PLoS ONE: Effekter af Flavonoider fra Potamogeton crispus L. om spredning, migration og invasion for Human kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

For at udforske den effektive udnyttelse af plantegenetiske ressourcer fra konstruerede vådområder, den potentielle anti -metastatic effekter af flavonoider fra

Potamogeton crispus

L. blev undersøgt i humane ovariecancerceller (ES-2). To større flavonoider, luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid og flavon-6-C-β-D-glucopyranosid, blev isoleret fra

P

.

crispus

og identificeret. Virkningerne af disse flavonoider på celleproliferation, cellemorfologi, cellecyklus, apoptose og cellemigration og invasion blev derefter undersøgt. Endvidere revers transkriptase polymerasekædereaktion assays og western blotting-analyse blev udført for at undersøge ekspressionsniveauet af mRNA og protein. Resultater viste, at Luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid inhiberede ES-2 cellemigration og invasion og undertrykt ekspression af to matrix-metalloproteinaser (MMP’er), MMP-2 og MMP-9, og flavoner-6-C-β -D-glucopyranosid havde ingen signifikante inhibitoriske virkninger på ES-2-celler. Således er denne undersøgelse viste de potentielle anti-metastatiske egenskaber af en

P

.

crispus

flavonoid, og forudsat en videnskabelig tilgang til screening af lovende naturressourcer fra konstruerede vådområder at identificere nyttige produkter til brug i den farmaceutiske og sundhedsindustrien

Henvisning:. Du Y, Feng J Wang R, Zhang H, Liu J (2015) effekter af Flavonoider fra

Potamogeton crispus

L. om spredning, migration og invasion for human Ovarian Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130685. doi: 10,1371 /journal.pone.0130685

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republik

Modtaget: Februar 3, 2015; Accepteret: 24 maj 2015; Udgivet: 22 juni 2015

Copyright: © 2015 Du et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 31.200.426), National Water Special Project (nr 2012ZX07203-004), Science and Teknologi Planlægning Projekt i Shandong-provinsen (nr 2011GGH21605), og Natural Science Foundation i Shandong-provinsen i Kina (No.ZR2014YL001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Planter spiller en central rolle i opbygningen af ​​manipuleret vådområder miljøer og de bør forvaltes strengt at fastholde vådområde effektivitet og samtidig minimere risikoen for sekundær forurening og negative økologiske effekter på økosystemet. Effektiv udnyttelse af høj biomasse vådområde vegetabilske ressourcer er vigtig, fordi det tilskynder høst og bæredygtig forvaltning af konstruerede vådområder.

Potamogeton crispus

L. er en af ​​de vigtigste planter anvendes i konstruerede vådområder økosystemer [1]. Tidligere rapporter har identificeret karotenoider, fedtsyrer, lignan, labdane diterpenoider, flavonoider, og phytosterins i

P

.

crispus

[2-5], og carotenoid ekstrakter fra

P

.

crispus

blev rapporteret at inducere apoptose i HeLa-celler

in vitro

[6]. Vores foreløbige undersøgelse viste anti-tumor aktiviteter af

P

.

crispus

ekstrakt i human og æggestokkene kræft cellelinjer [7], og kemiske analyser foreslået flavonoider at være de vigtigste bestanddele af denne ekstrakt.

Det er velkendt, at flavonoider har et stort udvalg af biokemiske aktiviteter, og de spiller en vigtig rolle i den menneskelige sundhedsindustrien [8-9]. Epidemiologiske og kliniske data indikerer, at kosten flavonoider gøre afgørende bidrag til forebyggelse og /eller forvaltning af kroniske sygdomme som kræft, diabetes, hjerte-kar-sygdomme og human immundefekt virus-infektion, [10-14]. Nyere forskning på flavonoid ejendomme har været fokuseret på deres cytotoksiske antitumoraktiviteter, og eksperimentelle undersøgelser har vist, at flavonoider undertrykke migration og invasion, påvirker cellecyklusprogression, og inducere apoptose i flere tumorcellelinier [15-16].

