PLoS ONE: Hedgehog Fremmer Neovaskularisering i pancreascancer ved Regulering Ang-1 og IGF-1 ekspression i knoglemarv Afledt Pro-Angiogene celler

Abstrakt

Baggrund

Pindsvinet (Hh) pathway har været impliceret i patogenesen af ​​kræft, herunder pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC). Nylige undersøgelser har antydet, at den onkogene funktion af Hh i PDAC involverer signalering i stromacellerne snarere end celle autonome virkninger på tumorcellerne. Men oprindelsen og arten af ​​det stromale celletype (r), der er lydhøre over for Hh signalering forblev ukendt. Da Hh signalering spiller en afgørende rolle under embryonal og postnatal vaskulogenese, vi spekuleret på, at Hh ligand kan virke på tumorvaskulatur med særlig fokus på knoglemarv (BM)-afledte celler.

Metode /vigtigste resultater

Cyclopamin blev anvendt til at inhibere Hh-vejen i humane PDAC cellelinier og deres xenotransplantater. BM transplantationer, co-kultursystemer af tumorceller og BM-afledte pro-angiogene celler (BMPCs) blev anvendt til at vurdere rollen af ​​tumor-afledte Hh i reguleringen af ​​BM rum ​​og bidraget fra BM-afledte celler til angiogenese i PDAC. Cyclopamin administration svækket Hh-signalering i stroma snarere end i kræftcellerne, som afspejles af nedsat udtryk for fuld længde Gli2 protein og Gli1 mRNA specifikt i rummet. Cyclopamin hæmmede væksten af ​​PDAC xenografter i association med regression af tumorvaskulaturen og reduceret homing af BM-afledte celler til tumoren. Værtsafledt Ang-1 og IGF-1-mRNA-niveauer blev nedreguleret ved cyclopamin i tumorxenoplantater.

In vitro

co-kultur og Matrigel plug-analyser viste, at PDAC celle-afledt Shh induceret Ang-1 og IGF-1 produktion i BMPCs, hvilket resulterer i deres forbedrede migration og kapillær morfogenese aktivitet.

konklusioner /betydning

Vi identificerede BMPCs som alternative stromale mål for Hh-ligand i PDAC tyder på, at tumorvaskulaturen er et attraktivt terapeutisk mål for Hh blokade. Vores data er i overensstemmelse med det nye begreb, som BM-afledte celler bidrage væsentligt til epitelial tumorigenese

Henvisning:. Nakamura K, Sasajima J, Mizukami Y, Sugiyama Y, Yamazaki M, Fujii R, et al. (2010) Pindsvin Fremmer Neovaskularisering i pancreascancer ved Regulering Ang-1 og IGF-1 ekspression i knoglemarv Afledte Pro-Angiogene Cells. PLoS ONE 5 (1): e8824. doi: 10,1371 /journal.pone.0008824

Redaktør: Sudha Agarwal, Ohio State University, USA

Modtaget: Oktober 11, 2009; Accepteret: 1. januar 2010; Udgivet: 21 Jan 2010

Copyright: © 2010 Nakamura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling til YM fra den Nye Energi og Industrial Technology Development Organization of Japan (07A05010a). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA og femte i Japan, og dens samlede 5-års overlevelse er kun 5,0-9,7% [1], [ ,,,0],2]. Gemcitabin kemoterapi for lokalt fremskreden eller metastatisk PDAC har kun beskeden aktivitet med en lille overlevelse fordel [3]. Identifikationen af ​​nye molekylære mål for PDAC at overvinde den dystre prognose er derfor nødvendig. Hidtil en række målrettede behandlinger mod EGFR [4], Ras /MEK [5] og VEGF [6] har undladt at forbedre overlevelsen signifikant i kliniske forsøg.

