PLoS ONE: BMCC1 Er en AP-2 Associated endosomale Protein i prostatakræft Cells

Abstrakt

prostatakræft antigen gen 3 (

PCA3

) er indlejret i en intron af et andet gen

BMCC1

(Bcl2- /adenovirus E1B nitten kDa-interagerende protein 2 (BNIP-2) og Cdc42GAP homologi BCH motiv-holdige molekyle på den carboxylterminale region 1), som også opreguleret i prostatacancer. BMCC1 blev oprindeligt betegnet som to gener (

C9orf65 /PRUNE

og

BNIPXL

) på hver side af PCA3 men vore data antyder, at det repræsenterer et enkelt gen koder for et protein med høj molekylvægt. Her demonstrerer vi for første gang ekspressionen af ​​a 300 kDa BMCC1 protein (BMCC1-1) i prostatakræft og melanom-cellelinjer. Dette protein blev udelukkende fundet i den mikrosomale fraktion og lokaliseret til cytoplasmiske vesikler. Vi observerede også udtryk for BMCC1 protein i prostata cancer dele med immunhistologi. GST pull down, immunopræcipitation og massespektrometri protein interaktionsstudier identificerede flere medlemmer af Adaptor relateret kompleks 2 (AP-2) som BMCC1 interaktionskandidater. I overensstemmelse med en rolle for BMCC1 som en AP-2 interagerende endosomale protein, BMCC1 co-lokaliseret med β-adaptin på perinukleære region af cellen. BMCC1 viste også delvis co-lokalisering med den tidlige endosom lille GTP-ase Rab-5 samt stærke co-lokalisering med internaliserede puls-chase mærket transferrin (Tf), der giver bevis for, at BMCC1 er lokaliseret til funktionelle endocytiske vesikler. BMCC1 knockdown påvirkede ikke Tf optagelse og AP-2 knockdown ikke sprede BMCC1 vesikulær distribution, undtagen en væsentlig rolle for BMCC1 i kanonisk AP-2 medieret endocytisk optagelse. I stedet postulere vi en ny rolle for BMCC1 i post-endocytisk handel. Denne undersøgelse giver grundlæggende karakterisering af BMCC1 kompleks i prostata kræftceller, og for første gang implicerer det i vesikeltrafik

Henvisning:. Harris JL, Richards RS, Chow CWK, Lee S, Kim M, Buck M, et al. (2013) BMCC1 Er en AP-2 Associated endosomale Protein i prostatacancerceller. PLoS ONE 8 (9): e73880. doi: 10,1371 /journal.pone.0073880

Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA

Modtaget: Februar 5, 2013; Accepteret: 23, 2013; Udgivet: 6. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Harris et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev finansieret af prostatakræft Foundation of Australia. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en almindeligt diagnosticeret malignitet og en førende årsag til kræftdødsfald i hele verden. Denne betingelse udviser et bredt spektrum af histologiske forandringer og adfærd, der spænder fra præmaligne læsioner, til lokaliserede prostatakræft, der følger en ugidelig kursus til en procentdel af kræftformer, der metastaserer tidligt og fremskridt hurtigt [1]. Derfor, i tillæg til udviklingen af ​​forbedrede diagnostiske og prognostiske værktøjer, er en detaljeret forståelse af cellebiologi af prostatacancer udviklingen og progressionen kræves. Et af de mest lovende biomarkører for prostatakræft er den ikke-kodende RNA PCA3 [2,3]. Dette RNA blev identificeret som en prostatakræft biomarkør ved differential display-analyse af RNA’er fra histologisk normalt og malignt væv fra de samme patienter, og blev oprindeligt beskrevet som Differential Display klon 3 (DD3) [2]. Høje niveauer af PCA3-ekspression er stærkt forbundet med malign transformation af prostata epitel imidlertid det biologiske grundlag for denne korrelation er ikke blevet belyst [2-4].

Vi har tidligere påvist, at

PCA3

er indlejret i intron i et andet gen,

BMCC1

[5].