Kræft metastaser er den førende årsag til dødelighed hos patienter med maligne tumorer, og skønnes at være ansvarlig for 90% af humane kræftrelaterede dødsfald [17]; således fortsat det en vigtig udfordring for kræftbehandling. Nedbrydning af den ekstracellulære matrix (ECM) er et afgørende element af metastatiske tumorer, og denne proces er forbundet med overekspression af matrixmetalloproteinaser (MMP’er) [18-19]. Det er blevet rapporteret, at luteolin og baicalein flavonoider hæmmer metastase ved at undertrykke ekspression og sekretion af MMP2 og MMP9 i humane brystcancerceller (MCF-7 og MDA-MB-231) og i hepatocellulære carcinomceller (MHCC97H) [20-22] . Men det er uklart, om flavonoider har anti-metastatiske virkninger på æggestokkene cancerceller.

I den foreliggende undersøgelse, vi renset to flavonoider fra

P

.

crispus

og undersøgte deres indvirkning på den menneskelige kræft i æggestokkene ES-2-cellelinje. Spredningen, morfologi, cellecyklusprogression, apoptose, migration og invasion af disse celler blev undersøgt med det formål at belyse effekten af ​​

P

.

crispus

flavonoider på ES-2-celler og de mekanismer involveret.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Feltet undersøgelse og prøvetagning er involveret i dette undersøgelsen blev gennemført med den officielle tilladelse fra Environmental Protection Bureau of Weishan County og Forvaltningskomitéen for Xinxue River konstrueret vådområde. Feltarbejdet indebar ikke truede eller beskyttede plantearter eller enhver dyrearter. Laboratoriet Protokollen blev godkendt af Shandong University etiske komité.

Udarbejdelse af plantemateriale

P

.

crispus

materiale blev indsamlet i Xinxue floden konstrueret vådområde (117,16 ° Ø 34,78 ° N), på Nansi Sø, Weishan County, Kina. Samlingen blev gennemført i begyndelsen af ​​juli, når

P

.

crispus

havde den maksimale biomasse. Hele planten blev tørret, pulveriseret og ekstraheret med ethanol under opvarmning tilbagesvaling tre gange, i 90 min per ekstraktion. Ethanolekstraktet blev derefter suspenderet i vand før opdeling med petroleumsether (PE), ethylacetat (EtOAc), og n-butanol sekventielt; disse blev koncentreret under vakuum til opnåelse af en PE-ekstrakt, en EtOAc-ekstrakt, og en n-butanol-ekstrakt. Baseret på vores tidligere undersøgelser [7], blev EtOAc-ekstrakten udvalgt til yderligere separation. EtOAc-ekstrakt blev kromatograferet på en MCI gel søjle, efterfulgt af Sephadex LH-20 søjlekromatografi, de to vigtigste forbindelser blev derefter fremstillet ved anvendelse af højtydende væskekromatografi (HPLC) (Agilent 6270, USA). De to forbindelser blev identificeret ved HPLC, kernemagnetisk resonans (NMR) (AVANCE 600, Bruker, Tyskland), og høj opløsning elektrospray ionisering massespektrometri (HR-ESI-MS) (LTQ Orbitrap XL, ThermoFisher, USA).

Cell kultur og behandling

ES-2 human æggestokkræft cellelinje blev opnået fra Shandong Analyse og Test center i august 2014. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (HyClone, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, USA) og antibiotika (100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) (HyClone). Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Forbindelser blev opløst i en koncentration på 0,1 M i 100% dimethylsulfoxid (DMSO) (Solarbio, Kina) til dannelse stamopløsninger, opbevaret ved -20 ° C, og fortyndet til de angivne koncentrationer med mediet før hvert forsøg. Den endelige DMSO-koncentration oversteg ikke 0,1% gennem hele undersøgelsen, og alle kontrolgrupperne blev udsat for 0,1% DMSO.