Aberrant aktivering af hedgehog (hh) pathway har for nylig blevet anerkendt som en af ​​de mediatorer af PDAC udvikling og anses derfor for at være en lovende mål for terapi [7], [8]. Hh er et morfogen nødvendig for korrekt mønsterdannelse under embryogenese. Forhøjet ekspression af Hh-relaterede proteiner, Sonic hedgehog (Shh) eller indisk pindsvin (Ihh), svækker pankreatisk morfogenese med stigninger i mesenkym og fald i epitel kammer [9], hvilket indikerer, at stram regulering af det samlede niveau for Hh aktivitet er afgørende for normal pancreasudviklingen. Da Shh er fejl-udtrykt ikke blot i PDAC men også i forstadielæsioner pancreas intraepithelial neoplasi (Panin) [8] og intraduktal papillære mucinous neoplasi [10], dysregulering af denne reaktionsvej kan spille en rolle i de tidlige stadier af tumorigenese. En række Hh-target gener, såsom BMP [11], FOXM1 [12], og PMP22 [13], er overudtrykt i PDAC, og der er cross-talk mellem onkogene veje herunder MAPK /ERK, PI3K /Akt [14 ], Wnt [15], TGFp /BMP [16] og Hh-signalering. Blandt de molekyler, der deltager i Hh-signalering, har Smoothened (Smo) blevet anerkendt som en vigtig formidler af signalering; det er en af ​​de receptor komponenter til Hh ligand og konverterer Gli2 til en transskriptionel aktivator [17]. , Smo er således en særlig lovende mål for anti-cancer terapi [18]. Cyclopamin, en naturlig steroid alkaloid, har stærke hæmmende virkninger mod Smo [18] og behandling med cyclopamin i den eksperimentelle indstilling hæmmer væksten af ​​mange kræftformer [19], [20], [21]. Cyclopamin derivater med forskellige strukturelle motiver er blevet genereret og lovende for mulig klinisk anvendelse [22].

Konkret har flere undersøgelser vist, betydelig vækst hæmning af PDAC

in vivo

af Hh vej blokade [ ,,,0],7], [23]. Tumoren vækstinhiberende mekanisme er blevet anset for at være primært medieret gennem blokering en autokrin sløjfe, der kan være påkrævet for proliferation [7], overlevelse [8] og motilitet [21] af kræftceller. Men Smo deletion i pancreas epitel ikke forringe tumorigenese i en musemodel for PDAC [24], og HH ligander inducerer ikke transskriptionelle reportere af vejen i PDAC linjer. Endvidere transgen ekspression af et aktiveret Smo allel i pancreas epitel undlader at inducere SMO pathway målgener eller at inducere neoplastiske forandringer [25]. Følgelig er det blevet overvejet, Hh-signalering kunne spille en parakrin rolle i tumormikromiljøet, i epitelcancer der mangler mutationer i Hh signalering komponenter. Faktisk har undersøgelser udført af os og andre definerede afgørende roller for kræft celle afledt Hh på celletyper inden tumor stromale rum [26], [27], [28]. På trods af disse resultater, de præcise mekanismer, hvormed nogle tumorceller er ufølsomme over for Hh hæmning og det stromale celletype (r), der er lydhøre over for Hh signalering forblev ukendt. Vi foretog derfor undersøgelser for at belyse disse mekanismer.

Metoder

Cell Culture, Protein Analysis, og RNA analyse

Menneskelig PDAC cellelinjer blev opnået fra ATCC, Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) og Cell Ressourcecenter for Biokemisk Research (Sendai, Japan). BMMNC isolation, proliferationsassays, co-kultur, migration assays, immunoblotting, og qPCR er beskrevet i Methods S1. Primersekvenser er opsummeret i tabel S1.

Dyr, knoglemarvstransplantation (BMT) og Immunhistokemi

Terapeutiske forsøg med cyclopamin blev udført med nøgne mus xenotransplantater som beskrevet [7]. BMT fremgangsmåder anvises i Methods S1. Protokoller for dyreforsøg blev godkendt af Asahikawa Medical Collage Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Væv blev behandlet som tidligere rapporteret [26]. Antistoffer og betingelser for immunhistokemi præsenteres i Methods S1.

Cellular, Molecular, og statistiske analyser

Detaljerede beskrivelser af procedurer findes i Methods S1.