BMCC1

blev oprindeligt kommenteret som to adskilte gener

c9orf65 /PRUNE

(der koder for N-terminale region) og

BNIPXL

(der koder for C-terminale region). En

BNIPXL Hotel (

BMCC1-4

) åben læseramme blev identificeret ved database søge efter homologe til Bcl-2 interagerende protein BNIP-2 [6]. Forfatterne identificerede

BNIPXL /BMCC1-4

som et gen med en region med høj

BNIP-2

homologi, og navngivet det homologe område BCH (BNIP-2 /Cdc42GAP Homologi) domæne [ ,,,0],6]. Brug eksogent udtrykt mærkede BNIPXL proteiner, de vist, at det interagerer med RhoA og dens aktivator proto-Lbc [6]. Coekspression og interaktionsstudier viste, at BNIPXL binder RhoA og proto-Lbc via forskellige regioner, og at BNIPXL udtryk blokerer RhoA signalering, i det mindste delvist ved at hæmme den stimulerende RhoA-Lbc interaktion [6]. Machida et al. [7] identificerede en længere isoform af BMCC1 i human neuroblastom (BMCC1-3), som strakte kodende exoner 7-19 af senere identificeret BMCC1-1. Høje niveauer af ekspression af dette transkript blev korreleret med en mere gunstig prognose for denne kræft. Beviser for ekspression af den fulde længde BMCC1-1 udskrift spænder over

c9orf65

og

BNIPXL

gener blev leveret af Iwama et al. [8], som klonet et cDNA med fuld længde fra Hela-celler. I denne undersøgelse, og efterfølgende er der påvist BMCC1 udskrifter i begrænsede områder af muse hjerne [8,9]. Clarke et al. [5] viste, at BMCC1 RNA-ekspression er forhøjet i prostatakræft og metastaser i sammenligning med godartet væv, hvilket indikerer, at BMCC1 kan fungere forskelligt i forskellige cancere og vævstyper. En oversigt over BMCC1 isoform udtryk og de forskellige funktioner i BCH domæne indeholdende proteiner findes i seneste publikationer [10,11].

Indledende identifikation af et protein svarende til BMCC1-1 blev demonstreret af Iwama et al. [8]. Denne gruppe rejst et antistof specifikt til det yderste N-terminale region af BMCC1-1, og selvom multiple bånd blev påvist ved Western blot af Hela MR, HEK293T og KNS81 gliomceller, kun bands 250 kDa var følsom over for specifikke siRNA udtynding. Massespektrometri blev brugt til at identificere disse højmolekylære bands som BMCC1-1. I den samme undersøgelse, ekspression af exogent protein fra en cDNA-klon også produceret multiple bånd på SDS-PAGE, sandsynligvis indikerer væsentlig proteolyse, hvilket gør tolkningen vanskelig. For nylig Li et al. [12] identificeret olfaxin proteiner svarende til alternative BMCC1 transcription start sites udtrykt i lugtekolben, med det fremherskende bånd på 52 kDa. Arama et al. [11] opdaget et band af samme størrelse i hele hjernen lysater og dyrkede neuroner og astrocytter, som de kaldte BMCC1s. I den foreliggende undersøgelse ekspression og indledende karakterisering af en enkelt 340 kDa BMCC1 protein i prostatacancer LNCaP beskrives. Identiteten af ​​dette protein blev robust oprettet af påvisning med flere antistoffer mod C og N-terminale områder af proteinet, depletion efter specifikt siRNA og støttet af MALDI TOF /TOF analyser. For første gang identificeret vi endogene protein interaktioner, der involverer en region uden for BCH-domænet. Vi fandt, at en BMCC1 region uden beregningsmæssigt identificerbare funktionelle domæner interagerer med Adaptor proteinkompleks 2 (AP-2). Vi har også demonstreret co-lokalisering af BMCC1 med β-adaptin og forskellige endosomale markører, herunder Rab5 og internaliseret transferrin (Tf). Foreløbige funktionelle analyser tyder BMCC1 er en ikke-kanonisk AP-2 interagerende protein involveret i post-endocytisk handel.

