PLoS ONE: Integrativ Genomics implicerer EGFR som en downstream Mediator i NKX2-1 Amplified Ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

NKX2-1

, der koder for en homeobox transskription faktor, forstærkes i ca. 15% af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), hvor det menes at drive kræft celleproliferation og overlevelse. Men dens virkningsmekanisme forbliver stort set ukendt. For at identificere relevante downstream transkriptionelle mål, her er vi gennemført en kombineret NKX2-1 transkriptom (NKX2-1 knockdown efterfulgt af RNAseq) og cistrome (NKX2-1 bindende websteder ved ChIPseq) analyse i fire

NKX2-1

– amplificerede humane NSCLC cellelinier. Mens NKX2-1 regulerede gener forskelligt for de fire cellelinjer analyseret, celleproliferation blevet et fælles tema. Endvidere i 3 af de 4 cellelinjer, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) var blandt top NKX2-1 opreguleres mål, som vi bekræftet på proteinniveau ved western blot. Interessant EGFR knockdown førte til opregulering af NKX2-1, hvilket antyder en negativ feedback-sløjfe. I overensstemmelse med denne konstatering, kombineret knockdown af NKX2-1 og EGFR i NCI-H1819 lungecancerceller reduceret celleproliferation (samt MAP-kinase og PI3-kinase signalering) mere end knockdown af enten alene. Ligeledes NKX2-1 knockdown forbedret vækst-inhibitoriske virkning af EGFR-inhibitor erlotinib. Tilsammen vores resultater implicerer EGFR som en nedstrøms effektor af NKX2-1 i

NKX2-1

forstærket NSCLC, med mulige kliniske implikationer, og giver en rig datasæt for at undersøge yderligere mediatorer af NKX2-1 drevet onkogenese.

Henvisning: Clarke N, Biscocho J, Kwei KA, Davidson JM, Sridhar S, Gong X, et al. (2015) Integrativ Genomics implicerer EGFR som en downstream Mediator i

NKX2-1

Amplified Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (11): e0142061. doi: 10,1371 /journal.pone.0142061

Redaktør: Jen-Tsan Ashley Chi, Duke University, UNITED STATES

Modtaget: Januar 26, 2015; Accepteret: 16 oktober 2015; Udgivet: November 10, 2015

Copyright: © 2015 Clarke et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Den komplette datasæt af rå RNAseq og ChIPseq læser er tilgængelig på NCBI Sequence Læs Arkiv (tiltrædelse SRP045118)

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra tobaksrelaterede sygdomme Research Program (21XT-0054). NC blev støttet af stipendier fra Gates Millennium Foundation og Stanford Cancer Biology Program, og JMD fra Stanford Tumor Biology Training Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lunge cancer udgør det største antal kræftrelaterede dødsfald i USA [1]. Der er to hovedklasser, småcellet lungecancer og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), idet sidstnævnte repræsenterer omkring 85% af tilfældene, og inklusive adenocarcinom, pladecellecarcinom, og store celle carcinom histologier [2]. Blandt NSCLCs, anerkendte kræft bilister omfatter aktiverende mutationer i

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

og

ERBB2

(HER2), samt rearrangementer af

ALK

ROS1

[3]. Nogle af disse, først for nylig identificeret, er nu værdifulde terapeutiske mål, hvilket understreger vigtigheden af ​​at definere nye molekylære mål og mekanismer.

NKX2-1

(også kaldet

TITF1

og

TTF-1

) koder for et homeobox transskriptionsfaktor, og findes amplificeret ved cytoband 14q13 i omkring 15% af NSCLCs (overvejende adenocarcinomer) [4, 5]. Forståelse dens mekanismer kan give ny indsigt i lunge carcinogenese, og nye strategier for terapi. NKX2-1 udtrykkes i normale udvikle lunge (samt skjoldbruskkirtlen og forhjerne) [6], hvor det er afgørende for organogenese. I den voksne lunge, er NKX2-1 udtryk begrænset til klubbens celler (Clara) og type II pneumocytter, hvor det regulerer surfactantproduktion.