Resultater

In vivo

effekter af Cyclopamin på KP-1N Xenografter

for at belyse de mekanismer, som Hh signalering kunne understøtte tumor progression i en tumor celle non-autonome mode, vi evalueret rolle Hh signalering på væksten af ​​PDAC

in vivo

. Vi valgte en cellelinie, KP-1N, der udviste høj ekspression af Shh, men var ufølsom over for vækstinhibering ved cyclopamin

in vitro

(fig S1, S2 og tabel S2). Behandling af KP-1N xenografter med cyclopamin dagligt i 7 dage forårsagede en reduktion i tumor vægt 46 procent sammenlignet med køretøj kontrol-behandlede tumorer (figur 1A). Histopatologisk analyse viste, at cyclopaminbehandlede behandlede tumorer havde rigelige områder med nekrose resulterer i en reduktion i levedygtig tumorvægt 59%. I overensstemmelse med disse resultater, farvning for Ki-67 og TUNEL viste, at cyclopaminbehandling reducerede proliferation med 14% og øget celledød med 9%

in vivo

(figur 1B); i modsætning hertil var der ingen signifikant effekt af cyclopamin på proliferation /celledød kinetik

in vitro

(figur S2).

(A) CD-1 nøgne mus med KP-1N xenotransplantater blev behandlet med eller uden cyclopamin (50 mg /kg /dag; sc) dagligt i 7 dage (10 xenotransplantater for hver gruppe). Resultaterne er vist som middelværdi ± SEM tumorvægt (mg). H-E farvninger for xenograft sektioner er vist og% nekrotisk område (N) blev målt. Scale barer; 200 um. (B) xenograft-væv blev farvet med anti-Ki-67 (Scale barer, 200 um) og TUNEL assay (Scale barer, 500 um) blev udført. Kvantificering af prolifererende /apoptotiske er vist som procent positive celler i 5 levedygtige felter fra 10 sektioner. (C) RNA blev ekstraheret fra xenograftvæv og mRNA-niveauer for Ptch1 og Gli1 blev kvantificeret ved TaqMan qPCR.

For at bestemme, hvilke celler blev påvirket af cyclopaminbehandling målte vi udtryk for Ptch1 og Gli1 mRNA, transkriptionelle mål for Hh-signalering, i både xenotransplanterede humane tumorceller samt muse stromale rum. For at gøre dette, vi gjort brug af artsspecifikke prober. Vi observerede, at human Ptch1 og Gli1 i xenograft væv blev kun moderat reduceret med cyclopaminbehandling (figur 1C). Sammenlignelige, mindre fald i udtryk blev observeret

in vitro

(Figur S3). Til sammenligning viste mus Ptch1 og Gli1 mRNA-niveauerne et markant mere udtalt nedregulering, hvilket indikerer, at stromale celler er væsentlige mål for Hh blokade. Tilsammen indikerer disse resultater, at anti-tumor effekt af cyclopamin på xenotransplantat vækst primært medieres gennem en nedregulering af Hh-signalering i tumorassocieret stroma.

Virkninger af Cyclopamin på tumorvaskulatur

blandt de stromale komponenter i PDAC xenotransplantater, var vi især gerne vide tumorvaskulaturen, eftersom vi har vist, at BM-afledte pro-angiogene (precursor) celler reagerer på Hh ligand under neovaskularisering [26], [29]. Derfor undersøgte vi effekten af ​​cyclopamin på tumorvaskulaturen i KP-1N xenotransplantater. Immunfarvning for endotelcelle markør CD31 viste, at mikrovaskulær densitet var signifikant reduceret (42,6%), når mus blev behandlet med cyclopamin (figur 2A). Den resulterende tumorvaskulatur blev indsnævret og fragmenteret, og reduktionen i den gennemsnitlige fartøj område var dramatisk (64,8%). Inhiberingen af ​​angiogenese ved cyclopamin blev også observeret i Suit-2 xenotransplantater (figur S4).

(A) KP-1N-xenografter behandlet med eller uden cyclopamin blev farvet med CD31. Scale barer; 500 um. Dataene er vist som middelværdi ± SEM MVD og betyder fartøj område. (B) Dobbelt immunfluorescensfarvning med α-glatmuskelactin (SMA) med CD31 eller NG2 med CD31. Scale barer; 200 um. Antallet af CD31

+ mikrokar dækket med α-SMA eller NG2 positive pericytter vises.