Materialer og metoder

Væv og cellelinjer

Humane prostata væv blev doneret af patienter på Royal Brisbane Hospital med skriftligt informeret samtykke under etisk godkendelse af Queensland Institute for Medical Research menneskelige etiske komité. er blevet bevaret Patient samtykke formularer. Mus væv blev opnået fra a5 måned gammel vildtype mandlige Balbc- mus, under etisk godkendelse af Queensland Institute for Medical Research (QIMR) dyr etisk komité. LNCaP, 22Rv1, DU145, RWPE1, ALVA, PC3 og MCF-7 blev opnået fra ATCC. A11, D11, D28, D33 og D38 var gaver fra Chris Schmidts laboratorium (QIMR). Disse blev opnået fra patienter indskrevet i kliniske forsøg på QIMR, med skriftligt informeret samtykke fra QIMR menneskelige videnskabsetisk komité. En microarray undersøgelse af cellelinier A11 og D11 er blevet offentliggjort [13], som har en klinisk undersøgelse af de D-serien patienter [14]. Alle cellelinier blev opretholdt i DMEM (Gibco) med penicillin og streptomycin, tilsat 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Gibco). Salg

RNA-ekstraktion og cDNA-syntese

totalt RNA fra cellelinier og væv blev oprenset under anvendelse af Trizol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Dette RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af Superscript III (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger.

PCR og generering af cDNA-kloner

cDNA-kloner af BMCC1 og andre gener blev frembragt ved amplifikation af målet fra LNCaP cDNA. Oligonukleotider blev købt fra Sigma Aldrich, blev standard PCR-amplifikationer udført GJ

Pfu

Turbo (Roche). Typiske cyklusbetingelser var 92 ° C 2 minutter efterfulgt af; 92 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek, 72 ° C i 90 sek /kb (2 cyklusser); 92 ° C i 30 sek, 57 ° C i 30 sek, 72 ° C i 90 sek /kb (2 cyklusser); 92 ° C i 30 sek, 53 ° C i 30 sek, 72 ° C i 90 sek /kb (30 cyklusser). Alle q-PCR blev udført under anvendelse af Corbett Rotorgene-6000 (Qiagen, Australien), Rotorgene-6000 Series Software (Qiagen, Australien) og Quantitect® SYBR® Green PCR-kittet (katalog nr. 204.143, Qiagen, Australien). Reaktioner blev fremstillet i tre eksemplarer, og hver indeholdt 7.5μl af qPCR Master Mix, 0,5 pi af hver 10 uM forward og reverse primer og 5 pi af fortyndet cDNA (1:10 fortynding). Cycling betingelse for BMCC1 og p

2M primere var som følger: 95 ° C i 15 minutter, efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 20 sek, 58 ° C i 20 sek og 72 ° C i 20 sek. Cykling betingelser for AP2M1 primere var som følger: 95 ° C i 15 minutter, efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 20 sek, 60 ° C i 20 sek og 72 ° C i 20 sek. Data blev genereret med Rotorgene-6000 Series Software og relative genekspressionsniveauer blev beregnet ved hjælp af metoden i Pfaffl [15]. Primersekvenser og restriktionssites er vist i supplerende materiale (tabel S1). Alle restriktionsenzymer blev indkøbt fra NEB.

Rekombinant proteinekspression, oprensning og tværbinding

Rekombinant proteinekspression og oprensning og tværbinding blev udført som tidligere beskrevet [16].

Antistoffer

Rekombinant BMCC1-GST-fusionsproteiner blev udtrykt og oprenset som beskrevet ovenfor. De kaninantistoffer Ab-1 og Ab-3 blev genereret ved injektion af kaniner med eluerede, ikke-denaturerede GST fusionsproteiner (ved hjælp af Institut for Medicinsk og Veterinærvidenskab, Adelaide standard dosishastighed, tidsplan og hjælpestoffer). BMCC1 Ab-2 antiserum blev genereret ved inokulation af en kanin med denatureret GST-fusionsprotein indlejret i ikke-fikserede polyacrylamid gel skiver (IMV’er). BMCC1 sheep antiserum blev genereret ved inokulering af et får med elueret ikke-denatureret BMCC1-GST-fusionsprotein (IMV’er) (Ab-4). Alle proteiner havde N-terminale GST tags, når inokuleret og de specifikke BMCC1 sekvenser for hvert antistof er anført i tabel S1. Specifikke antistoffer og ikke-specifikke kontrol antistoffer blev oprenset fra serum som beskrevet [16].