I årevis har NKX2-1 udtryk blevet brugt af patologer at udlede en lunge oprindelsen af ​​carcinomer [7]. For nylig,

NKX2-1

er mere direkte forbundet med lungekræft, hvor gen locus amplificeres i nogle tilfælde fører til øget lungekræft celleproliferation og overlevelse [8-11]. Mens dens dobbelte rolle i førerens lunge udvikling og differentiering på den ene side, og lungecancer (ofte betragtet som de-differentiering) på den anden forekomme paradoksalt, NKX2-1 passer godt ind en ny klasse af “lineage-overlevelse” onkogener-ofte beherske transkriptionelle regulatorer af normal celle afstamning, der bliver dereguleret i kræft stammer fra den slægt [12]. Andre eksempler er androgen receptor (AR) i prostatakræft, og MITF i melanom.

Nylige undersøgelser har identificeret kandidat downstream mediatorer og samarbejdspartnere i NKX2-1 onkogenese, herunder ROR1 [13] og LMO3 [14]. Ikke desto mindre, de mekanismer, hvorved NKX2-1 bidrager til lunge carcinogenese stort set ukendt. I visse sammenhænge (hovedsagelig i mus), Nkx2-1 synes at fungere mere som en tumorsuppressor, inhibering Kras-drevet lungekræft og lungekræft metastase [15, 16]. Her at afdække onkogene mekanismer i human lungecancer, vi gennemført en kombineret transkriptom (NKX2-1 knockdown efterfulgt af RNAseq) og cistrome (NKX2-1 bindingssteder af Chip-seq) analyse i

NKX2-1

amplificerede NSCLC cellelinier. Blandt vores resultater, vi identificerer EGFR som en nedstrøms effektor af NKX2-1 drevet celleproliferation. Vores resultater giver ny indsigt i mekanismerne i NKX2-1 medieret lungekræft, og et datasæt for fortsat udforskning.

Materialer og metoder

Cell kultur

NCI-H1819, NCI-H661, HCC1195 og HCC1833 cellelinjer blev opnået fra Dr. John Minna (University of Texas Southwestern Medical center) [17-20], hvor de blev bekræftet ved kort tandemgentagelse-analyse. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i RPMI-1640-medium med L-glutamat, suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum og 1X Pen /Strep.

NKX2-1 isoform-ekspression

En fuld-længde NKX2-1 cDNA klon (i pOTB7) blev opnået fra Origene. DNA-konstruktioner svarende til NKX2-1 transkript variant 1 (NM_001079668.2; koder 401 aminosyrer) og NKX2-1 transcript variant 2 (NM_003317; kodende 371 aminosyrer, fraværende de N-terminale 30 aminosyrer af isoform 1) var PCR- amplificeret fra Origene plasmidtemplate, sekvensspecifik bekræftet, og derefter subklonet i BamHI og Xhol-stederne i pCDNA6 (Invitrogen). PCR-primere var: variant 1-F TCGAGGATCCCATGTGGTCCGGAGGCAG; variant 2-F TCGAGGATCCCATGTCGATGAGTCCAAAGCAC; variant 1/2-R GATCCTCGAGTCACCAGGTCCGACCG. Expression konstruktioner blev transficeret ind 293T-celler (American Type Culture Collection) ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Life Technologies) efter fabrikantens protokol, og cellelysater indsamlet 48 timer senere.

siRNA transfektion

For siRNA transfektion , 25,000-100,000 celler pr plade med 6 brønde brønd eller 750,000-1,500,000 celler pr 10cm plade blev udsået og transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Life Technologies) ved at følge fabrikantens protokol. Alle siRNA’er var On-TARGETplus puljer købt hos Dharmacon /GE Healthcare (tabel A i S1 File) og transficeret i en endelig siRNA koncentration på 50 nM (medmindre andet er angivet) i 16 timer.

Western blot

Celler blev lyseret i RIPA-buffer (Millipore) suppleret med 1 mM natriumorthovanadat, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, og 1X proteaseinhibitorcocktail (Roche). Derefter 40ug lysat blev kørt på en 4-12% polyacrylamidgel (Biorad) og overført til PVDF-membran (Biorad). Primære antistoffer blev anvendt, var NKX2-1 (Santa Cruz Biotechnology, H-190, 1: 200), EGFR (Cell Signaling, D38B1, 1: 1000), MAPK (ERK1 /2-) (Cell Signaling, 137F5, 1: 1000), p-MAPK (ERK1 /2-) (Thr202 /Tyr204) (Cell Signaling, D12.14.4E, 1: 1000), AKT (Cell Signaling, C67E7, 1: 1000), p-AKT (Ser473) (Cell Signaling, D9E , 1: 1000), og α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, 1: 1000). Alle sekundære antistoffer var HRP-konjugeret og SuperSignal West Pico Kemiluminescens (Pierce), der anvendes til påvisning. Western blots blev kvantificeret under anvendelse ImageJ. Alle Western blot resultaterne er repræsentative for flere uafhængige forsøg.

