescently mærket til E-cadherin (grøn) og F-actin (rød). Målestok: 10 um. (B) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 uM) og gennemsnitlig størrelse og F actin indhold af cellerne blev bestemt ved anvendelse morfologien Explorer Bioapplication Software af en Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader. **

s

0,01 og *

s

0,05; i forhold til at styre (ubehandlede) celler.

(A) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87 celler blev behandlet natten over med forskellige koncentrationer af Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 uM) og cellelysater blottet for E-cadherin, N-cadherin, vimentin og β-actin. (B) Real-time PCR for E-cadherin-mRNA blev udført på total RNA isoleret fra DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87 celler behandlet med forskellige koncentrationer af Cyt D. cyt D behandling øget E-cadherin mRNA-ekspression i alle celler, bortset fra HT1080 og MDA-231, hvor der var ingen eller minimal udtryk. **,

s

0,01, *

s

0,05; i forhold til at styre (ubehandlede) celler.

(A) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87 celler blev behandlet med Cyt D for det angivne tider og cellelysater blottet for E-cadherin, N-cadherin, vimentin og β-actin. (B) Real-time PCR for E-cadherin-mRNA blev udført på total RNA isoleret fra DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87 celler behandlet ved forskellige tidsinterval med Cyt D . Cyt D behandling øget E-cadherin mRNA-ekspression på alle celler, bortset fra HT1080 og MDA-231, hvor der var ingen eller minimal udtryk. **,

s

0,01, *

s

0,05; i forhold til tid 0.

(A) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87 celler var ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 100 pM Cyt D (Cyt D behandlet) i 12 timer og immunofluorescently mærket til Smad1 /2/3 og SNAI 1 samt Hoechst 33342 til nuklear farvning. Repræsentative billeder af MDA-MB-231-celler er vist. (B) Celler blev scoret til nuklear fordeling af Smad1 /2/3 og SNAI 1 i kontrol og Cyt D behandlede celler. Resultaterne præsenteres som procent af den samlede celle viser nuklear fordeling for disse to proteiner. Målestok: 10 um; **,

s

0,01, *

s

0,05; i forhold til ubehandlet kontrol for hver cellelinie.

MCF-7 celler blev behandlet med 100 pM Cyt D i 12 timer (A) eller 0-400 nM jasplakinolid (JP) i 12 timer. (B) og lysater blev blottet for E-cadherin og β-actin. (C) RhoA GTP og total RhoA niveau blev bestemt i MCF-7-celler behandlet med 100 pM Cyt D i 12 timer. ***

s

0,001; i forhold til kontrol. (D) MCF-7-celler blev transficeret med dominant-negative (DN), vildtype (WT) og dominant aktiv (DA) RhoA i 48 timer, hvorefter cellelysater blev probet for c-Myc, E-cadherin og β- actin. (E) Utransfekterede MCF-7-celler eller MCF-7-celler transficeret med dominant aktiv RhoA aktiv blev behandlet med 100 pM Cyt D i 12 timer og cellelysater probet for c-Myc, E-cadherin og β-actin.

(a) HT-1080 og HS27-celler blev behandlet natten over med forskellige koncentrationer af Cyt D (0, 50, 100, 200 uM) og 1% DMSO som en vehikelkontrol og cellelysater blottet for E-cadherin , N-cadherin, vimentin og β-actin. (B) For migration analyser, celler belagt på 8 uM celle indsatse til 4-6 timer blev behandlet med de angivne koncentrationer af Cyt D for 12 timer, og antallet af celler migrerer gennem filteret tælles. (C) For at vurdere cytotoksicitet af Cyt D blev celler udpladet natten over og derefter behandlet med de angivne koncentrationer af Cyt D i 10 timer. WST-1-reagens blev tilsat til hver brønd, og efter to timer absorbansen blev aflæst ved 450 nm. *

s

0,05, **

s

0,01 og ***

s

0,001; DMSO behandlede celler i forhold til ubehandlede celler; Cyt D behandlede celler i forhold til DMSO behandlede celler.