Kommercielle antistoffer, der anvendes i dette projekt var muse-anti-DNA PKcs (Santa Cruz produkt 18-2), mus anti-RNA-polymerase II (Abcam, ab5408), kanin-anti-β-adaptin (som detekterer AP-1B1 og AP-2B1) (Santa Cruz A-5), muse-anti-EEA1 (BD Transduction Laboratories, 610.457), muse-anti-α-tubulin (Sigma T9026) og muse-anti-GAPDH (Millipore MAB374). Passende AlexaFluor konjugeret æsel sekundære antistoffer blev opnået fra Invitrogen og HRP-konjugerede sekundære antistoffer var fra Sigma.

Plasmid og siRNA transfektion

LNCaP blev udpladet i 6 brønds skåle i antibiotikafrit vækstmedium mindst 48 h før transfektion. Plasmider blev transficeret ind LNCaP anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner (2 ug plasmid og 5 pi Lipofectamine 2000 pr 9,5 cm

2 brønd). siRNA-duplexer blev købt fra Invitrogen (sekvenser i tabel S1) og transficeret ved hjælp af Lipofectamine RNAiMAX eller Lipofectamine 2000 (100 pmol af siRNA duplex og 5 pi Lipofectamine pr 9,5 cm

2 godt).

Generering af celle og væv lysater

Celler blev løsrevet fra deres vækst substrat ved trypsinisering i serumfrit DMEM med 0,025% trypsin (Gibco), og trypsin blev inaktiveret ved tilsætning af DMEM indeholdende 10% serum. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering (500 x g i 5 min) og vasket to gange i PBS. Vaskede cellepellets blev derefter lyseret i iskold Mammalian Cell Lysis Buffer (MCLB, 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40). Alle lysater indeholde en 2 x koncentration af Roche Komplet EDTA-fri proteasehæmmer. Grundig vask til fjernelse cellekultur trypsin og tilsætning af en høj koncentration af proteaseinhibitorer er

kritisk

at detektere ikke-nedbrudt BMCC1, som ellers er genstand for hurtig proteolyse. Væv lysater blev dannet ved homogenisering i MCLB, ved formaling i en Kontes størrelse 22 slebet dounce homogenisator. Celler og væv lysater blev klaret ved centrifugering (17.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C). Hjernevæv lysater blev underkastet yderligere behandling for at fjerne et lag af flydende lipider. Hjernevæv lysater blev separeret på at Biorad Micro BioSpin afsaltning kromatografisøjler, som var blevet præ-ækvilibreret med MCLB, som fjernede klistret uopløseligt materiale. Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af Biorad, Lowry protein assay med BSA-standarder.

Western blotting

Prøver i Laemelli SDS-PAGE loading buffer blev underkastet standard SDS-PAGE. Proteiner blev overført til nitrocellulose Amersham i transfer-buffer (6 g /L Tris-base, 3 g /l glycin, 0,36 g /l SDS, 20% methanol) til 100 V.H. Membraner blev blokeret i blokeringsopløsning (PBS-0,05% Triton-X100 med 5% BSA eller PBS /0,07% Tween 20 med 4% skummetmælkspulver). Membraner blev probet under anvendelse af mellem 0,2 og 5 ng /pl af de angivne antistoffer i blokerende opløsning ved omgivelsestemperatur i 2 timer eller 4 ° C natten over og detekteres under anvendelse af HRP-konjugerede sekundære antistoffer og Western Lightning luminol reagens (Pierce).

Immunpræcipitation og GST pulldowns

Cellelysater blev dannet som beskrevet ovenfor. For immunopræcipitation blev lysater inkuberet med oprenset null eller BMCC1 antistoffer (0,5-2 ug antistof pr mg lysat) ved 4 ° C natten over. BMCC1-antistof-komplekser blev udfældet ved tilsætning af protein G-agarose resin i 2 timer ved 4 ° C. For GST pulldowns, blev lysater inkuberet med BMCC1-GST-fusionsprotein tværbundet harpiks ved 4 ° C natten over. I begge tilfælde blev ubundne proteiner vasket fra harpiksen i 3 x 20 rumindhold vaske med kold lysebuffer. Udfældede proteiner blev elueret ved tilsætning af 2 harpiks lejevolumener SDS-PAGE loading buffer. Eluerede proteiner blev derefter analyseret ved SDS-PAGE og western blotting.