Celleproliferationsassay

flavonoid effekter på celleproliferation blev vurderet ved hjælp af MTT (thiazolyl blå tetrazoliumbromid) (Solarbio) assay. ES-2-celler blev podet (1 × 10

4 per brønd) på en plade med 96 brønde i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS. Efter inkubation natten over ved 37 ° C i 5% CO

2, forskellige koncentrationer (15-240 pg /ml) af forbindelserne blev tilsat til tredobbelte brønde. Efter inkubation i 48 timer blev MTT tilsat til hver brønd for at opnå en slutkoncentration på 0,5 mg /ml, og inkubation blev udført i yderligere 4 timer. Mediet blev derefter erstattet med den stopopløsning (DMSO; 150 pi per brønd) og absorbansen ved 490 nm blev målt på en pladelæser (Enspire, Perkin Elmer Corporation, USA). DMSO kontrol 0,1% blev målt parallelt. Cytotoksicitet blev udtrykt som den hæmning sats, der blev beregnet som følger: hvor A

kontrol = absorbansen af ​​kontrol brønde; A

prøve = absorbansen af ​​behandlede brønde; A

0 = absorbansen af ​​tomme brønde. Origin 7.5 software blev anvendt til at analysere data og beregne IC

50 værdier. Assays blev gentaget mindst tre gange.

Observation af cellemorfologi

ES-2 celler blev dyrket som beskrevet for celleproliferationsassay. Cellerne blev behandlet med 30 eller 60 ug /mL luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid (LU3’O-GP) eller 100 ug /mL flavon-6-C-β-D-glucopyranosid (FL6C-GP ). Cellemorfologi observationer blev udført efter inkubation i 48 timer ved anvendelse af et inverteret fluorescensmikroskop (Ti-S, Nikon, Japan).

cellecyklusprogression assay

ES-2-celler (5 x 10

4 per brønd) blev podet på en plade med 6 brønde og inkuberet natten over ved 37 ° C i 5% CO

2 før tilsætning af de angivne forbindelser fremstillet i komplette medier i 48 timer. Cellerne blev derefter opsamlet ved trypsinering, vaskes i phosphatpufret saltvand (PBS) og fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C i 2 timer. Cellerne blev vasket to gange med PBS og centrifugeret ved 2000 rpm i 5 minutter; supernatanten blev kasseret. Cellerne blev resuspenderet i 100 pi PBS indeholdende RNAse (50 ug /ml) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter; reaktionen blev derefter stoppet ved at placere på is i 2 min. ES-2-celler blev farvet ved inkubation med 10 ug /ml propidiumiodid (PI) med 0,1% Triton X-100 i mørke ved 4 ° C i 30 minutter. Prøverne blev analyseret ved flowcytometri (FACSAria, BD, USA), og resultaterne blev analyseret ved FlowJo 7.6.1.

Cell apoptose assay

annexin-V-PE /7-AAD apoptose afsløring kit (BD Pharmingen, USA) blev anvendt til at undersøge virkningerne af testforbindelserne på apoptose i ES-2-celler. Annexin V er et protein, der har en høj affinitet for phosphatidylserin (PS). Under apoptose, PS translokerer fra den indvendige flade af plasmamembranen til celleoverfladen, hvor det kan detekteres ved anvendelse af et fluorescerende annexin V konjugat. ES-2 celler blev dyrket og podes som beskrevet ovenfor for cellecyklusprogression assay. Efter inkubation med

P

.

crispus

flavonoider i 48 timer, blev cellerne opsamlet ved trypsinering, vaskes to gange med PBS, og resuspenderes i 400 pi bindingspuffer inden tilsætningen af ​​5 pi annexin V-PE, inkubation i mørke ved 4 ° C i 15 minutter, og farvning med 10 pi 7-AAD opløsning. Prøverne blev analyseret ved flowcytometri (FACSAria, BD) efter inkubering i mørke ved 4 ° C i 15 minutter, og resultaterne blev analyseret ved FlowJo 7.6.1 software. Apoptotisk og nekrotiske celler blev identificeret ved annexin V positiv /7-AAD negativ farvning og annexin V positiv /7-AAD positive farvning, henholdsvis.

cellemigrationsassay

cellemigration blev udført under anvendelse Transwell kamre (Corning Costar, USA) Transwell kammer blev fyldt med medium og 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (Gibco, Life Technologies) blev inkluderet i serum-frit medium i det øvre kammer, for at opretholde det osmotiske tryk. ES-2 celler blev udsat for de angivne flavonoid koncentrationer i et serum-frit medium i 48 timer før tilsætning af cellerne (2 × 10

