PLoS ONE: Cirkulerende Gratis DNA som Biomarkør og Source for Mutation Detection i metastatisk kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Cirkulerende celle-fri DNA (cfDNA) i plasma har vist potentiale som biomarkør i forskellige kræftformer og kan blive en vigtig kilde til tumor mutation afsløring. Formålet med vores undersøgelse var at fastsætte en normal vifte af cfDNA i en kohorte af raske personer, og at sammenligne dette med fire kohorter af metastatisk kolorektal cancer (mCRC) patienter. Vi undersøgte også den prognostiske værdi af cfDNA og analyseret tumor-specifikke

KRAS

mutationer i plasmaet.

Metoder

Undersøgelsen var et prospektivt biomarkør evaluering i fire på hinanden følgende fase II undersøgelser, herunder 229 patienter med kemoterapi refraktær mCRC og 100 raske personer. Plasma blev opnået ud fra en EDTA-blod-prøve, og det samlede antal af DNA-alleler og

KRAS

muterede alleler blev vurderet ved anvendelse af en in-house ARMS-qPCR som tidligere beskrevet.

Resultater

Median cfDNA niveauer var højere i mCRC sammenlignet med kontroller (p 0,0001). ROC analyse viste en AUC på 0,9486 (p 0.00001). Data viste nedsat OS med stigende niveauer af baseline cfDNA både når kategorisere patienter ved kvartiler af cfDNA og ind lave eller høje cfDNA grupper baseret på den øverste normale spektrum af kontrolgruppen (Median OS 10.2 (8,3-11,7) og 5,2 (4,6-5,9 ) måneder henholdsvis HR 1,78, p = 0,0006). Multivariat analyse bekræftede en uafhængig prognostisk værdi cfDNA (HR 1,5 (95% CI 1,3-1,7) for hver stigning i cfDNA kvartil). Den overordnede overensstemmelse mellem

KRAS

mutationer i plasma og væv var høj (85%).

Konklusioner

Disse data bekræfter den prognostiske værdi af cfDNA måling i plasma og værktøj til mutation detektion med metoden præsenteret

Henvisning:. Spindler KLG, Pallisgaard N, Andersen RF, Brandslund i, Jakobsen A (2015) cirkulerende Gratis DNA som Biomarkør og Source for mutation Detection i metastatisk kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (4): e0108247. doi: 10,1371 /journal.pone.0108247

Academic Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, KINA

Modtaget: Juli 20, 2013; Accepteret: August 27, 2014; Udgivet: 13 April, 2015

Copyright: © 2015 Spindler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Denne undersøgelse blev finansieret af Research Counsil Vejle Sygehus og Tryg fonden. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, data Indsamling og analyse, desicion at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastatisk kolorektal cancer (mCRC) har en dårlig prognose og trods nylige forbedringer modstand mod terapi er stadig en stor udfordring. Søgningen efter bedre udvælgelseskriterier for terapi sammen med nye potentielt effektive behandlingsregimer for kemoterapi-resistent sygdom har trukket stor opmærksomhed i det seneste årti. Disse omfatter udvikling af nye agenter, identifikation af genetiske ændringer, der er ansvarlige for resistens og søge efter biomarkører for vejledning under behandlingen.

Tilstedeværelsen af ​​cirkulerende celle-frit DNA (cfDNA) i blodet blev rapporteret mere end 60 år siden [1]. Det er aktivt frigivet fra normale og afdøde celler, apoptosing og nekrotiserende processer, samt af komplekse vekselvirkninger mellem tumor og tilstødende ikke-tumorceller [2-5]. Celle-frit DNA kan detekteres i serum, plasma og andre legemsvæsker [6], men mekanismerne i frigivelse i blodbanen og oprindelsen af ​​DNA’et er langt fra fuldstændig forstået. Yderligere præcisering er nødvendig for at foretage en pålidelig skelnen mellem maligne stiger og ikke-kræft variationer i cfDNA.