Celleproliferation /levedygtighed assay

Celleproliferation /levedygtighed blev kvantificeret 0, 24, 48, 72 og 96 timer efter transfektion ved kolorimetrisk assay baseret på den metaboliske spaltning af tetrazolium-salt WST-1 i levedygtige celler, ifølge producentens protokol (Roche). I nogle forsøg blev erlotinib (Santa Cruz Biotechnology) tilsættes ved angivne koncentrationer (eller kontrol køretøj). IC

50 værdier blev bestemt ved at tilpasse en ulineær log (inhibitor) versus responskurve under anvendelse af GraphPad Prism.

RNAseq

Cellelinjer blev transficeret med enten en NKX2-1-targeting siRNA pool eller en ikke-targeting kontrol (NTC) siRNA pool i 16 timer. Totalt protein (til bekræftelse NKX2-1 knockdown) og RNA (af Qiagen RNAeasy mini) blev opsamlet 40 timer efter transfektion. QRT-PCR blev udført først at verificere reduceret transskript for NKX2-1, samt en kendt NKX2-1 reguleret gen, SFTPB [21]. For q-RT-PCR, blev cDNA fremstillet under anvendelse SuperScript II (Life Technologies), og derefter qPCR blev gjort i mindst tredobbelte under anvendelse TaqMan reagenser (Applied Biosystems) på en ABS Fast 7500 instrument. Relative transkriptniveauer blev beregnet ved ACt metode, og normaliseret til GAPDH. Primere anvendes er anført i tabel B i S1 Filer. Barcoded cDNA-biblioteker blev derefter fremstillet ud fra totalt RNA under anvendelse af Illumina TruSeq RNAseq kit, og sekventeret (single-ende 36-bp læser) på en Illumina HiSeq instrument til en dybde på 24-63 mio læser per prøve (Stanford Center for Genomics og Personalized Medicin) (tabel C i S1 File). Sekvens læser blev kortlagt til RefSeq transkriptom og udskrifter kvantificeret som læser pr kilobase per million læser (RPKM) ved hjælp DNAnexus. Efterfølgende analyse var begrænset til tilstrækkeligt udtrykt udskrifter, defineret som RPKM ≥1 i både NKX2-1 og kontrol knockdowns. Gene Set Berigelse Analyse blev udført ved brug af desktoppens pakke [22]. Den komplette datasæt af rå RNAseq læser er tilgængelig på NCBI Sequence Læs Arkiv (Tiltrædelse SRP045118).

Q-RT-PCR

For udvalgte gener, RNAseq resultater blev efterfølgende godkendt af Q-RT -PCR. Revers transkription blev udført under anvendelse SuperScript II reagenser som pr producentens protokol (Life Technologies). qPCR blev gjort i mindst tre eksemplarer ved anvendelse TaqMan eller SYBR Green reagenser (Applied Biosystems) på en ABS Fast 7600 instrument. Relative transkriptniveauer blev beregnet ved ACt metode, og normaliseret til GAPDH. Primere anvendes er anført i tabel B i S1 File.

chromatin immunoprecipitation (chip) seq

Fem millioner celler pr immunopræcipitation (IP) eller styre input prøve blev tværbundet i 1% formaldehyd ved 25 ° C i 10 minutter, vasket i iskold PBS, lyseret i cellelyse-buffer (5 mM PIPES (pH 8), 85mm KCI, 1% Igepal, 1X Roche Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail) ved 4 ° C i 15 minutter, mekanisk homogeniseret med 25 slag af en dounce homogenisator, lyseret i nuklear lysepuffer (50 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8), 1% (vægt /volumen) SDS, 1X Roche Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail) 30 min og sonikerede med en Bioruptor XL til opnåelse 200-600bp kromatin-fragmenter. Sonikerede fragmenter blev fortyndet 10 gange i IP-buffer (20 mM Tris (pH 8), 2 mM EDTA (pH 8), 2% Triton X-100, 0,2% natriumdeoxycholat, 200 mM NaCl) og inkuberet natten over med en 1: 1 blanding af protein A /protein G beads blokeret (5 mg /ml BSA, 1X Roche Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail) og præinkuberet med 5 ug anti-NKX2-1 antistof (Santa Cruz Biotechnology, H-190). For chip-PCR-forsøg blev kanin-IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) anvendes som en negativ kontrol. Prøver blev vasket 3x i IP vaskepuffer (50 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100), en gang i TE-buffer, og elueret fra perlerne til IP Elution buffer (1% SDS, 100 mM NaHCO