5) til øverste Transwell kammer. Bundkammeret indeholdt medium med 5% FBS at tjene som en kemo-tiltrækningsstof. Kamrene blev inkuberet i 24 timer og ikke-migrering celler på den øvre side af Transwell membran blev fjernet under anvendelse af vatpinde. Membranen blev fikseret i 100% methanol; de migrerede celler blev derefter farvet med 0,1% krystalviolet i 10 minutter, og vasket tre gange med PBS. Membranen blev fotograferet under et mikroskop, inden de blev vasket med 33% eddikesyre; absorbansen af ​​eluenten blev målt ved 590 nm i en pladelæser (Enspire, Perkin Elmer Corporation).

Cell invasion assay

Cell invasion blev analyseret under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor for cellemigrering assay, bortset fra at Transwell kammer blev coatet med Matrigel (BD Pharmingen), og mediet var fri for BSA.

Isolering af totalt RNA og revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR) assay

ES-2-celler blev podet i en 6-brønds plade (4 × 10

5 celler per brønd) og inkuberet natten over før behandling med forskellige koncentrationer af LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /ml ) i 48 timer. Cellerne blev opsamlet ved trypsinering og vasket i PBS. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Life Technologies) og 5 mg blev anvendt til at syntetisere cDNA med M-MLV (Invitrogen, Life Technologies). CDNA’et blev amplificeret under anvendelse af følgende primersekvenser (BGI, Kina): Salg

MMP2, fremad, 5′-GTTCATTTGGCGGACTGT-3 ‘, reverse, 5′-AGGGTGCTGGCTGAGTAG-3’;

MMP9 , fremad, 5′-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3 ‘, reverse, 5′-CCAAACTGGATGACGATGTC-3’;

glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), fremad, 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ‘, reverse, 5’ -CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3 ‘

PCR blev udført under anvendelse af følgende program:. 95 ° C i 5 minutter; derefter 45 cykler ved 95 ° C i 10 s; 55 ° C i 15 s; og 72 ° C i 10 s. Prøverne blev derefter opvarmet (72 ° C i 10 min) og afkølet til 4 ° C. GAPDH blev anvendt som RNA loading kontrol. PCR-produkterne blev separeret på 1% agarosegeler og påvist ved ethidiumbromidfarvning. Resultaterne blev analyseret ved BandScan5.0.

Western blotting-analyse

ES-2-celler blev podet i en 6-brønds plade (4 × 10

5 celler pr brønd) og inkuberet natten over før behandling med forskellige koncentrationer af LU3’O-GP (0, 30, 60, 90 ug /ml) i 48 timer. Celler blev suspenderet i 500 pi lysisbuffer ved 4 ° C (40 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 150 mM KCI, 100 mM NaVO3, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, pH 7,5). Proteinerne blev separeret ved 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og overført til PVDF-membraner. Membranerne blev derefter blokeret ved hjælp skummetmælk i 5% Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBST) ved 37 ° C i 1 time og inkuberet natten over med primære antistoffer (MMP-2-antistof: Santa Cruz Biotechnology, USA; MMP-9 antistof: RabMab, Abcam, UK) i TBST indeholdende 5% skummetmælk ved 4 ° C. Membranerne blev derefter inkuberet med et sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Båndene blev detekteret ved forøget kemiluminescens og fotograferet; resultaterne blev analyseret af Image J software.

Statistisk analyse

I hvert assay blev udført tredobbelte forsøg, og resultaterne er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Betydningen af ​​gruppeforskelle blev undersøgt ved hjælp af Student to-halet t-test (Microsoft Excel software).

Resultater

Identifikation af to main

P

.

crispus

flavonoider

HPLC, NMR, og HR-ESI-MS blev udført for at isolere og identificere de to vigtigste forbindelser inden for

P

.

crispus

EtOAc ekstrakt. Disse forbindelser blev identificeret og karakteriseret som Luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid (LU3’O-GP) og flavon-6-C-β-D-glucopyranosid (FL6C-GP) ved at sammenligne deres spektrale data (HPLC , HR-ESI-MS,

1 H og

13C NMR) og fysisk-kemiske egenskaber med dem rapporteret i litteraturen [23-25]. Dette er den første rapport af udvinding af disse to flavonoider fra

P

.

crispus

. Den molekylære struktur af to forbindelser blev vist på figur 1, og renheden af ​​begge forbindelserne var over 90% (fig a og b i S1 File).