Undersøgelser har antydet, at niveauet for cfDNA øges i begge kræftpatienter [7-8] og i diverse ikke- maligne patologiske tilstande sammenlignet med raske individer. Men en nylig metaanalyse demonstrerede, inkonsistente resultater [9]. Etablering af en normalområdet er derfor en forudsætning for yderligere undersøgelse af den potentielle rolle for cfDNA som diagnostisk markør, samt af dens anvendelighed i tidlig påvisning af gentagelser.

Cell-fri DNA er også blevet betragtet som en potentiel prognostisk markør for udfald i forskellige cancerformer [10]. For nylig rapporterede vi, at cfDNA afholdt prognostiske værdi i patienter med mCRC [11-13]. Et stort antal cfDNA alleler i plasma konsekvent korreleret med en dårlig samlet overlevelse (OS) i vore patienter behandlet med thirdline kemoterapi for mCRC, mens patienter med en plasmakoncentration af cfDNA lav havde en længere median OS. Verifikation af disse resultater i større kohorter er yderst relevant at etablere det kliniske potentiale cfDNA.

Ud over sit potentiale som et diagnostisk værktøj og prognostisk markør, cfDNA er også en værdifuld kilde til påvisning af tumor-specifikke mutationer i den perifere cirkulation af kræftpatienter [14-16]. I mCRC, der er en høj frekvens af

KRAS

mutationer, som er ansvarlige for modstand mod de udbredte monoklonale antistoffer rettet mod EGFR [17]. Molekylær analyse af genomiske ændringer er normalt udføres på arkivering tumorvæv, men der har været bekymring for, at denne tilgang ikke i tilstrækkelig grad afspejler sygdommen biologi på tidspunktet for indledningen af ​​målrettet EGFR-behandling, som ofte er flere år fra den primære diagnose og /eller kirurgi. Desuden gentagne biopsier er ikke muligt af praktiske og etiske grunde. Derfor kan brugen af ​​cfDNA til påvisning af disse tumor-specifikke mutationer være en attraktiv tilføjelse til bedre patient valg for målrettede behandlinger i fremtiden.

De anvendes til DNA kvantificering metoder har varieret over tid, der spænder fra simple qPCR metoder til komplekse straalende teknologier og dybe næste generation sekventering [18,5]. Følsomheden og specificiteten af ​​analysen har forbedret mange folder siden de indledende undersøgelser, men anvendelserne af forskellige prøveudtagningssteder materialer og fremgangsmåder til cfDNA kvantificering, foruden inkonsekvent rapportering, har komplicerede en gyldig sammenligning af resultaterne fra forskellige undersøgelser. Nylige fremskridt i teknologiske metoder har gjort det muligt for os at udvikle en meget følsom qPCR metode til kvantificering cfDNA i plasmaprøver, hvilket også er muligt i laboratoriet. Det har givet os mulighed for at undersøge biomarkør potentiale cfDNA i en stor kohorte af kræftpatienter og raske kontrolpersoner.

Formålet med den foreliggende undersøgelse var at fastsætte en normal vifte af cfDNA i en kohorte af raske individer og sammenligne dette cfDNA sortiment med dem fra fire forskellige kohorter af patienter behandlet for mCRC. Derudover har vi til formål at validere den prognostiske værdi af de før behandling niveauer af cfDNA og analysere tumor-specifikke

KRAS

mutationer i plasmaet.

Materialer og metoder

Undersøgelse design

i alt 100 raske personer og 229 FRK patienter blev undersøgt. Undersøgelsen blev udført som en potentiel biomarkør undersøgelse i fire på hinanden følgende fase II og biomarkør undersøgelser nemlig Cetuximab undersøgelse [11,20], er TIRASMUS (ClinicalTrials.gov identifikator NCT00827684, [12], PG (ClinicalTrials.gov identifikator; NCT01109615 [ ,,,0],13] og GemCap (ClinicalTrials.gov identifikator NCT01472770, [32] forsøg udført på Institut for Oncology, Vejle Sygehus, Danmark, fra april 2005 til november 2012 Alle fire fase II studier omfattede patienter med kemoterapi refraktær sygdom og biomarkør kollektion var prospektivt gennemført.

det primære endepunkt var korrelation af cfDNA til OS, sekundær progressionsfri overlevelse (PFS) og evaluering af forskellen mellem raske kontroller og FRK patienter, ud over sammenhængen mellem tumor KRAS (tKRAS) og . plasma KRAS (pKRAS) afsløring data præsenteres i henhold til bemærkning retningslinjer

Patienter

inklusionskriterierne i forsøgene, svarede:. histopatologisk verificerede stadie IV mCRC, behandlingssvigt efter udsættelse for flouropyrimidine, oxaliplatin og irinotecan, indikation for tredje eller fjerde linie behandling, ECOG performance status (PS) 0 til 2, og tilstrækkelig organfunktion.