Resultater

Den actin depolymerisation agent cyt D inducerer celle skrumpende og MET

Tidligere vi rapporterede, at reduceret aktincytoskelettet dynamik upon udtømning af pseudopod beriget AHNAK, Septin 9, eIF4E og S100A11 i metastatiske cancerceller førte til forøget ekspression af epitel markør E-cadherin og tab af mesenchymale markører N-cadherin og vimentin væsentlige vende epitel-mesenkymale overgang (EMT) [ ,,,0],18]. For at bestemme, om at ændre aktincytoskelettet dynamik kan direkte påvirke EMT vi behandlet seks metastatiske humane cancer cellelinier (prostata DU145, bryst MDA-MB-231 og MBA-MB-435, gliom U251 og U87 og fibrosarkom HT-1080) med actin depolymerisere agent Cyt D. celler udsat for Cyt D (100 uM) i 12 timer viste en reduceret størrelse og farvet positivt for E-cadherin (fig. 1A). DU145, MDA-MB-435, viste HT-1080 og U87 celler junktionel lokalisering af E-cadherin mens U251 og MDA-231-celler præsenteret en mere intracellulær E-cadherin lokalisering (fig. 1A). Forøgelse Cyt D koncentrationer fra 10 til 200 uM resulterede i progressiv krympning af cellerne og reducerede F-actin indhold, detekteret ved fluorescerende mærkning med Alexa-568 phalloidin og kvantitativ analyse med en Cellomics ArrayScan VTI automatiseret fluorescens imager (fig. 1B).

Højere koncentrationer af Cyt D forøget ekspression af E-cadherin og resulterede i tab af mesenchymale markører vimentin og N-cadherin i alle seks cellelinier (fig. 2A). Den mest udtalte virkning blev observeret ved 100 og 200 uM Cyt D og blev forstærket gennem øget E-cadherin-mRNA, bestemt ved qPCR, i de fleste cellelinjer, selv i mindre grad i HT-1080-celler og ikke i MDA-MB-231-celler (fig. 2B). Tidsforløbet for E-cadherin-protein og mRNA-induktion i afhængighed af 100 uM Cyt D varierede mellem cellelinierne. For DU145, U251, MDA-MB-435 og, i mindre grad U87, blev E-cadherin-protein-ekspression induceret ved 2 timer og forbundet med øget E-cadherin-mRNA (fig. 3). MDA-MB-231 og HT-1080 celler viste lidt eller ingen ekspression af E-cadherin på mRNA-niveauet og protein-ekspression blev først induceres efter 8-10 timer (fig. 3). Actin depolymerisation af Cyt D leder derfor til øget E-cadherin ekspression på både mRNA proteinniveauer med induktion af E-cadherin-mRNA forbundet med mere hurtig induktion af E-cadherin-protein.

Smad1 /2/3 og SNAI1 er transkriptionsfaktorer hvis nuklear ekspression er forbundet med EMT [19] og er lokaliseret til kernen i de metastatiske celler undersøgt [18]. Behandling af MDA-MB-231 celler med 10 pM Cyt D resulterede i dramatiske omfordeling af SNAI 1 og SMAD1 /2/3 til cytoplasmaet (fig. 4 A). Tilsvarende Cyt D-afhængig omfordeling af disse to EMT-associeret transkriptionsfaktorer fra kernen til cytoplasmaet blev observeret for alle seks metastatiske cellelinier undersøgt (fig. 4 B).

Actin depolymerisering regulerer RhoA aktivering

Forstyrrelse af actincytoskelettet inducerer derfor en epitelial overgang i metastatiske cancerceller. Vi derefter testet rolle actincytoskelettet dynamik på EMT i epitel, ikke-metastatiske celler MCF-7 brystcancer, der udtrykker E-cadherin og er blevet godt karakteriseres som en model for EMT i brystkræftceller [20]. Som observeret for metastatiske cellelinier, behandling af MCF-7-celler med Cyt D inducerede forhøjede E-cadherin-niveauer (fig. 5a). I modsætning hertil stabilisering af actincytoskelettet med nanomolære koncentrationer af jasplakinolid, reducerede E-cadherin-niveauer (fig. 5 B). Actin dynamik derved influerer E-cadherin ekspression i MCF-7-celler. Aktiveret RhoA udløser EMT [4,5,9] og induktion af E-cadherin af Cyt D behandling reducerede niveauer af aktiv RhoA i MCF-7-celler (fig. 5C). Konsekvent, transfektion af MCF-7-celler med dominant aktiv RhoA aktiv reduceret E-cadherin ekspression mens transfektion med dominant-negativ RhoA forøgede E-cadherin ekspression (fig. 5D). Endvidere i celler, der udtrykker dominerende aktive RhoA, Cyt D ikke længere påvirket E-cadherin-niveauer (fig. 5 E). RhoA aktivering status nedstrøms aktincytoskelettet dynamik er en central regulator af E-cadherin udtryk i disse cancerceller.