3) ved 65 ° C i 1 time. Krydsbindinger blev vendt ved inkubering ved 65 ° C i 16 timer i modificeret elueringspuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO

3, 200 mM NaCl). ChIP’ed DNA blev oprenset under anvendelse af et Qiagen PCR rense kit. For første validere chip antistofspecificitet blev qPCR udført med brugerdefinerede TaqMan sonder designet til en kendt NKX2-1 bindingssted (

SFTPB

promotor) [21], i sammenligning med en negativ kontrol (et irrelevant gen,

WNT5A

), og normaliseret til GAPDH. Primere anvendes er anført i tabel B i S1 Filer. Stregkodede chip og input DNA-biblioteker blev derefter fremstillet under anvendelse af Illumina TruSeq ChIPseq kit, og derefter sekventeret (single-ende 36-bp læser) på en Illumina HiSeq instrument til en dybde på 18-60 mio læser per prøve (Stanford Center for Genomics og Personlig Medicin) (tabel C i S1 File). Sekvens læser blev kortlagt til det humane genom (NCBI36, hg18) og væsentlige bindende toppe kaldet hjælp DNAnexus. Bindende toppe blev kommenteret til nærmeste genet (inden 100kb) ved hjælp af en brugerdefineret Perl script. MEME [23] blev brugt til

de novo

motiv scanning af NKX2-1 bindende toppe (100bp centreret om de 500 bindende toppe er forbundet med gener). Berigelse af kanoniske veje blev vurderet ved Molecular signaturer Database [24] “beregne overlap” funktion. Den komplette datasæt af rå ChIPseq læser er tilgængelig på NCBI Sequence Læs Arkiv (Tiltrædelse SRP045118).

Integration af TCGA data

Forarbejdet TCGA lunge adenocarcinom [25] (n = 488) data, herunder DNA-kopi nummer (Affymetrix SNP 6,0) og transcript niveauer (RNAseq), blev tilgås fra de overordnede brandslange rørledningen. Sager med

NKX2-1

forstærkning blev defineret af

NKX2-1

tumor /normal nøgletal 1.5, og fravær af forstærkning af tumor /normal 1.1. NKX2-1 høj ekspression blev defineret som de 25 percentil af enheder. Gener differentielt udtrykt mellem

NKX2-1

amplificeret /højt udtrykt (n = 30) og ikke-amplificeret /højt udtrykt (n = 60) blev identificeret ved to klasser SAM-analyse [26], under anvendelse af en falsk opdagelse sats (FDR) 0,05

Resultater

RNAseq analyse af NKX2-1 regulerede transkriptom

for at undersøge mekanismer NKX2-1 medieret onkogenese, vi først. søgte at identificere NKX2-1 regulerede gener i

NKX2-1

forstærkede NSCLC cellelinjer. Vi har tidligere karakteriseret to NSCLC cellelinjer, HCC1195 og HCC1833, at havnen

NKX2-1

forstærkning og er afhængige af NKX2-1 (baseret på Knockdown undersøgelser) for celledeling [10]. Her vi undersøgte yderligere NSCLC linjer [19, 27], og identificeret to mere

NKX2-1

forstærket og afhængige linjer, H1819 og H661, for i alt fire cellelinier (figur 1). Tre af de fire cellelinjer stammer fra lunge adenocarcinomer (H1819, HCC1195, HCC1833), mens den fjerde (H661) er af storcellet carcinom oprindelse. Analyse af to linjer (HCC1195 og HCC1833), at den kortere af to indberettede NKX2-1 isoformer (med variant N-termini) [6] var den ene overvejende udtrykt (figur A i S2 File).

( A) En effektiv siRNA-medieret NKX2-1 knockdown i fire NSCLC cellelinier, påvist ved western blot. NTC, ikke-targeting kontrol. α-tubulin tjener som en loading kontrol. (B) NKX2-1 knockdown fører til signifikant reduceret celleproliferation, målt ved WST-1 levedygtighedsassayet. ***,

P

-værdi 0.001 (to-tailed t-test).