KRAS

BRAF

status bestemt optagelse i TIRASMUS og PG forsøg, men ikke i de Cetuximabs eller GemCap undersøgelser.

RECIST version 1.1 og NCI-CTCAE version 4.0 var bruges til at undersøge de endpoints i GemCap og PG undersøgelser, mens der i de tidligere forsøg blev RECIST version 1.0 og NCI-CTCAE version 3.0 anvendes.

Alle patienter forudsat underskrevet informeret samtykke, før undersøgelsens start og den relevante lovgivningsmæssige og etik udvalg (dansk Lægemiddelstyrelsen og Den regionale Videnskabsetiske komité for det sydlige Danmark) godkendte de undersøgelser, før påbegyndelse. De kliniske forsøg er gennemført i overensstemmelse med de god klinisk praksis retningslinjer udstedt af den internationale konference om harmonisering og Helsinki-deklarationen.

Behandling

Den Cetuximab Study.

Behandling omfattede irinotecan (350 mg /m

2) hver tredje uge, med ugentlig 250 mg /m

2 af cetuximab (initial mætningsdosis var 400 mg /m

2), indtil progression eller uacceptabel toksicitet. evaluering Reaktion blev udført hver tre cyklusser af behandlingen.

TIRASMUS.

Patienterne fik behandling med mTOR-hæmmer temsirolimus 25 mg hver uge indtil progression. Derefter blev patienterne behandlet med kombinationsbehandling bestående hver anden uge irinotecan (180 mg /m

2) og ugentlig temsirolimus indtil progression eller uacceptabel toksicitet. evaluering Reaktion blev udført hver 6. uge.

PG.

Patienterne fik pemetrexed (oprindeligt 500 mg /m

2 hver 3. uge) + gemcitabin (1250 mg /m

2, dage 1 og 8), indtil eller uacceptabel toksicitet. evaluering Reaktion blev udført hver tre cyklusser af behandlingen.

GemCap.

Patienterne fik capecitabin (2000 mg /m

2, dag 1-7, q2w) kombineret med gemcitabin (1000 mg /m

2, dag 1), indtil progression eller uacceptabel toksicitet, og respons blev vurderet hver 12. uge.

sund kontrolgruppe

den sunde individuelle kohorte blev valgt fra Diabetes Biobank Vejle (godkendt af dansk data Protection Agency (tidsskrift nr. 2006-53-1385) og dansk Videnskabelige Komité (projekt-ID S-20.080.097)).

Personer blev udvalgt på grundlag af aldersgrupper, og The National danske Patient Register blev åbnet for ICD-10 koder for at sikre en mangel på betydelig co-morbiditet (ICD-10 C, D, i og M-koder). Informeret samtykke blev opnået fra hver enkelt for brug af blodprøver, og undersøgelsen er godkendt af den regionale videnskabsetiske komité for det sydlige Danmark for denne ekstra markør analyse.

Stikprøver af translationelle forskningsundersøgelser

Indsamling af primær tumor væv og blodprøver til translationel forskning er en standardprocedure i forsøg, der gennemføres i vores afdeling. Efter informeret samtykke blev blodprøver forbehandling trukket forud for den første cyklus af behandlingen. Metoderne til kvantificering af cfDNA og muterede

KRAS

alleler i plasma er blevet beskrevet tidligere [11], og oplysninger af primere og prober er tilgængelige online. Plasma blev opnået fra blodprøver opsamlet i EDTA-rør og centrifugeret ved 2000

g

i 10 minutter i løbet af 2 timer efter opsamling, inden de blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Alle prøver blev analyseret, blindet for undersøgelsen endpoints.