Vores resultater antydede, at blokade af Hh-signalering “destabiliserer” tumor fartøjer. Vi ønskede at bekræfte denne hypotese ved immunhistokemisk farvning for α-glatmuskelactin (SMA), NG2, og CD31. SMA og NG2 udtrykkes af pericyter, som er celler, der nøje forbinder med CD31-positive endotelceller at stabilisere blodkar [30], [31]. Vi observerede 50,0% eller 62,1% færre CD31

+ mikrokar dækket med SMA

+ eller NG2

+ pericytter i cyclopamincreme behandlede tumorer (Figur 2B). Således Hh-signalering er vigtig for modning og /eller stabilisering af tumorvaskulaturen.

tumorafledte Hh Fremmer Inkorporering af BM-afledte celler i neovaskulatur

knoglemarv (BM) -afledt celler menes at spille en rolle i tumorudvikling [32], [33]. For eksempel er der observeret forskellige typer af BM-afledte hæmatopoietiske celler til nøje associere med tumorneovaskulaturen [34], [35], og faktisk et lille antal BM-afledte progenitorceller blev demonstreret at inkorporere i lumen i en voksende vaskulatur, hvor de differentierer til endotelceller i en mus lungekræft model [36]. Forskellige faktorer i tumor mikromiljø kan modulere rekruttering og fastholdelse af BM-afledte celler under udviklingen af ​​den tumorvaskulaturen [37]. Derfor søgte vi at afgøre, om Hh signalering bidrager til denne proces i PDAC. For at spore BM-afledte celler, vi implanteret KP-1N xenografter i kimære mus med GFP-mærkede BM (GFP-knoglemarvstransplantation model, se fremgangsmåder). Cyclopamin faldt betydeligt rekruttering af BM-afledte celler i xenotransplantaterne med 60% i forhold til kontrol tumorer (figur 3A).

(AD) GFP-BMT-kimære mus med KP-1N xenografter blev behandlet med eller uden cyclopamin. Rekruttering af BM-afledte celler i tumoren blev sporet ved immunofarvning med anti-GFP (A). De viste data som gennemsnit ± SEM af antallet af GFP

+ celler. Scale Bars; 100 um. KP-1N xenograft væv blev immunfarvet med Gli2 (B), CD31, VE-cadherin eller NG2 (C), i kombination med GFP. Scale Bars; 100 um. Vist er gennemsnit ± SEM af GFP

+ -celler rekrutteret til CD31

+ tumorkar (

øvre panel

) og antallet af GFP

+ -celler co-lokaliseret med CD31, VE-cadherin

+, og NG2 (

nederste panel

).

Blandt Gli familie af transkriptionsfaktorer, kontrol af nedbrydningen af ​​Gli2 og forarbejdning til sin repressor formular definere Hh signalering respons [38]. Gli2 protein behandles og nedbrydes i fravær af Hh ligand, mens tilstedeværelsen af ​​Hh ligand fremmer Smo berigelse i den primære cilier [39], hvilket resulterer i nuklear translokation af fuld længde, transkriptionelt kompetent Gli2 protein [40]. Vi evaluerede derfor effekten af ​​cyclopamin på Gli2 protein via immunofluorescensanalyse anvendelse af et antistof mod fuld længde form af Gli2 [41] (figur S5A). BM-afledte celler udtrykker fuld længde Gli2 protein og cyclopamin faldet både det absolutte antal og den relative andel af Gli2 positive BM-afledte celler (figur 3B), hvilket indikerer, at Hh-signalering er aktiveret i BM-afledte celler i en cyclopamininducerede følsom (Smo -afhængig) måde. Ptch1 protein blev også observeret i BM-afledte celler såvel som i cancerceller og cyclopamin reducerede Ptch1 ekspression i stromal rum (fig S5B). Vi ikke kunne påvise en stærk Gli1 proteinekspression i xenograftvæv (data ikke vist).

I kontrol tumorer, GFP-positive BM-afledte celler er tæt forbundet med CD31

+ tumor fartøjer, men de er ikke inkorporeres i lumen af ​​vaskulaturerne (figur 3C). På den anden side, en delmængde af BM-afledte celler co-udtrykte VE-cadherin demonstrerer, at BM-afledte celler ikke kun rekrutteres til peri-vaskulære område, men også give anledning direkte til tumoren endotel. Den NG2 proteoglycan udtrykkes ved fremspirende pericytter under de tidlige stadier af angiogenese, og en undergruppe af BM-afledte celler i xenotransplantattumorer co-udtrykkes NG2. Disse resultater indikerer, at BM-afledte celler bidrage til udviklingen af ​​tumorvaskulatur ikke blot ved at give anledning til specifik type celler, men også ved at associere på forskellige måder. Af note, cyclopaminbehandling faldt betydeligt integration af GFP