For at identificere NKX2-1 regulerede gener i hver af de fire cellelinjer, vi transficeret cellerne med en On-TARGETplus siRNA pulje til at vælte NKX2 -1, eller en ikke-targeting kontrol (NTC) siRNA pool. (Fordi vi tidligere havde vist, at uafhængige siRNA’er rettet NKX2-1 udstillet NKX2-1 knockdown og reduceret celledeling sammenlignes med NKX2-1 siRNA pool [10] (Figur B, Paneler A, B og C i S2 File), de fleste eksperimenter blev udført ved hjælp af siRNA pool, med efterfølgende validering af udvalgte vigtige resultater ved hjælp af uafhængige siRNA’er). Vi analyseret derefter resulterende transkriptom ændringer af RNAseq, sammenligne kontrol- og NKX2-1 knockdown celler. Transcriptomes blev analyseret 40 timer efter siRNA-transfektion til tidspunktet, hvor vi observerede knockdown af både NKX2-1 transkript og protein, samt reduceret transkript surfaktantprotein B (SFTPB), en kendt NKX2-1 reguleret target [21 ] (fig 2A)

(A) Validering af fremgangsmåde:. NKX2-1 knockdown fører til reduceret ekspression (ved Q-RT-PCR) af det kendte NKX2-1 regulerede mål, SFTPB. ***,

P

-værdi 0,001 (tosidet t-test). (B) Overlap blandt de fire NSCLC cellelinjer af gener væsentligt (≥25%) ned eller opreguleres efter NKX2-1 knockdown. (C) På tværs af de fire NSCLC cellelinjer, GSEA afslører betydelig berigelse af spredning gen sæt; repræsentative GSEA plot vist (se også tabel G i S1 File). (D) Heatmap af top nedreguleret (blå) og opreguleres (rød) gener, efter NKX2-1 knockdown i de fire NSCLC cellelinier. Bemærk de delte nedreguleret udtryk mønstre i H1819, H661 og HCC1195 (fremhævet af grønne boks). ***,

P

-værdi 0,01; ***,

P

-værdi 0,001 (Pearson korrelation

P

-værdi, korrigeret for flere test sammenligninger).

man udelukkende ser på godt målte gener (RPKM ≥1), omkring 10.000 gener blev udtrykt i hver af cellelinjer, med 9,041 gener fælles på tværs af alle fire cellelinjer (figur C, panel A i S2 Filer, og tabel D i S1 File). Antallet af gener væsentligt ændret ved NKX2-1 knockdown, defineres som mindst 25% nedsat eller forøget ekspression, varierede fra 1160 til 1615 blandt de fire cellelinjer (figur C, Panel B i S2 Filer, og tabel E i S1 fil) . På trods af dette, blev nogle gener ved dette kriterium konsekvent ændret på tværs af alle fire cellelinjer. Ved NKX2-1 knockdown, blev kun 4 gener konsekvent nedreguleret (

NBL1

,

UNC84B

,

RRBP1

, og

FA2H

), og kun 9 gener blev konsekvent opreguleret (

C7ORF60

,

CHD7

,

HIST1H2BC

,

HIST1H2BD

,

HIST1H2BE

,

ID3

,

PIK3CB

,

TP53INP1

,

ZBTB4

) (fig 2B). Disse gener har forskellige cellulære roller (tabel F i S1 fil), blandt hvilke RRBP1 funktioner i endoplasmatisk reticulum stressrespons og har vist opreguleret i lungecancer [28], og overekspression af ID3 transskriptionsrepressor er blevet rapporteret at reducere lungekræft vækst

in vivo

[29].

at udforske temaer snarere end individuelle gener, vi også gennemført en to-klasses sæt berigelse gen analyse (GSEA) [24], sammenligner transkriptniveauer (på tværs alle fire cellelinjer) efter NKX2-1 knockdown

vs

. ikke-targeting kontrol. De øverste berigede koniske veje inkluderet flere vedrørende celle-cyklus og celleproliferation (fig 2C, og tabel G i S1 File), overensstemmelse med den kendte rolle NKX2-1 i celleproliferation [10, 30]. GSEA vurdering af hver cellelinje viste individuelt også berigelse af biologi vedrørende celleproliferation (tabel H i ​​S1 File).

Selvom nogle gener mødte den strenge tærskel for ændret udtryk på tværs af alle fire cellelinjer (kun 4 konsekvent nedreguleret og 9 opreguleres gener), undersøgte vi, om flere gener kan vise en lignende tendens. Undersøgelse de 100 nedreguleres og opreguleres gener i hver cellelinje (tabel I i S1 File), en Heatmap visualisering (Fig 2D) afslørede delt ekspressionsmønstre blandt 3 af de 4 cellelinier (H1819, HCC1195 og H661), især blandt gener nedreguleret med NKX2-1 knockdown. Dette fund, underbygget af korrelationsanalyse (Fig 2D), foreslået, at disse tre cellelinjer måske bedste model

NKX2-1

forstærket NSCLC.