DNA rensning

DNA blev oprenset fra 1 ml plasma ved hjælp af en QIAsymphony virus /bakterier midi-kit på en QIAsymphony robot (Qiagen), ifølge producentens instruktioner. DNA blev elueret i 110 ul. AVE buffer, som blev leveret med kittet.

Cell-fri DNA kvantificering

For at bestemme niveauet af cfDNA, størrelsen af ​​den peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A) gen (gCYC, HUGO gen forkortelse PPIA) blev målt ved en in-house qPCR assay som beskrevet i [11]. Assays blev kørt i dublicates eller tredobbelte og 5 ul DNA blev anvendt i hver 25 ul PCR-reaktion. For hver PCR en pulje af genomisk DNA blev inkluderet som en positiv kontrol og vand som negativ kontrol. CV for gCYC analysen baseret på den positive kontrol pulje blev bestemt til at være 19%. Vand kontroller var altid negative.

Primere og prober til in-house gCYC blev designet ved hjælp af OLIGO 7-software (Molecular Biology Insights Inc, Cascade, CO) (tilgængelig online, sekvens tiltrædelse nummer NG_029697.1). Den fremadrettede primer er placeret i intron 1-2, sonden i exon 2 og den omvendte primer i intron 2-3 (Forward ACATGGGTACTAAGCAACAAAATAAG, Reverse CACAATTGGAACATCTTTGTTAAAC, Probe Fam-TTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCA-Tamra). BLAST søgning blev udført, og ingen uspecifikke mål blev forudsagt. Analyse af qPCR data blev udført under anvendelse af SDS software ver. 2.2.2 og CQ værdier blev bestemt ved hjælp af automatisk baseline indstilling og fast tærskelværdi på 0,2. Kvantificering af cfDNA blev gjort ved at beregne kopi antal

gCYC

alleler som 10

y-skæringspunkt (gCYC) -mean Cq (gCYC) /hældning (gCYC) og normalisere dette til plasmavolumen.

KRAS mutation detektion og kvantificering

KRAS

analyse af arkivering tumorvæv fra FFPE blev udført i Cetuximab studiet med FDA-godkendte

KRAS

DxS kit (Qiagen), som tidligere rapporteret. Tumorprøver fra TIRASMUS, PG og GemCap forsøg blev analyseret med en valideret in-house assay. De interne analyser er baseret på Amplification Refractory Mutation System-kvantitativ PCR (ARMS-qPCR) metode og registrerer 6 mutationer i

KRAS

codon 12 (Gly12Ala, Gly12Arg, Gly12Asp, Gly12Cys, Gly12Ser, og Gly12Val) og en mutation i kodon 13 (Gly13Asp). Primere og prober til in-house

KRAS

analyser, samt

KRAS

mutation kontrol PCR-fragmenter, der er designet ved hjælp af OLIGO 7-software (Molecular Biology Insights Inc, Cascade, CO) ( tilgængelige online, sekvens tiltrædelse nummer NW_001838052.1). Assayet er placeret i exon 2 af KRAS-genet. Analyse blev udført som beskrevet ovenfor. En sammenligning af de to metoder for mutation detektion i tumorvæv er tidligere blevet offentliggjort og viste fuldstændig enighed [19] og standard kurver er tilgængelige som online materiale [11]. Detekteringsfølsomheden varierede mellem 0,03% -0.001% afhængig af typen af ​​mutation påvises, 12asp (1/200000, 0,0005%), 12Cys (1/200000, 0,0005%), 12ser 1/7000, 0,0143%), 13asp 1 /3000, 0,0333%), 12 ALA (1/100000, 0,0010%), 12Val (1/200000, 0,0005%), 12arg (1/200000, 0,0005%), henholdsvis). En blanding af mutation positive kontrolprøver fragmenter og genomisk donor-DNA blev inkluderet i hver PCR-kørsel og vand som negativ kontrol. En prøve af ren genomisk donor-DNA blev inkluderet for at bestemme specificiteten af ​​assays (data præsenteres i [11]). CV for hver KRAS mutation assay og for gCYC analysen blev bestemt på grundlag af data fra PCR-analyser over en periode på 20 måneder og var mellem 18% og 32%. Vand kontroller var altid negative. Kvantificering af

KRAS

blev gjort ved at beregne kopi antal muterede

KRAS

alleler som 10

y-skæringspunkt (KRAS) -mean Cq (KRAS) /hældning (KRAS) og normalisering dette til plasmavolumen.