LU3’O-GP inhiberede ES- 2-celleproliferation

ES-2 ovariecancerceller blev inkuberet i 48 timer med fem forskellige koncentrationer af LU3’O-GP eller FL6C-GP. MTT-assayet resultater indikerede en koncentrationsafhængig formindskelse i cellelevedygtighed i nærvær af LU3’O-GP (figur 2). Cellernes levedygtighed faldt med 63,8% og 73,6% efter 48 timers udsættelse for 120 og 240 ug /mL LU3’O-GP henholdsvis og IC

50 værdien var 57,1 pg /ml. De samme koncentrationer af FL6C-GP havde en signifikant lavere indvirkning på celle levedygtighed og dette stof havde en IC

50 værdi på 182,7 mikrogram /ml. Disse resultater indikerede, at LU3’O-GP inhiberede proliferationen af ​​ES-2 celler på en koncentrationsafhængig måde Salg

Celler blev inkuberet med fem forskellige flavonoid koncentrationer eller dimethylsulfoxid. (DMSO; kontrol) i 48 timer. Dataene repræsenterer midlerne til tredobbeltforsøg ± standardafvigelse (SD) *

s

0.01.

LU3’O-GP påvirkede ES-2 morfologi

Morfologiske undersøgelser blev udført for yderligere at undersøge virkningen af ​​LU3’O-GP på ES-2 celler. ES-2 celler blev behandlet med koncentrationer af LU3’O-GP er forbundet med lav cytotoksicitet (30 og 60 ug /ml) eller 100 ug /mL FL6C-GP. Billeder opnået ved inverteret mikroskopi efter 48-h inkubationer er vist i figur 3. Den kontrol og FL6C-GP sammenligning celler viste den klassiske spindel celle mønster observeret i ovarietumorceller. De celler behandlet med LU3’O-GP viste et betydeligt tab af mobilitet og ændringer i cellemorfologi; den store morfologisk ændring var til cytomere form, som blev sfærisk med en forkortet tentakel. Disse ændringer er sket i en koncentrationsafhængig måde. Den FL6C-GP behandling gav ingen signifikant ændring i forhold til kontrol celler. Disse resultater indikerede, at LU3’O-GP kunne ændre den cellulære morfologi af ES-2-celler og foreslog dens potentielle indflydelse på celle mobilitet.

ES-2-celler blev behandlet med den angivne

P

.

crispus

flavonoider i 48 timer, og filmede med et omvendt fluorescerende mikroskop.

LU3’O-GP induceret cellecyklusstop i ES-2-celler

Til afgøre, om

P

.

crispus

flavonoider påvirket cellecyklussen, ES-2 celler behandlet med enten LU3’O-GP eller 100 ug /ml FL6C-GP til sammenligning inden analyse ved flowcytometri. Resultaterne (Fig 4) indikerede, at LU3’O-GP-behandling forårsagede koncentrationsafhængige stigninger i antallet af celler i G0 /G1-fasen, og fald i antallet af celler i S-fase, mens FL6C-GP behandling havde nogen signifikante virkninger på cellecyklusprogression i ES-2 celler. Disse resultater viste, at LU3’O-GP påvirket ES-2 cellecyklusprogression ved at forårsage standsning af cellecyklus ved fasegrænsen af ​​G1-fasen og S-fasen

(a) Negativ kontrol.; (B) celler behandlet med 100 ug /ml flavon-6-C-β-D-glucopyranosid (FL6C-GP); (C) celler behandlet med 30 ug /ml luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid (LU3’O-GP); og (d) celler behandlet med 60 ug /ml LU3’O-GP. Celler blev fikseret med ethanol og farvet med propidiumiodid før cellecyklusfordeling analyse ved flowcytometri. Antallet af celler i G0 /G1-fasen er repræsenteret ved den første top, og dem i G2 /M-fase er repræsenteret ved den anden top. Celler i S-fase er til stede i området mellem G0 /G1 og G2 /M toppe. Disse data repræsenterer middelværdien af ​​tredobbelte eksperimenter. *

s

0,01 sammenlignet med kontrol

P

..