+ BM-afledte pro-angiogene celler (BMPCs) til CD31

+, VE-cadherin

+ eller NG2

+ tumor vaskulaturerne. Vi bekræftede, at BMPCs var reagerer på Hh siden

in vitro

co-kulturer med KP-1N tumorceller resulterede i en cyclopamininducerede følsom induktion af Gli1 /Ptch1 mRNA i BMPCs, men ikke i det modne endothel cellelinie MS -1 (Figur S6 og data ikke vist). Taget sammen indikerer disse resultater, at Hh-vejen spiller en rolle i neovaskularisering ved at modulere inkorporering af BM-afledte pro-angiogene (precursor) celler i tumoren fartøjer.

tumorafledte Hh Fremmer Migration af BM- afledte Pro-Angiogene Cells

In vitro

In Vivo

Vi spekulerede at de faldt antallet af BM-afledte celler i cyclopaminbehandlede tumorer kan være resultatet af svækket mobilisering af celler fra BM. Imidlertid er antallet af cirkulerende BMPCs, som målt ved at mærke dyrkede perifert blod MNC’er med AcLDL /isolectin B4 [42], blev ikke signifikant reduceret i nærvær af cyclopamin (fig S6). Dette fund tyder på, at Hh direkte kan regulere rekruttering, differentiering, eller migration af forstadier til BMPCs inden tumor mikromiljø i stedet at påvirke mobilisering af forløberne fra marven.

Da hæmning af Hh-signalering ikke påvirkede mobilisering af BMPCs, søgte vi at undersøge de mekanismer, som Hh signalering kan forbedre deres integration i tumorvaskulaturen. For at gøre dette, vi undersøgt virkningerne af Hh signalering på migration af forstadier. Migrationen af ​​BMPCs gennem en transwell membran

in vitro

blev målt i nærværelse af KP-1N i den nederste godt. Dyrkede BMMNCs udtrykker c-Kit, CD11b og VE-cadherin blev anvendt som prækursorer til BMPCs (fig S6). Nummeret på den BMPCs migrerer til undersiden af ​​membranen blev signifikant forøget ved samtidig dyrket med KP-1N sammenlignet med de pro-angiogene celler uden KP-1N, hvilket indebærer, at udskilte faktorer fra PDAC celler kan forbedre migrationen af forstadierne (figur 4A). I overensstemmelse med en rolle for Hh-Smo-vejen, forbehandling af BMPCs med cyclopamin drastisk reduceret deres evne til at migrere på en dosisafhængig måde (figur 4A). For direkte at tage fat på rollen som Smo-afhængig signalering i BM-afledte pro-angiogene celler, vi brugte BM-celler inficeret med en shRNA lentivirus målretning Smo (figur 4B). Undertrykkelse af Smo betydeligt svækket deres migration til KP-1N tumorceller. Rolle tumor-afledt Shh i migration af forstadierne blev også bekræftet ved hjælp af en Shh neutraliserende antistof (figur 4C).

(A-B) Migrationen af ​​BM-afledte præ-angiogene celler (BMPCs) blev vurderet. BMMNCs dyrket i EGM2-MV-medium i 4 dage og vedhæftede celler blev podet på transwell (5 um porestørrelse) overtrukket med 0,1% gelatine, og KP-1N-celler blev podet i den nedre brønd. Antallet af migrerede celler i den nederste side af membranen blev kvantificeret ved DAPI-farvning efter 18 timers inkubation. De BMPCs blev forbehandlet med Cyclopamin (A), shRNA lentivirus for Smo (B), og anti-Shh og /eller anti-VEGF-neutraliserende antistof (C), når podet på brønden. For en positiv kontrol blev human VEGF (50 ng /ml) tilsat til den nedre brønd, og BMPCs blev dyrket alene som en negativ kontrol.