Med fokus på de tre cellelinjer (H1819, HCC1195 og H661) med fælles ekspressionsmønstre blev 69 gener konsekvent nedreguleret (mindst 25%) efter NKX2-1 knockdown (fig 2B, og tabel J i S1 File), hvilket indikerer, at NKX2-1 positivt regulerer deres udtryk. Selv om flere var af mulig biologisk interesse, bemærkelsesværdige blandt dem var epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) sorteret henholdsvis 8

th (af 763), 68

th (af 504), og 18

th (af 708) blandt gener nedreguleret ved NKX2-1 knockdown i de tre cellelinjer. Reduceret ekspression af EGFR, samt andre udvalgte gener (for at underbygge RNAseq resultater), blev verificeret ved Q-RT-PCR (figur C, Felt C i S2 File). To uafhængige siRNA’er rettet mod NKX2-1 hver også reducerede EGFR transkriptniveauer (ved Q-RT-PCR, Figur B, Panel D i S2 File) og protein niveauer (ved Western blot, Figur B, Panel E i S2 File), støtte EGFR reduktion for at være en on target RNA-interferens fænotype; andre kandidat NKX2-1 regulerede gener blev ikke på samme måde evalueret. Vi havde ikke tidligere lykkedes redning af NKX2-1 knockdown ved ektopisk udtryk for NKX2-1 (upubliceret), muligvis på grund af ikke-optimale NKX2-1 ekspressionsniveauerne. Derfor har vi ikke forsøge at yderligere at kontrollere on target RNA-interferens ved at redde den NKX2-1 knockdown effekt på EGFR niveauer.

ChIPseq analyse af NKX2-1 cistrome

Mens ovennævnte strategi (NKX2-1 knockdown kombineret med RNAseq) afslørede NKX2-1 regulerede gener, det gjorde ikke skelne direkte fra indirekte NKX2-1 transkriptionelle mål. Derfor parallelt gennemførte vi kromatin immunofældning (chip) -seq at definere NKX2-1 genom bindingssteder og tilhørende gener i de samme fire

NKX2-1

forstærkede /afhængige NSCLC cellelinjer. Chip-PCR af

SFTB

promotor blev gjort forud for chip-seq at validere specificiteten af ​​anti-NKX2-1 antistof til chip (figur 3A).

(A) Validering af NKX2-1 antistof til chip: chip-PCR identificerer det kendte NKX2-1 bindingssted i SFTPB promotor. Bemærk berigelsen af ​​SFTPB sammenlignet med et irrelevant gen (WNT5A). (B) Overlapning mellem de fire NSCLC cellelinjer af NKX2-1-bindingssted-associerede gener (inden 100kb). (C)

De novo

motiv analyse igen opdager det kendte NKX2-1 konsensus bindende motiv, og identificerer berigelse af andre transskription faktor bindende motiver nærheden NKX2-1 bindingssteder. (D) NKX2-1 bindende toppe identificeret ved EGFR locus i H1819 celler. De to såkaldte toppe identificeres ved blå trekanter, og støtte læser er vist i nærbillede inset. Bindende toppe ved EGFR i andre cellelinjer er vist i figur D, Panel B i S2 Filer.

I de fire cellelinjer, ChIPseq identificeret 150-1,844 NKX2-1 bindingssted-associerede gener (nærmeste gen inden 100kb) (fig 3B, og tabel K i S1 File). De fleste bindingssteder opstod inden 100kb af gener, som man ville forvente for projektledere eller forstærkere (figur D, Panel A i S2 File).