Statistisk analyse

En beskrivende sammenligning af cfDNA niveauer blev udført med to-sidet t-test og Wilcoxon rank sum test. Den øvre normale grænse, som defineret af middelværdien + 2SD i kontrolgruppen, blev anvendt til eksplorativ afskæringsværdi for overlevelse analyse. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere PFS og OS. En multivariat Cox regressionsanalyse blev udført for at undersøge, om de forskellige variabler blev forbundet med nedsat overlevelse, herunder cfDNA niveauer og testning for baseline karakteristika (alder, køn og PS) med potentielt indflydelse (kendt prognostiske faktorer eller væsentlige eller grænsetilfælde parametre f.eks p 0,02 ) på overlevelse. En modtager drift kurve (ROC) analyse blev anvendt til at beskrive udførelsen af ​​cfDNA og pKRAS. P-værdier nævnt tohalede tests og blev betragtet som signifikante, når p ≤ 0,05. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af NCSS statistisk software 2007 v.07.1.5 (NCSS Statistisk Software, Utah 84037, USA, www.ncss.com).

Resultater

Patient karakteristika

sygdom og forbehandling patientkarakteristika er præsenteret i tabel 1. Gennemsnitsalderen i den samlede kohorte af patienter var 63 år (spændvidde 35-82), og de fleste var mænd, for det meste i god performance status. Der var ingen signifikante forskelle i alder, køn eller performance status mellem de 5 årgange.

Den sunde individuelle kohorte omfattede 10 mænd og 10 kvinder i alderen 25-44 år, 20 mænd og 20 kvinder i alderen 45- 59 og 60-75.

de fleste af de patienter, der indgår i forsøgene havde tilgængelige blodprøver. Således blev i alt 229 patienter inkluderet fra de fire forsøg, og 223 havde til rådighed tumorvæv og 211 en matchende baseline plasma prøve. De manglende resultater var på grund af dårlig kvalitet tumor DNA eller på grund af utilstrækkelig mængde af plasma i prøverne.

Cellefrie DNA- og forbehandling egenskaber

De mediane cfDNA niveauer i de enkelte kohorter er anført i tabel 1. Cellefri DNA-niveauer blev analyseret for korrelation over for sygdomme og forbehandling egenskaber. Der var ingen signifikante forskelle i median cfDNA niveauer alt efter alder eller køn, men væsentligt højere koncentrationer cfDNA med stigende PS (tabel 1).

Cell-fri DNA i kræftpatienter sammenlignet med raske individer

Middel- og median koncentrationer af cfDNA i kontrolgruppen var 2800 og 2400 alleler per ml plasma henholdsvis i et område fra 800 til 14000 alleler per ml plasma. Den mediane niveau cfDNA på hele kohorte af kræftpatienter var 17900 alleler per ml plasma (interval fra 800 til 4.618.400). Fig 1A viser forskellene i cfDNA koncentrationer i plasmaet fra raske kontroller og baseline prøver fra de forskellige kohorter af kræftpatienter. Data er præsenteret som en kasse plot af værdier på en logaritmisk skala, og niveauet hos kræftpatienter var markant højere end i den raske kontrolgruppe. Niveauerne af cfDNA var ens mellem kohorter af kræftpatienter. Forskellene i cfDNA var meget signifikant mellem kontrolgruppen og alle individuelle grupper af kræftpatienter (alle p-værdier var 0,0001). Beføjelsen til at skelne mellem raske personer og kræftpatienter blev testet ved at estimere ROC og arealet under kurven (AUC) som påvist i fig 1B. AUC var 0,9486 (95% CI ,9182-0,9679, s 0,00001).