crispus

flavonoider havde ingen virkning på apoptose i ES-2 celler

Apoptose er en aktiv og fysiologisk tilstand af celledød, der er almindeligt restaureret af anticancermidler. Flowcytometri blev anvendt til at bestemme, om LU3’O-GP påvirket ES-2 apoptose. Som afbildet i figur 5, cellepopulationen i Q3 zone repræsenterede de apoptotiske celler, som var annexin V positive og 7-AAD negativ. Denne population viste ingen tydelig ændring i overværelse af LU3’O-GP eller FL6C-GP, tyder på, at

P

.

crispus

flavonoider havde ingen effekt på apoptose i ES-2 celler

(a) Negativ kontrol.; (B) celler behandlet med 100 ug /ml flavon-6-C-β-D-glucopyranosid (FL6C-GP); (C) celler behandlet med 30 ug /ml luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid (LU3’O-GP); (D) celler behandlet med 60 ug /ml LU3’O-GP. Apoptotiske celler er vist i 3. kvartal.

LU3’O-GP hæmmede migration og invasion af ES-2 celler

Cell motilitet anses for at være en vigtig faktor for den metastatiske potentiale cancerceller. Virkningen af ​​LU3’O-GP på motiliteten af ​​ES-2 cancerceller blev undersøgt under anvendelse af et cellemigrationsassay. Som vist i figur 6 blev migreringen af ​​ES-2 celler faldt betydeligt i en koncentrationsafhængig måde efter udsættelse for LU3’O-GP. Denne inhibering var omkring 67,7% og 88,1%, sammenlignet med kontrolceller, i nærvær af 30 og 60 pg /mL LU3’O-GP hhv. Cellerne behandlet med FL6C-GP viste ingen signifikant ændring i migration aktivitet sammenlignet med kontrolceller. Salg

Celler blev udsat for de angivne koncentrationer af luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid (LU3 ‘ O-GP) og flavon-6-C-β-d-glucopyranosid (FL6C-GP), og migrationen blev kvantificeret under anvendelse af et Transwell kammer. Værdierne repræsenterer middelværdier af tredobbelte eksperimenter. *

s

0,01, sammenlignet med kontrollen; #

s

0,05, sammenlignet med den angivne koncentration.

Under tumormetastase, skal cellerne passere gennem ECM. At vurdere, om LU3’O-GP påvirket ES-2 celleinvasion blev celleinvasion assays udføres i et Transwell kammer coatet med Matrigel. Behandling af ES-2 celler med stigende koncentrationer af LU3’O-GP førte til en betydelig koncentrationsafhængig formindskelse af celleinvasion sats, sammenlignet med kontrolgruppen (figur 7). Denne proces blev inhiberet med omkring 73,7% og 89,9% i nærvær af 30 og 60 pg /mL LU3’O-GP, hvorimod inhiberingen induceret af 100 ug /ml FL6C-GP var kun 6,7%. Resultaterne af dette assay viste, at LU3’O-GP dramatisk inhiberede invasionen af ​​ES-2-celler. Salg

Celler blev behandlet med luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid (LU3’O-GP ) eller flavon-6-C-β-d-glucopyranosid (FL6C-GP), og deres invasion blev kvantificeret i en Transwell kammer membran med Matrigel. Værdier repræsenterer middel til eksperimenter udført i triplikat. *

s

0,01, sammenlignet med kontrollen; #

s

0,05 i forhold til den angivne koncentration.