For at belyse virkningerne af Smo pathway modulation om migration af BMPCs

in vivo

, vi udførte Matrigel plug-analyser. Når koncentrerede supernatant fra KP-1N-celler blandet med matrigel blev implanteret subkutant i nøgne mus, blev antallet af værtsceller migrerer ind i matrigel væsentligt forøget, og cellerne dannet en snor-lignende struktur, efterligner kapillær morfogenese

in vivo

(figur 5A). For at kunne skelne BM-afledte celler fra andre stromale celler, blev eksperimentet gentaget ved anvendelse af andre kimære mus, der undergik BMT. Da vi observerede signifikant Tie2 mRNA-ekspression i BM-afledte pro-angiogene celler anvendes i

in vitro

assays (data ikke vist), blev Tie2 /LacZ-mus anvendes som donor for BMT [42]. En stor del af cellerne i matrigel stammede fra BM som afspejlet ved positiv immunfarvning for β-gal (figur 5B). Migrationen af ​​værtsceller i Matrigel plugs var svækket væsentligt, når cyclopamin blev sat til matrigel. Et lignende resultat blev også opnået under anvendelse af et anti-Shh-antistof (data ikke vist).

Matrigel plug-assay under anvendelse Tie2 /LacZ-BMT kimære nøgne mus. Vækstfaktor reduceret matrigel blandet med koncentreret konditioneret medium fra KP-1N (CM

KP-1N) blev transplanteret ind i de kimære mus. I eksperimentelle grupper, matrigel var også blandet med cyclopamin. (A) Kapillær morfogenese i matrigel blev kvantificeret ved antallet af forgreningspunkter på H-E sektioner. (B) Matrigel blev immunfarvet med β-gal. Vist er gennemsnit ± SEM af β-gal-positive celler.

Kollektivt, vores resultater viser, at inhibering af tumor-afledte Hh-signalering fører til inhibering af tumorangiogenese og destabilisering af vaskulatur med et ledsagende fald i rekruttering af BMPCs ind i tumor stroma.

Regulering af pro- og anti-angiogene faktorer Hh Signaling

for at identificere den molekylære basis for den vaskulære forstyrrelser af Hh blokade, vi kvantificeret mRNA ekspressionsniveauerne af pro- og anti-angiogene faktorer i PDAC xenografter hjælp artsspecifikke primer /probe sæt til qPCR. Konkret var vi nysgerrige efter at vide niveauerne af VEGF og SDF-1, som anses for pro-angiogene faktorer på grund af deres påviste effekter på rekruttering og fastholdelse af de pro-angiogene præcursorceller på steder af tumordannelse [34], [ ,,,0],43].

Vi fandt, at human VEGF og SDF-1-mRNA-ekspression blev reduceret med 31% og 33% i henholdsvis de cyclopaminbehandlede tumorer (Figur S7). Disse resultater er i modsætning til den beskedne nedregulering af VEGF og SDF-1-mRNA i cyclopaminbehandlede KP-1N-celler

in vitro

, enten i normoxiske eller hypoxiske betingelser (figur S8). Ligeledes blev HIF-1α stabilitet påvirkes ikke under hypoxiske betingelser

in vitro

. Desuden blokerer Shh ved neutraliserende antistof ikke forårsagede en reduktion i VEGF-mRNA i KP-1N-celler, hvilket antyder, at autokrin Shh signalering ikke bibringe en angiogen fænotype direkte på KP-1N (fig S8). I stedet disse kollektive resultater tyder på, at Hh signalering tendens påvirker stroma og at stromale-afledte faktorer kan bidrage til at fastlægge VEGF og SDF-1 i tumorcellerne

in vivo

.

Det er vist, at cancer associeret fibroblaster secernerer SDF-1 at rekruttere knoglemarv-afledte endotelceller precursorceller i tumoren stroma for at mediere angiogenese [44]. Derfor vi næste kvantificeret udtryk for disse pro- /antiangiogene faktorer ved den murine tumor stroma. Mus VEGF og SDF-1-niveauer blev ikke påvirket af cyclopamin

in vivo

(figur 6A), hvilket indikerer, at Hh ikke er involveret i modulering af disse pro-angiogene faktorer ved tumor stroma.