massespektrometri

sølvfarvede gel stykker blev affarvet i 15 mM kaliumferricyanid og 50 mM natriumthiosulfat og vasket i vand. Stykker blev dehydreret i 25 mM ammoniumbicarbonat /50% acetonitril og vakuumtørret. De blev successivt reduceret og alkyleret med 25 mM DTT og 55MM iodacetamid, både i 25 mM ammoniumbicarbonat. Gelstykker blev dehydreret i 25 mM ammoniumbicarbonat /50% acetonitril og tørret igen. De blev derefter hydreret med 20 ng /uL sekventering trypsin (Promega) i 40 mM ammoniumbicarbonat /10% acetonitril, toppede for at forhindre udtørring og fordøjet natten over ved 37

° C. Peptider blev ekstraheret ved vask af stykker i 0,1% TFA. Eluerede peptider blev afsaltet under anvendelse af C-18 ZipTips (Millipore) ifølge producentens instruktioner. Peptider blev derefter blandet med MALDI-matrix (Bruker) og analyseret under anvendelse Bruker Ultraflex i positiv ion reflektor mode med en MS /MS tolerance på 100 ppm. Analyse blev udført in-house hjælp Mascot, der søger mod 2012 pattedyr ikke-redundant database, der giver mulighed for standard post-translationelle modifikationer, og op til en forpasset trypsin spaltning [17].

Rensning af mikrosomer

LNCaP-celler blev separeret i nukleare og cytoplasmiske fraktioner ved douncing i hypotonisk opløsning som tidligere beskrevet [16]. Mikrosomer blev oprenset fra cytoplasmatiske ekstrakt ved ultracentrifugering (100.000 x g i 1 time ved 4 ° C under anvendelse af en Beckman SW55Ti rotor). Mikrosomer blev resuspenderet i SDS lysis buffer (2% SDS, 1 mM DTT, 125 mM Tris pH 6,8) og blokerede ved 17.000 x g i 20 min. Cytosol blev koncentreret til 1/10 sit oprindelige volumen under anvendelse af en 10K afskæringsværdi centrifugalfilterenhed (Millipore) før SDS-PAGE.

Immunohistologisk farvning

En standard immunhistokemi farvning blev fulgt. Paraffinindstøbte snit blev skåret ved 4 um og blev monteret på fem-aminopropyltriethoxysilan (AAS) coatede dias, som derefter blev efterladt tørre natten over. De paraffinindlejrede snit blev afvokset i xylen og blev behandlet med mikrobølgeopvarmning ved 60 ° C i 20 minutter i en citratpuffer (2,1 g /1000 ml; pH 6,0) for antigen hentning. Efter blokering af endogen peroxidase, vask i phosphatbufret saltvand (PBS) og blokering af ikke-specifik binding af sekundært antistof med normal svineserum blev rutinemæssig streptavidin-biotin-peroxidase immunfarvning med diaminobenzidin anvendt. Snittene blev inkuberet natten over i BMCC1 Ab-3. Det primære antistof blev erstattet med PBS i sektioner, der anvendes som negative kontroller. Snittene blev modfarvet med Harris Hæmatoxylin. Da BMCC1 vides at være positiv i godartet prostatisk væv, blev en kerne af prostatavæv med godartet hyperplasi inkluderet som en positiv kontrol i hver af arrayet.

Scoring af BMCC1 proteinekspression i cellerne i vævene af de 74 undersøgte patienter var baseret på andelen af ​​celler farvet med BMCC1 polyklonale antistof og intensiteten af ​​pletten i cellerne. Farvning intensitet blev scoret på følgende skala: Ingen farvning, mild, moderat og stærk. Alle prøver blev analyseret under mikroskopisk undersøgelse ved hjælp af et Olympus mikroskop. (Model: BX40), ved en forstørrelse på x200

Immunofluorescens og mikroskopi

Celler blev podet på sterile dækglas mindst 24 timer før fiksering. Medier blev opsuget, og cellerne blev vasket en gang i PBS før tværbinding (i PBS med 10% foramlin i 10 minutter ved stuetemperatur). Fiksativ blev fjernet, og cellerne vasket i PBS før permeabilisering og blokering i PBS med 0,05% Triton-X100 og 5% FBS. Celler blev derefter farvet med mellem 0,4 og 2 ng /pi af de angivne primære antistoffer ved stuetemperatur i 2 timer eller 4 ° C natten over. Arter matchede oprenset IgG var ansat som en passende kontrol for antistof krydsreaktivitet /adsorption. Alle antistoffer blev påvist ved anvendelse af passende Alexafluor488 eller AlexaFluor 594 donkey sekundære antistoffer. Konfokal mikroskopi blev udført på en Zeiss LSM710. Co-lokalisering blev kvantificeret under anvendelse Zen 2011 software. Overlap koefficient /overlap koefficient efter Manders, en fremgangsmåde ufølsom overfor forskelle i signalintensitet, blev anvendt til at kvantificere co-lokalisering i billedpar.