A skildrer Box og knurhår plots med 25%, 50%, 75% fraktiler, øvre og nedre tilstødende værdier og outliers (prikker) . Vandret den fire kliniske forsøg kohorter og kontrolgruppen, lodret den cfDNA koncentration på en logaritmisk skala. C cetuximab undersøgelse, GemCap GemCap kohorte, PG PG undersøgelse kohorte, T TIRASMUS undersøgelse kohorte, Controls sund kontrolgruppe. B Viser en receiver drift kurve (ROC) estimering ydeevne cfDNA at skelne mellem patienter med tarmkræft og kontroller. AUC var 0,9486, (95% CI ,9182-,9679, s 0,00001).

Den prognostiske værdi af cfDNA i kræftpatienter

Overlevelse analyse ifølge cfDNA niveauer præsenteres særskilt for de enkelte kræft grupper med de primære forsøgsresultater [11-13]. En samlet analyse af alle patienter bekræftede en kortere samlet overlevelse med stigende niveauer af baseline cfDNA. Fig 2A viser Kaplan-Meier kurver OS i de patienter, opdelt i de fire grupper efter kvartiler af cfDNA niveauer. OS af patienterne kategoriseret i lave eller høje cfDNA koncentration grupper baseret på den øvre normale område for kontrolgruppen (defineret som middelværdi cfDNA + 2SD = 7100 alleler per ml) er vist i fig 2B. Cox regression multivariat analyse, herunder alder ( / 63 år), køn, PS og cfDNA kvartiler (behandlet som en kontinuerlig variabel) bekræftede en uafhængig prognostisk værdi cfDNA i hele kohorten. Som en kontinuerlig variabel, der var en OS Hazard Ratio på 1,5 (95% CI 1,3-1,7) for hver stigning i cfDNA niveau kvartil (tabel 2).

A. Patienterne er grupperet efter kvartiler af cfDNA (fra højre) laveste, næstlaveste, næsthøjeste og højeste kvartil af cfDNA. Den gennemsnitlige OS ifølge cfDNA kvartiler var; 10,2 måneder (95% CI 8.9-12.8), 7,8 måneder (5.7-9.3), 5,0 måneder (4.3-6.0) 3,5 måneder (3,0-3,9), hhv. B. Patienter er grupperet efter den øvre normale område som defineret af gennemsnitlig cfDNA + 2SD i kontrolgruppen (7100 alleler per ml.) Lav risikogruppe (fuld linje), Median OS, 10,2 måneder (8.3-11.7). Højrisikogruppe (stiplet linje) Median OS, 5,2 måneder (4,6-5,9). HR 1,78, p = 0,0006.

Påvisning af KRAS mutationer i tumor og plasmaprøver

I alt 211 patienter havde både tumor og plasmaprøver til rådighed for pålidelig detektering af

KRAS

mutationer. Plasma prøver med et lavt antal cfDNA alleler blev ikke udelukket fra analysen. Tumor-specifikke

KRAS

mutationer blev påvist i alt 119 plasmaprøver. Den samlede overensstemmelse mellem mutation status i tumoren og plasma var høj: (180/211 = 85%) og 112 af de 140 tumorprøver med mutationer demonstreret

KRAS

mutationer i plasmaprøverne også, mens kun tre tilfælde blev observeret hvor patienterne havde en påviselig mutation i plasmaet, men ikke i den primære tumor.

Cell-frit DNA og korrelation med tumor-specifikke KRAS-mutationer

sammenhæng mellem antallet af samlede celle frit DNA alleler og antallet af muterede KRAS alleler i KRAS muterede patienter blev analyseret ved Spearman rank korrelation. På grund af den brede vifte af kvantitative niveauer blev anvendt en logaritmisk skala. Som vist på figur 3, som viser cellefri DNA vertikalt, og antallet af muterede KRAS alleler vandret disse blev stærkt korreleret Fig 3 (R

2 = 0,97, Spearman rank = 0,86, p 0,000). Dette bekræfter de foreløbige data fra cetuximab undersøgelse [11), og indikerer, at en betydelig del af oprindelsen cfDNA fra tumor-DNA (som repræsenteret ved DNA med tumor specifikke KRAS mutationer)

Dette plot illustrerer den stærke korrelation mellem det samlede antal af DNA-alleler og antallet af muterede alleler i patienterne med KRAS mutationer påvises. Spearman rank korrelation blev beregnet til 0,86 og r

2 = 0,97 (

s

0,0000). De forskellige symboler repræsenterer de enkelte kohorter af kræftpatienter. (Square PG korrelation = 0,9, cirkel cetuximab korrelation = 0,88, trekant GemCap korrelation = 86, pentagon TIRASMUS korrelation = 0,67).