De novo

motiv analyse genvundet den kendte Nkx2 bindingssted (CACTY) [31] (fig 3C), validering af datakvalitet ChIPseq. Desuden motiv analyse af NKX2-1 bindende toppe identificeret nærheden berigelse af FOXA1 motiv i HCC1833 celler, i overensstemmelse med den rapporterede interaktion af NKX2-1 med FOXA1 [32]. Andre NKX2-1 bindingssted associeret transkriptionsfaktor motiver i HCC1833 inkluderet MYOD1, NFE2 og TCF3 (fig 3C)

Trods det store antal NKX2-1 bindingssteder, kun en lille delmængde (2 forbundne gener:. PVT1 og ZC3H7A) blev identificeret på tværs af alle fire

NKX2-1

forstærkede cellelinjer (fig 3B), spejling resultaterne af transkriptomet analyse. Notatet blev NKX2-1 bindende toppe fundet i forbindelse med

EGFR

i alle tre cellelinjer (H1819, H661 og HCC1195) under lignende transkriptionelle reaktioner på NKX2-1 knockdown (tabel K i S1-fil, fig 3D, og figur D, Panel B i S2 File). NKX2-1 bindende websted motiver kunne identificeres inden for ChIPseq bindende toppe på

EGFR

(figur D, Panel B i S2 File). Når betragtes på tværs af alle cellelinjer sammen, gener nærmeste (og inden 100kb) til NKX2-1 bindingssteder blev beriget til specifikke kanoniske veje, herunder MAPK signalering, axon vejledning, fokal vedhæftning, og celle-celle kommunikation (tabel L i S1 File) , hvilket muligvis afspejler NKX2-1 s dobbelte roller i celledeling og epitelial differentiering.

Integrativ -omic analyse identificerer EGFR som nedstrøms effektor af amplificeret

NKX2-1

for at identificere direkte transkriptionelle mål for NKX2-1, vi integreret de ovennævnte RNAseq og ChIPseq datasæt. Blandt de fire forskellige cellelinjer, 2-13% af gener, hvis udtryk ændret ≥25% ved NKX2-1 knockdown havde også i nærheden (inden 100kb) NKX2-1 bindende toppe (tabel M og N i S1 Filer, og figur E i S2 Fil). Omvendt 6-17% af gener forbundet med NKX2-1 bindingssteder udstillet væsentlige udtryk ændringer (≥25%) efter NKX2-1 knockdown. For yderligere at skære ned på listen over interessante kandidater, og for at sikre relevans for primære NSCLC prøver, vi tværs sammenlignet vores liste over gener til transkriptom data fra 488 primære lunge adenokarcinomer fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) [25]. Især identificerede vi den delmængde af NKX2-1 opreguleres formodede direkte mål, hvis ekspression var betydeligt højere (med to-klasse SAM analyse) i TCGA lunge-adenokarcinomer med

NKX2-1

amplifikation /overekspression (n = 20) sammenlignet med adenocarcinomer uden amplifikation (men stadig udtrykker NKX2-1 i en ikke-amplificeret kontekst) (n = 60) (tabel 1). Bemærkelsesværdige blandt de resterende kandidater var EGFR, som i sammendrag blev nedreguleret med NKX2-1 knockdown i 3 af 4 cellelinjer, var forbundet med en kaldet chip højdepunkt i de samme tre cellelinjer, og var signifikant overudtrykt (FDR = 0,054) i den primære NSCLCs med

NKX2-1

amplifikation /overekspression. Udpræget, vores efterfølgende opfølgende eksperimenter med fokus på EGFR.

EGFR

er moderat forstærkes i H1819 celler, og er vildtype (dvs. ingen aktiverende mutationer) i alle fire linjer [33 -36]. EGFR proteinekspression varierer, men var højest i H1819 (figur F, panel A i S2 File). I overensstemmelse med RNAseq resultater i alle tre cellelinier (H1819, HCC1195 og H661), hvor NKX2-1 knockdown førte til reduceret EGFR udskrift, NKX2-1 knockdown også ført til en reduktion 40-90% af EGFR protein, vurderet ved Western blot (fig 4A). I overensstemmelse med EGFR muligvis fungere som en downstream effektor af NKX2-1, banke ned af EGFR (ved hjælp 200 nM siRNA [37]) førte til en sammenlignelig reduktion i celleproliferation, målt ved WST-1 assay (Fig 4B). Uventet knockdown af EGFR ført til øget protein niveauer af NKX2-1 (Fig 4C), hvilket tyder på negativ feedback regulering. To uafhængige siRNA’er rettet mod EGFR (figur B, Paneler F og G i S2 File) hver også steget NKX2-1 protein niveauer (ved Western blot, Figur B, Panel H i ​​S2 File), der understøtter en on-target RNA-interferens fænotype. Interessant, har EGFR knockdown ikke ændre NKX2-1 transkriptniveauer (figur B, Panel I i S2 File), hvilket tyder på, at den øgede NKX2-1 protein niveauer observerede var sandsynligvis en følge af post-transkriptionel regulering.