(A) mRNA udtryk for murine pro- /antiangiogene faktorer i xenotransplantater blev kvantificeret ved qPCR. (B, C) Co-kultur blev udført udnytte trenswell. BM-afledte pro-angiogene celler (BMPCs) blev inficeret med et lentivirus udtrykker kontrol shRNA eller Smo shRNA og co-kultur med KP-1N-celler podedes på transwell (0,4 um). RNA blev høstet fra BMPCs 12 timer efter for qPCR (normaliseret til cellerne uden KP-1 N). (D) Tube formation assay blev udført ved dyrkning af MS-1 på matrigel i nærvær eller fravær af GFP-mærket BMPCs. Kapillær morfogenese blev observeret efter 8 timers inkubation med eller uden anti-IGF-1-neutraliserende antistof. Scale bar, 500 pm. Antal filial point og inkorporering af BMPCs i røret blev kvantificeret.

Vi næste undersøgte udtryk for faktorer, der modulerer vaskulær stabilitet. I tumorer af cyclopaminbehandlede mus, bemærkede vi en markant reduktion i murine Ang-1, IGF-1, og PDGF-B-mRNA, faktorer kendt at stabilisere neovaskulatur. Ang-1 spiller en afgørende rolle under angiogenese at stabilisere neovessels [30], og dets beslægtede Tie2 receptoren udtrykkes i EC’er, pro-angiogene monocytter samt pericyt forstadier af mesenchymal oprindelse [45]. Reduktionen af ​​Ang-1 blev koblet med 86,3% opregulering af Ang-2, en naturlig antagonist for Tie2, der fører til dissociation af maleriet celle belægning for at initiere angiogenese [46] (figur S9). I et forsøg på at forstå reguleringen af ​​disse faktorer af HH signalering, vi sammenlignede deres mRNA-niveauer i BMPCs, der var co-dyrket med KP-1N celler. Ang-1 og IGF-1, men ikke PEDF-B-mRNA blev opreguleret med mere end 2-fold i en cyclopamininducerede følsom måde (figur 6B), og samtidig nedregulering af Ang-2 mRNA i forstadierne blev observeret. Den ændrede udtryk for Ang-1 og Ang-2 blev annulleret af cyclopamin, og effekten på Ang-1 /Ang-2-forholdet var dramatisk (54,3% reduktion, figur S9). Konsistente resultater blev observeret, når vi målrettet Smo i BM-afledte forstadier ved lentiviral shRNA, hvilket bekræfter, at ændringen af ​​Ang-1 genekspression ved cyclopamin skyldtes blokaden af ​​Smo-afhængige vej (figur 6C). Således Hh-afhængige Ang-1 /Tie2 signalering synes at være en af ​​de potentielle mekanismer, som BMPCs stabiliserer neovessels.

IGF-1 er et mål af Hh signalering i BM-Afledte Pro-Angiogene Cells

Reduktion i IGF-1 mRNA, vi observerede i cyclopaminbehandlede behandlede xenotransplantater (figur 6A) blev også sammenfattet i co-kultur analyser; dvs. blev den kraftige induktion af IGF-1 i BMPCs af KP-1N-afledte faktorer blokeret væsentligt enten ved cyclopamin eller shRNA mod Smo (figur 6B, C). For at verificere den rolle af IGF-1 under neovaskularisering, blev en formation rør assay udført under anvendelse af MS-1 (muse modne EF linje) med GFP-mærkede BM-afledte pro-angiogene forstadier (figur 6D). Kapillær morfogenese af MS-1 blev induceret ved BMPCs, og effekten blev forstærket, da de blev prækonditioneret i nærvær af KP-1N-celler. Påfaldende blev virkningen på kapillærdannelsen reduceret betydeligt ved behandling med et anti-IGF-1-neutraliserende antistof. Således IGF-1 er et vigtigt mål for Hh-signalering i BM-afledte celler, og nedregulering af IGF-1 i tumorxenoplantater ved cyclopaminbehandling kunne bidrage til afbrydelse af angiogenese.

Diskussion

i den aktuelle undersøgelse identificerede vi de BM-afledte pro-angiogene celler (BMPCs) som en af ​​de parakrine mål for Hh, der spiller en kritisk rolle at fremme tumorangiogenese og tumorprogression. Den destabiliseret tumorvaskulatur at vi observeret ved cyclopaminbehandling først føre os til at spekulere, at vi kan observere en reduktion i stromale Ang-1 og IGF-1, faktorer, der vides at være reguleret af Hh vej [47], [48].