Cyt D inducerer ikke MET i normale fibroblaster

For at teste kræftcellen specificitet CYT D induktion af E-cadherin, behandlede vi HT-1080 fibrosarcomaceller og normale humane Hs27 fibroblastcellelinie med forskellige koncentrationer af cyt D (50, 100 og 200 uM) samt med 1% DMSO, som vehikelkontrol, i 12 timer. Som observeret før behandling med Cyt U medfører induktion af E-cadherin i HT-1080 med ledsagende tab af N-cadherin og vimentin ved 50 uM Cyt D. Interessant havde behandling med Cyt D på Hs27 ikke påvirke E-cadherin, N-cadherin eller vimentin udtryk antyder, at Cyt D induktion af MET er specifik for cancerceller (fig. 6A). Behandling med 10 pM Cyt D reducerede signifikant både migration af HT1080 og HS27-celler i forhold til 1% DMSO anvendt som en vehikelkontrol (fig. 6B) antyder, at celle migration er mere følsom over for actin cytoskeleton forstyrrelser. Cytotoksicitetsassays viste, at Cyt D var toksiske for celler ved 100 og 200 uM men ikke ved 10 og 50 um sammenlignet med 1% DMSO (fig. 6C).

Discussion

Actin organisation er kritisk for forskellige cellulære processer såsom celle motilitet, celledeling, organel bevægelse, cellesignalering og etablering og vedligeholdelse af celle kryds og celle form [21,22]. Under EMT, indregnes ændringer i actin organisation observeret, og udtryk for mange actin regulatoriske gener opreguleres [3,7,10,11,12,13,14]. Vi har tidligere rapporteret, at tab af protein komponenter af actin-rige pseudopodia af metastatiske cancerceller ændrer aktincytoskelettet dynamik, reducerer cellestørrelse og inducerer E-cadherin ekspression og MET [18]. Her viser vi, at en actin depolymerisere middel, Cyt D, reducerer cellens størrelse og form, inaktiverer RhoA og inducerer ekspression af E-cadherin, som definerer aktincytoskelettet som en opstrøms regulator af EMT i metastatiske cancerceller. I overensstemmelse med disse data, vi tidligere rapporteret, at induktion af MET gennem tab af pseudopod-berigede proteiner AHNAK, septin-9, eIF4E, og S100A11, blev forbundet med tab af F-actin og forøget stabilitet af resterende F-actin fibre [18] . Vigtigt er det, gjorde Cyt D fremprovokere MET i normale fibroblaster tyder på, at disse effekter er specifikke for kræftceller. Hvorvidt induktionen af ​​opfyldt af actin depolymerisering er specifikt relateret til forstyrrelse af tumorcelle pseudopodia skal stadig bestemmes.

cytoplasmatisk domæne interaktion E-cadherin med a- og β-catenin dannende celle-celleadhæsion komplekser forankret til actin cytoskeleton er kritisk for etableringen af ​​homotypiske celle-celle junctions [23]. Det er blevet rapporteret, at behandle celler med højere koncentrationer af Cyt D nedsætter celle permeabilitet og stabiliserer tætte forbindelser [24]. Det blev endvidere vist, at samling af tight junctions fører til E-cadherin induktion tyder på, at stabilisering og dannelse af disse junctions regulere E-cadherin ekspressionsniveauer [25]. Tidligere blev det også vist, at actin depolymerisation med Cyt B og latrunculin A inducerer overflade E-cadherin ekspression og reducerede N-cadherin og vimentin ekspression i rotte βcells [26]. Behandling med Cyt D har også vist sig at reducere vimentin ekspression i bugspytkirtelkræftceller [27]. I vores undersøgelse, behandling af celler med Cyt D inducerer E-cadherin-ekspression i alle de seks metastatiske cellelinier og også dramatisk reducerer celle størrelse og form (fig. 1, 2). Behandling med Cyt D signifikant forøget E-cadherin-transkript niveau i alle undtagen MDA-231-celler antyder, at actin cytoskeleton regulering af E-cadherin-niveauer forekommer ved mRNA og protein niveauer. Vigtigere, blev en hurtigere induktion af E-cadherin observeret i celler, der også viste forhøjede niveauer af E-cadherin mRNA definerer en kritisk rolle for de novo E-cadherin biosyntese i behandling. Faktisk forøgede niveauer af Zeb2, en transkriptionel repressor af E-cadherin, nedregulerer E-cadherin på både mRNA og proteinniveauet og inducerer EMT [28].