( A) NKX2-1 knockdown fører til reducerede EGFR proteinniveauer kvantificeret ved western blot (% resterende angivet). Niveauer normaliseret til a-tubulin lastning kontrol. (B) EGFR knockdown af siRNA reducerer celleproliferation sammenlignelig med NKX2-1 knockdown (se fig 1A). **,

P

-værdi 0.01 (tosidet t-test). (C) EGFR knockdown fører til forhøjede NKX2-1 protein niveauer (% stigning angivet; niveauer normaliseret til a-tubulin lastning kontrol), hvilket tyder på negativ feedback regulering

I overensstemmelse med en negativ feedback loop, knock. ned af NKX2-1 sammen med EGFR reduceret H1819 celleproliferation betydeligt mere end knockdown af enten alene (figur 5A). (Den kombinerede knockdown kunne ikke testes i HCC1195 og H661 celler, fordi den højere koncentration siRNA kræves for at knockdown EGFR var toksisk for de celler.) Desuden kombineret NKX2-1 og EGFR knockdown reduceret MAP-kinase (p-MAPK-niveauer) og PI3-kinase signalering (p-AKT niveauer) -known vækst /overlevelse signalveje nedstrøms for EGFR [38] -mere end knockdown af enten alene (fig 5B).

(A) Kombineret knockdown af NKX2-1 og EGFR reducerer H1819 celleproliferation mere end enten alene. **,

P

-værdi 0,01; ***,

P

-værdi 0,001 (tosidet t-test). (B) Kombineret knockdown af NKX2-1 og EGFR i H1819 celler mindsker MAPK signalering (p-MAPK) og PI3K signalering (p-AKT) mere end enten alene. Procent resterende angivet; niveauer normaliseret til a-tubulin lastning kontrol. Bemærk, i særdeleshed vestlige vist, EGFR knockdown synes ikke at øge NKX2-1 niveauer betydeligt, selv om stigningen er blevet reproducerbart observeret i flere andre forsøg (fx fig 4C, og Figur B, Panel H i ​​S2 File). (C) NKX2-1 knockdown samarbejder med EGFR inhibitor erlotinib til at hæmme H1819 cellevækst ***,

P

-værdi ≤ 0,001 (tosidet t-test).

de ovenstående resultater antydede, at NKX2-1 knockdown kan samarbejde med lille molekyle inhibering af EGFR-kinase. For at teste dette, har vi udfordret H1819-celler med NKX2-1 knockdown (eller ikke-targeting kontrol) til en vækstinhiberende koncentration ~ 50% (1,0 uM, figur F, felt B i S2 File) af EGFR-inhibitor erlotinib. Især NKX2-1 knockdown væsentligt forbedret den væksthæmmende effekt af erlotinib (Fig 5C) på

NKX2-1

forstærkede NSCLC celler.

Diskussion

NKX2-1 er en transskription faktor, så dens onkogene virkninger, når forstærkes formodes at være medieret gennem transkriptionel regulering af vigtige downstream mål. For at identificere disse mål, her udført vi en kombineret transkriptom (NKX2-1 knockdown efterfulgt af RNAseq) og cistrome (NKX2-1 bundne gener ved ChIPseq) analyse i fire NSCLC cellelinjer udstiller

NKX2-1

forstærkning og vækst -dependency. Resultaterne blev yderligere integreret med TCGA genom og transkriptom data fra primær NSCLC sager, hvorfra vi identificeret og yderligere studeret EGFR som en downstream mål.

En uventet fund fra Knockdown /RNAseq eksperimenter var den relativt lille overlap af væsentligt op /nedreguleret gener tværs cellelinierne. Dette afspejler sandsynligvis heterogenitet blandt forskellige patients tumorer, hvor distinkte celletyper oprindelsesbetegnelser, differentiering mønstre, og /eller tumor (epi) genetiske ændringer kan påvirke landskabet af gener reguleret af NKX2-1. Trods dette, 3 af de 4 cellelinjer delt meningsfulde genekspressionsmønstre, udviste berigelse for udvalgte processer (f.eks celleproliferation), og udpeget specifikke gener (EGFR).

Den kombinerede analyse af NKX2-1 bindingssteder yderligere identificeret den delmængde af sandsynlige direkte NKX2-1 transkriptionelle mål (selvom vi konstatere, at de indirekte transkriptionelle mål også kan have vigtige biologiske funktioner).