Diskussion

Øget fokus på translationel forskning og seneste teknologiske fremskridt har givet ny indsigt i den kliniske betydning af cfDNA i cancer og dets potentiale til påvisning tumorspecifikke mutationer i perifere kredsløb.

Som et mål for den totale mængde cfDNA, denne undersøgelse undersøgte antallet af alleler af den cyclophilin genet, og bekræftet et højere niveau i FRK patienter end hos raske kontrolpersoner. En søgning efter lignende undersøgelser afslører inkonsistente resultater; dog forskelle i testpræparater metoder foretage direkte sammenligninger vanskelige. Generelt er der variationer i den anvendte metode til DNA-oprensning, reference-genet målt, og kohorter af de undersøgte individer. Ikke desto mindre et par studier i CRC patienter støtte vores data [21-24]. En meget nylig undersøgelse udforskede MP nytte af cirkulerende plasma-DNA i patienter med fremskredne cancere under anvendelse af en anden metodologi, der viser generelt højere niveauer af cfDNA i CRC, bryst, prostata og andre kræftformer end i raske kontroller [8]. Men den stikprøve af denne undersøgelse ikke mulighed for etablering af en normalområdet (n = 20), men dens resultater gør understøtter de nuværende data. En nylig observation i lokalt fremskreden rektal cancer, trods anvendelse af en anden metode til måling cfDNA, afslørede også en væsentlig forskel i cfDNA niveauer mellem kontroller og tidligt stadium rektal cancer [25]. Evnen til at skelne cfDNA niveauer mellem vores kolorektal kræftpatienter og raske kontrolpersoner var fremragende, at der er behov for yderligere undersøgelser af cfDNA i tidligere tumor stadier og forstadier til kræft. Desuden skal variationen af ​​cfDNAin individer med ikke-kræft comorbiditet at blive yderligere belyst, at tage højde for mulige skævheder. Den foreliggende undersøgelse understreger også den vigtige biologiske rolle cfDNA i denne sygdom. Den forhøjede koncentration af cfDNA i kræftpatienter og korrelation med en række muterede alleler viser også, at cfDNA er stort set tumorafledte, selvom oprindelsen stadig udefineret.

Der er behov for yderligere værktøjer til bedre udvælgelse af patienter til behandling i stærkt forbehandlet mCRC. I fire fortløbende udført kliniske fase II studier har vi bekræftet et ensartet cfDNA og en klar prognostisk værdi.

En nyligt offentliggjort undersøgelse fra vores gruppe har illustreret, at cfDNA er ikke blot et mål for tumor byrde [ ,,,0],26]. I stedet foreslår vi, at den samlede cfDNA er mere tilbøjelige til at afspejle både tumor byrde og biologiske mekanismer, og er derfor et mere komplekst billede af sygdommen på et bestemt tidspunkt. Ligheden af ​​baseline niveauer mellem de fire fase II studier, vi observerede illustrerer homogeniteten af ​​patienternes kohorter. Patienterne blev alle udvalgt på baggrund af sand kemoterapi refraktær status snarere end behandlingsforløb, som kan variere baseret på definitioner og tidligere behandlingsstrategier, og er således en mindre præcis definition af fremskredent stadium af sygdommen. En sammenligning mellem vores kohorter og efterfølgende sammenlægning af data er derfor berettiget som understøttes også af den multivariate analyse. Forskning i kemoterapi naive patienter bør være i fokus i fremtidige studier.