Ang-1 udvikler og stabiliserer primitive vaskulatur under Hh-signalering i lungeforgrening morfogenese [49] og Shh forøgede mRNA-niveauer af Ang-1 i fibroblaster, men faldt Ang-2 [47], [50]. Vores co-kultur forsøg viste Ang-1-mRNA i BMPCs blev opreguleret af opløselige faktorer fra KP-1N i en Smo-afhængig måde, hvilket antyder en rolle forstadierne som reservoir af Ang-1 i tumormikromiljøet at stabilisere Tie2-udtrykkende EC’er samt delmængder af pro-angiogene celler. Faktisk en vis del af BM-afledte celler udtrykker også Tie-2 receptor [51], støtter en alternativ autokrin eller parakrin virkning på deres angiogen aktivitet af det omgivende stroma via Ang-1-ligand.

Der er forskellige cellulære kilder til IGF-1 i tumorstroma og reduktionen i stroma-afledt IGF-1, som vi observerede kan forklare vækstinhibering af PDAC celler

in vivo

når Hh-signalering blev blokeret [27]. IGF-1 kan også forøge aktiviteten af ​​BM-afledte celler til at fremme neovaskularisation gennem PI3K /Akt signalering [52]. I den aktuelle undersøgelse blev forøgelsen af ​​kapillær morfogenese af MS-1-celler fra de BMPCs stimuleret med PDAC celler tydeligt svækket ved anti-IGF-1 (figur 5D). Således IGF-1 synes at være en af ​​de afgørende mål for Hh-signalering i BMPCs og medierer sin virkning på neovaskularisering. Der var en signifikant reduktion i PDGF-B-ekspression i tumoren stroma

in vivo

samt i BMPCs

In vitro

; imidlertid, vores co-kultur-assay af BMPCs med KP-1N ikke påvise opregulering af PDGF-B-mRNA, hvilket antyder, at cancer-afledte Hh ligand er usandsynligt at spille en vigtig rolle i induktionen af ​​PDGF-B. Men den nedregulering af PDGF-B af cyclopamin kan delvist forklare den faldt rekruttering af pericytter i nydannede vaskulære netværk i xenotransplantater.

De molekylære mekanismer, som vi udækkede her viser tydeligt, at Hh signalering spiller en parakrin rolle i tumorprogression. Det blev for nylig rapporteret, at transkriptionel induktion af Gli kan opretholdes uafhængigt af Smo [24], og den ikke-kanoniske regulering af Gli-målgener medieres dels gennem TGF-β og Kras signalering. Faktisk de fleste PDAC celler, herunder KP-1N, udtrykke onkogene Kras og det er blevet påvist, at TGF-β-Smad pathway aktiveres i KP-1N celler [53]. Disse veje kan redegøre for den beskedne reduktion af Gli1 transskription af cyclopamin som vi observerede. Det er også muligt, at

in vivo

vækstinhibering af Hh blokade, som vi observerede kunne være medieret gennem en effekt på selvfornyelse egenskab af sjældne PDAC initierende celler [54]. Men den væsentlige ændring i proliferation /død kinetik, som vi observeret i en stor del af kræftceller i xenotransplantaterne behandlet med cyclopaminewas klart ledsaget af hæmning af angiogenese.

Cyclopamin svækket ikke blot rekruttering af BM-afledte celler til tumoren, men også deres inkorporering i tumorvaskulaturen, støtte en involvering af Hh i tumorassocieret angiogenese. Vores data støtter ikke tanken om, at autokrine signalering af Hh i cancerceller bidrager til tumor angiogenese, og snarere tyder på, at Hh udelukkende virker på stroma. Shh har vist sig at direkte styrer aktiviteten af ​​BMPCs celler ved at stimulere deres proliferation, migration og inducere angiogene faktorer til fremme af vaskulær remodellering [26], [29], [55]. Vi demonstrerede, at faktorer, der udskilles af PDAC celler kan forbedre migration af precursorceller i det mindste delvis i en Smo-afhængig måde. Der var en ekstra effekt af Hh signalering på EF-samling gennem en aktivering af BMPCs sammen med spiring moden EC’er. Vi har tidligere vist, at Shh kan forøge aktiviteten af ​​forstadierne til at fremme kapillær morfogenese af HUVEC [26].