Transferrin optagelse

LNCaP podedes på sterile dækglas 24h før mærkningen. Pulse-chase-optagelse af en konjugeret transferrin-receptor-komplekset (Tf-R) blev udført i det væsentlige som beskrevet af Aschenbrenner et al. [18]. Kort beskrevet blev cellerne serumudsultet i serumfrit medie (phenol-DMEM-F12, Life Technologies) i 2 timer ved 37 ° C. Til overfladen label celler med konjugeret transferrin blev celler anbragt på is i 30 minutter og derefter inkuberet med 20 pg /ml AlexaFluor-594 konjugeret transferrin (Molecular Probes) fortyndet i iskold serumfri medier i 30 minutter. Celler blev vasket to gange med iskold serumfri medier for at fjerne ubundet transferrin og t = 0 dækglas blev høstet for BMCC1 immunfluorescens som beskrevet. De resterende dækglas blev jaget i forvarmet serum frie medier for de angivne perioder før høst. Optagelse af konjugeret transferrin-receptor-komplekset blev også udført under anvendelse af en fremgangsmåde svarende til Boucrot et al. [19]. Celler blev skyllet en gang med DMEM-F12 /5% FCS derefter inkuberet i 10 minutter med 10 pM AlexaFluor-594 konjugeret transferrin i DMEM-F12 /5% FCS. Celler blev derefter vasket med iskold PBS, før de høstes for immunfluorescens.

Resultater

BMCC1-1 protein udtrykkes i udvalgte kræftformer

hBMCC1

er et stort og komplekst transkriptionsenhed, med den rutinemæssigt anvendt prostatakræft biomarkør

hPCA3

indlejret i

BMCC1

intron 6.

BMCC1

tidligere er blevet kommenteret som diskrete

PRUNE2

BNIP

gener flankerende

PCA3

, med eksogen udtryk baserede undersøgelser afspejler dette. De seneste resultater har vist, at

BMCC1

producerer en udskrift (betegnet BMCC1-1), der strækker sig over den integrerede antisense

PCA3

gen [5,8]. Her demonstrerer vi, at BMCC1-1 RNA udtrykkes i 10/10 PCA3 positiv prostatacancer vævsprøver (figur S1).

Vi har tidligere vist, at prostatacancer LNCaP udtrykker høje niveauer af både BMCC1- 1 og PCA3-RNA’er [5]. For at udvide disse undersøgelser til endogene BMCC1 protein, genereret vi flere polyklonale antistoffer ved hjælp rekombinant udtrykte fragmenter af BMCC1 som antigener (skematiske i figur S2, kloning primere i tabel S1). Disse antistoffer blev anvendt til at vise, at

BMCC1

producerer en 300 kDa protein i LNCaP (figur 1). Størrelsen af ​​dette protein svarer til forudsagt fra BMCC1-1 cd’er og oversat peptidsekvens (

dvs.

3088 aminosyrer, ~ 340 kDa). 340 kDa BMCC1 protein blev påvist med både C-terminale Ab-1 (dannet mod aminosyre 2345-2705) og N-terminal Ab-3 (dannet mod aminosyre 1-369) i LNCaP-celler. Ekspression af dette protein blev ikke påvist i PCA3 negative prostatacancer-cellelinier PC3, DU145, ALVA, RWPE-I (figur 1A). BMCC1 ekspression var også fraværende fra PCA3 negativ brystcancer MCF7. BMCC1 blev ikke detekteret i normale celler, som vi tidligere har rapporteret [5]. Identiteten af ​​den 340 kDa bånd blev bekræftet ved immunopræcipitation af BMCC1 fra LNCaP-ekstrakter under anvendelse Ab-3, efterfulgt af Western blot-påvisning med Ab-2 (dannet mod aminosyre 222-276) (figur 1B). Specificiteten af ​​BMCC1 detektion blev yderligere bekræftet ved forbigående udtømning af BMCC1 udtryk ved siRNA og detektion med flere antistoffer. BMCC1 siRNA transfektion forårsagede en dramatisk reduktion i intensiteten af ​​den 340 kDa-proteinbånd påvist ved både C- og N- terminale antistoffer Ab-1 og Ab-3 (figur 1C). Dette understøtter immunpræcipitation data til robust påvise, at