For yderligere at bestemme indflydelsen af ​​LU3’O-GP på opstrøms faktorer, der er vigtige for reguleringen af ​​tumor celle invasion, mRNA og protein udtryk for MMP2 og MMP9 blev undersøgt. RT-PCR-assay er vist i Fig 8. Niveauerne af MMP2 og MMP9 mRNA’er blev reduceret i en koncentrationsafhængig måde ved behandling med LU3’O-GP, Western blotting-analyse (figur 9) viste en lignende undertrykkelse af MMP- 2 (pro-MMP2 og aktivitet MMP-2) og MMP-9-protein ekspression ved LU3’O-GP. Disse resultater tydede på, at flavonoid, LU3’O-GP, undertrykt udtryk for MMP2 og MMP9 på både mRNA og protein niveauer

(a) LU3’O-GP virkninger på MMP-2-ekspression.; (B) LU3’O-GP virkninger på MMP-9-ekspression. mRNA-niveauer blev undersøgt ved revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR) under anvendelse af glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase som lastning kontrol. RT-PCR-produkter blev påvist ved ethidiumbromidfarvning. Værdierne repræsenterer middelværdier af tredobbelte eksperimenter. *

s

0,05, sammenlignet med kontrollen

(a) LU3’O-GP virkninger på MMP-2 (pro-MMP-2 og aktivitet MMP-2).; (B) LU3’O-GP virkninger på MMP-9-ekspression. Proteinniveauer blev undersøgt ved western boltting analyse. Værdierne repræsenterer middelværdier af tredobbelte eksperimenter. *

s

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen.

Diskussion

I denne undersøgelse to store flavonoider, LU3’O-GP og FL6C-GP, blev isoleret og identificeret fra

P

.

crispus

med det formål at udforske de potentielle anti-metastatiske virkninger af denne konstrueret vådområde plante ressource. Metastase er den hyppigste dødsårsag hos cancerpatienter og udvikling af nye behandlingsmetoder, der hæmmer udbredelsen tumor er afgørende for vellykket cancerterapi og forebyggelse. Men mest cytotoksiske syntetiske anticancerlægemidler besidder en lav specificitet; dette frembringer virkninger på normale væv, udover tumorceller, hvilket fører til dårlige kliniske resultater. har derfor fået betydelig vægt på identifikation af nye anticancer-midler fra naturlige kilder, og spiselige ressourcer er særligt værdifulde på grund af deres høje sikkerhedsmargin; mange naturlige kosten agenter er i øjeblikket i den tidlige fase kliniske forsøg [26]. Flavonoider giver en af ​​de mest fremragende naturressourcer i denne sammenhæng. Kosten flavonoider næsten alle eksisterer som glycosider i naturen og de mest rigelige plante flavonoid glycosider er flavon O /C-glycosider og flavonol O-glycosider [27].

LU3’O-GP er en flavon O-glycosid og FL6C-GP er en flavon C-glycosid. Men den nuværende undersøgelse indikerede, at LU3’O-GP produceret betydelig indvirkning på ES-2 spredning, morfologi, cellecyklusprogression, migration og invasion, mens FL6C-GP havde ingen synlige effekter på disse celler. Vi antager, at denne forskel var relateret til to forskelle mellem disse forbindelser. For det første kan flavonoidaglyconer viser forskellige bioaktiviteter. Luteolin, aglyconerne af LU3’O-GP, og nogle luteolin C-glycosider har vist sig at inhibere tumorcelleoverlevelse og metastase i forskellige humane epithelioide cancerceller, herunder MCF-7, MDA-MB231, og LNM35 celler [21, 28- 29]. For det andet, de flavonoid glycosider er for vandopløselige til at diffundere over cellemembranen, mens aglyconer er mere hydrofobe og kan nemt indtaste celler ved passiv diffusion; deglycosylering af flavonoid glycosider til deres aglyconer anses derfor for at være den første fase af stofskiftet, der producerer effekter

in vivo

[30]. Derfor kunne forskellige sukkergrupper bundet til flavonoidaglyconer påvirke deres deglycosylering og metabolisme til en vis grad og medføre forskelle i bioaktivitet [31]. I den foreliggende undersøgelse havde LU3’O-GP ikke inducere apoptose i ES-2-celler, selvom luteolin tidligere blev rapporteret at inducere apoptose i nogle humane cancerceller og i muse-neuroblastomceller [32-33]. Således kan vores resultater også bevis for flavonoid glycosylering-relaterede variation i aktivitet.