Mens iagttoges den mest robuste induktion af MET ved højere koncentrationer af Cyt D (100 og 200 uM), der var forbundet med 10-20% celle toksicitet, vi konsekvent observeret induktion af MET 50 uM Cyt D, der ikke var forbundet med betydelig celle toksicitet og, i MDA-231 celler , ved 10 uM Cyt D. Cellemigrering hæmmet ved 10 uM Cyt D og de højere Cyt D koncentrationer, inducerede MET blev også forbundet med øget hæmning af migration og reducerede F-actin niveauer (fig. 1B). Vi har ikke observere induktion af MET i normale HS27 fibroblaster på nogen Cyt D koncentrationer indikerer, at induktion af epitel markører ved actin depolymerisering er kræftcelle specifik. Cell migration er derfor mere akut følsomme over for actin depolymerisering end tilbageførsel af EMT tyder på, at disse to actin-baserede cellulære reaktioner forskelligt reguleres af actincytoskelettet.

RhoA aktivering kan initiere EMT ved at fremme e-cadherin nedbrydning [4 , 5,6,9,29]. Konsekvent observerede vi, at RhoA aktivering er forbundet med reduceret E-cadherin niveauer. Men rapporter tyder, at nedsat RhoA aktivitet er påkrævet for EMT i coloncarcinom progression [30]. I modsætning til en tidligere undersøgelse, der rapporterede aktivering af RhoA af Cyt D behandling i Swiss 3T3 fibroblaster [31] vi observeret reduceret RhoA aktivitet i ikke-metastatiske MCF-7-celler efter Cyt D behandling, der blev ledsaget af forøget E-cadherin ekspression (Fig . 5). De kontrasterende observationer kan skyldes de forskellige anvendte cellelinier, fibroblaster vs epiteliale MCF-7 celler, eller de højere koncentrationer og længere inkubationstider anvendes i vores undersøgelse. Ja, i deres undersøgelse behandlingen var i 6 timer med 0,5 ug /ml (1 pM), i modsætning til vores overnight behandling med 100 pM Cyt D, og ​​øget aktiveret RhoA blev observeret for de første 3 timer efter, hvor der var et fald i aktiverede RhoA niveauer. Reduceret aktivitet af RhoA aktiv nedstrøms actin depolymerisering inducerer derfor E-cadherin udtryk og MET. Den omstændighed, at Cyt D ikke øger E-cadherin ekspressionsniveauer i celler transficeret med dominerende aktive RhoA indikerer, at RhoA virker nedstrøms for actin remodeling at regulere E-cadherin ekspression (fig. 5) og EMT-processen. Behandling af MCF-7-celler med jasplakinolid faldt E-cadherin ekspression antyder, at actin polymeriserende og depolymerisering begivenheder har modsatrettede virkninger på EMT. Interessant, Cyt D effekt syntes specifikke for kræftceller tyder på, at små molekyler regulatorer af aktincytoskelettet kunne potentielt udviklet som mulige terapeutiske midler.

Regulering af actin dynamik ved farmakologiske midler kan derfor påvirke ekspressionen af ​​EMT markører, der definerer kritiske rolle actin dynamik i EMT og tyder på, at farmakologisk modulation af actin dynamik udgør et gyldigt tilgang til at målrette EMT i kræft. In vivo anvendelse af actin modulatorer såsom cytochalasins, latrunculins, jasplakinolid og andre til behandling af cancer har været begrænset af deres påviste bivirkninger og mangel på egnet leveringssystem for målrettet levering til tumorceller [32,33]. Men for nylig blev det vist, at Cyt D indkapslet i PEG-liposomer forbedret opløselighed og biotilgængelighed af Cyt D og inducerede kraftige anticancer virkninger i musemodeller [34]. Identifikation af andre forbindelser, der kan fremkalde MET mere specifikt kan repræsentere alternative tilgange til at målrette aktincytoskelettet i kræft.