Højere baseline niveauer viste en stærk korrelation med dårlig prognose, først når de analyseres i den enkelte fase II studier, sekund, når vurderes efter kvartiler af cfDNA niveauer i den samlede CRC kohorte, og endelig når opdelt i høje og lave koncentrationer grupper baseret på den maksimale cfDNA niveauet hos raske personer. Endvidere den kombinerede analyse tilladt for en pålidelig multivariat analyse, der bekræftede, stærk prognostisk indvirkning cfDNA som en kontinuerlig parameter. Den prognostiske værdi af cfDNA er blevet beskrevet i forskellige cancere, men kun få i forhold til kemoterapi [15-16, 27]. Den nyligt offentliggjorte rapport fra Perkins et al er i overensstemmelse med vores data og er en af ​​de få studier, der undersøger cfDNA hos patienter behandlet for fremskreden kræft [8].

Terapi for CRC vil utvivlsomt fortsætte med at udvikle i retning målrette individuelle molekylære karakteristika af sygdommen. Men tumor heterogenitet, genomisk ustabilitet, og klonede molekylær evolution stiller store krav til en præcis og rettidig karakterisering. Udførelse gentagne tumorbiopsier er blevet gjort, men er besværligt og indebærer en risiko for patienten. Ved hjælp af plasma som en flydende biopsi for mutations detektion har mange fordele, og kunne overvinde de problemer, der er forbundet med gentagne tumorbiopsier. Gentagen testning under behandling gøres nemt, og den foreliggende fremgangsmåde udviklet til påvisning

KRAS

mutationer er muligt, relativt billig, hurtig og kan udføres på en storstilet grundlag. Imidlertid vil den foreliggende qPCR teknologi tillader kun et begrænset antal PCR-reaktioner kørt per prøve. Da

KRAS

har en overvejende klinisk effekt og en høj frekvens i mCRC denne tilgang er stadig mulig, mens metoder såsom næste generations sekventering kan blive relevant, hvis flere mutationer med potentiel klinisk betydning og tilgængelige mål er afsløret. Men på dette tidspunkt, en enkel og gennemførlig metode til disse undersøgelser synes, den mest rationelle tilgang, især i betragtning af, at der er tilstrækkelige stikprøvestørrelser for pålidelige kliniske undersøgelser er af allerstørste betydning.

Påvisning på tumor-specifikke mutationer i plasma afhænger af specificiteten og følsomheden af ​​analysen, som kan øges ved præ-analyse amplifikationstrinnene, samt af mængden af ​​cfDNA i prøven. Sidstnævnte kan overvindes ved at det oprindelige volumen af ​​plasma analyseret. Disse aspekter skal overvejes, når man behandler overensstemmelsen mellem primær tumor og plasma mutation status, som var højt med vores metode i forhold til de få relevante undersøgelser i litteraturen [28-30]. Årsager til uoverensstemmelse omfatter mulige dårlige kvalitet af DNA ekstraheret fra paraffinindlejret arkivering tumorvæv, eller sand sygdom heterogenitet og klonede molekylær evolution i flere behandlingsforløb.

Det er klinisk relevant at undersøge, om p

KRAS

kan anvendes som et udvælgelseskriterium for EGFR-inhibitor behandling i stedet for t

KRAS

detektion. De nuværende data og en lignende tidligere rapport [31] tyder på, at p

KRAS

status har en stærk prædiktiv værdi i denne indstilling. Dette gælder også for de kohorter af vores patienter, som ikke blev behandlet med EGFR-hæmmere. Dog bør resultater fra vores lille ikke-randomiserede undersøgelser fortolkes med forsigtighed og yderligere undersøgelser i større stikprøvestørrelser, helst i randomiserede undersøgelser, er berettiget.

Vi har givet test og validering kohorter med passende stikprøvestørrelser for multivariat analyse af den prognostiske værdi og for definitionen af ​​en normal vifte af cfDNA. Den foreliggende undersøgelse bekræfter den prognostiske anvendelighed af cfDNA i plasma og gennemførlighed for mutations test med metoden præsenteres. Vi opfordrer til en samlet indsats for at sammenligne, validere og fremadrettet undersøge rolle cfDNA kvantificering i kræft, med det overordnede perspektiv omsætte resultater i klinisk behandling af patienter med fremskredne kræftsygdomme.

Tak

Vi oprigtigt takke Research råd, Lillebælt Hospital, Asta og Peter Götz-Petersens Fundation, og Novo Nordisk Fonden til finansiering af undersøgelsen.