Det er dog muligt, at virkningerne af glycosylering på flavonoid bioaktivitet

i vi tro

o kan afvige fra dem, der observeres

in vivo

. Flavonoid glycosider er blevet rapporteret til at vise tilsvarende eller endnu større anti-diabetisk, anti-inflammatorisk, anti-degranulating, anti-stress, og anti-allergi aktiviteter end deres flavonoidaglyconer

in vivo

[31]. Samlet set er det meget vanskeligt at drage generelle konklusioner om virkningen af ​​glycosyleringen på flavonoid bioaktiviteter og yderligere forskning er nødvendig for at forstå forholdet mellem flavonoid glykosylering og bioaktivitet

in vivo

in vitro

.

MMP-2 og MMP-9 er afgørende enzymer, der anses for at være vigtige bidragydere til de processer af invasive metastase og angiogenese i forskellige tumorer [34-37]. MMP-9 og MMP-2 ekspressionsniveauer er signifikant forhøjet i en række carcinomer [36, 38]. Derfor bør inhibering af MMP-2 og MMP-9-ekspression være en høj prioritet under cancerterapi. I den foreliggende undersøgelse blev ES-2-celler behandlet med LU3’O-GP ved koncentrationer, der er forbundet med lav cytotoksicitet for at vurdere anti-metastatisk aktivitet af denne forbindelse, og en apoptose-assay blev også udført. Disse resultater viste, at LU3’O-GP signifikant inhiberede ES-2 cellemigration og invasion og virkningen er nært beslægtet med en undertrykt ekspression af MMP-2 og MMP-9 i mRNA og proteinniveauet i fravær af cytotoksisk eller apoptotiske virkninger. Derudover eftersom metastatisk spredning af tumorceller er en multi-trins proces, der involverer en række komplekse fysiologiske begivenheder, MMP-2 og MMP-9-ekspression reguleres af en kompliceret netværk af signalveje, der kan aktiveres ved en række vækst faktorer, cytokiner og kemikalier såsom PI3K /Akt, p38-MAPK, NF-KB, EGFR, ERK1 /2, og TPA, der handler via en række veje, såsom MAPK /ERK-vejen [39-45]. Dette indikerer, at mekanismerne bag metastase kan være specifikke for forskellige typer af tumorcelle. Den klare LU3’O-GP-induceret hæmning af ES-2 metastaser bør derfor undersøges i andre typer af tumorceller.

P

.

crispus

er en udbredte arter i konstruerede vådområder, og det skal høstes på et passende tidspunkt til at opretholde en effektiv fjernelse af forurenende stoffer og for at undgå sekundær forurening og negative økologiske virkninger. Den store mængde af

P

.

crispus

biomasse kan gøre procedurerne efter høst udfordrende. Naturlige produkter og naturmedicin er lovende kilder til nye terapeutiske midler til den menneskelige sundhedssektoren [46]. I denne undersøgelse blev flavonoider med anti-metastatisk aktivitet isoleret fra

P

.

crispus

, hvilket indikerer, at denne art havde potentielle sundhedsmæssige fordele. Vores undersøgelse forudsat et videnskabeligt grundlag for screening af lovende naturressourcer som kilder til medicin og foreslog en potentiel tilgang til effektiv og bæredygtig udnyttelse af plantegenetiske ressourcer i konstruerede vådområder.

Støtte Information

S1 fil. Højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse af to flavonoider isoleret fra

P

.

crispus

.

Luteolin-3′-O-β-D-glucopyranosid (LU3’O-GP) (fig a). flavon-6-C-β-D-glucopyranosid (FL6C-GP) (fig b). HPLC anvendte en Agela C18-søjle (symmetri R 4,6 × 250 mm) med methanol og H

2O (40%: 60%) som den mobile fase, ved en strømningshastighed på 1 ml /min i 40 minutter og anvendes . UV /V detektion

doi: 10,1371 /journal.pone.0130685.s001

(TIF)

Tak

Vi er taknemmelige for akademisk redaktør og anmelderne for deres værdifulde forslag. Vi ønsker også at takke de professionelle redaktører af Editage for deres engelske redigering.