BMCC1

er et protein-kodende gen, der producerer en 340 kDa protein i PCA3 udtrykkende LNCaP. Vi ikke påvise ekspression af siRNA følsomme anti-BMCC1 reaktive bånd ved lavere molekylvægte, hvilket indikerer, at BMCC1-1 proteinet er den dominerende genprodukt i prostatacancerceller (data ikke vist). BMCC1 proteinekspression blev ikke påvist i adskillige cellelinjer afledt fra neuroblastom, bryst- og ovariecancer (data ikke vist). BMCC1 protein blev påvist i 3/5 primære melanomcellelinier, og i nogle tilfælde blev der observeret en dublet (fig S3). Identiteten af ​​båndene i melanomcellelinier blev demonstreret robust ved påvisning af BMCC1 med antistoffer mod forskellige regioner af proteinet, Ab-1 og Ab-3. Dette indikerer, at BMCC1 kunne have en rolle i andre tumortyper.

A. BMCC1 immunoblot af totale celleekstrakter. 30 ug lysat pr cellelinje blev underkastet 5% SDS-PAGE. BMCC1 ekspression blev påvist under anvendelse af et kanin antistoffer rejst mod aa 2345-2705 (C-terminal, kanin-anti BMCC1, Ab-1) og et andet antistof, Ab-3, som genkender N-terminalen af ​​BMCC1. DNA PKcs blev anvendt som en loading kontrol.

B. Immunopræcipitation af BMCC1 fra LNCaP samlede lysat. BMCC1 blev immunpræcipiteret ved inkubation af 1 mg LNCaP-lysat med 1 ug Ab-3 i 8 timer ved 4 ° C efterfulgt af udfældning med protein G agarose. Uspecifik (NS) IgG blev anvendt i stedet for Ab-3 i en kontrol IP. Vasket harpiks elueres i SDS-PAGE loading dye og vestlige blottet. IgG tung kæde (lastning) demonstrerer lige antistof input.

C. Udtømning af BMCC1 ekspression ved siRNA. LNCaP-celler blev transficeret med BMCC1 siRNA 1730 (siBMCC1) eller kontrol siRNA (siControl). Samlede lysat blev høstet 3 dage efter transfektion og BMCC1 ekspression analyseret ved western blotting med BMCC1 Ab-1 (C-terminal) og Ab-3 (N-terminal). Blottet blev fuldstændig strippet mellem sekventielle prober. RNA-polymerase II er en belastning kontrol.

Machida et al. [7] og Li et al. [12] anvendte

in situ

hybridisering af muse fostre viser, at BMCC1 RNA overvejende udtrykkes i nervevæv, og Zhou et al. [20] anvendte PCR af musevæv RNA til at vise, at mindst BCH-domænet udtrykkes i en række vævstyper. Iwama et al. [8] anvendes PCR-primere spænder over hele genet for at demonstrere kraftig ekspression i den dorsale rod ganglion med mellemliggende ekspression i hele hjernen, rygmarven, prostata og livmoderen og lav ekspression i andre væv. For at løse denne uoverensstemmelse af konstitutive versus begrænset RNA udtryk, samt at få yderligere oplysninger om protein-ekspression og formodede splejsede genprodukter, vi immunoblottedes proteinlysater fra et panel af voksne musevæv hjælp BMCC1 Ab-4. I denne ikke-tumorigen indstilling detekteret vi en stærk ~ 80 kDa store bånd i hjernevæv, med lavere ekspression af et mindre 72 kDa bånd (fig S4). Den 52kDa BMCC1s identificeret af Arama et al. [11] blev ikke observeret her, fordi antigenet for Ab-4 spænder aminosyrer 2192-2433 af BMCC1-1 og ikke indeholder nogen del af BMCC1s (se figur S2). For at bekræfte ekspression af BMCC1 i en prostata cancer tumor indstilling blev immunhistologisk farvning af prostatacancer væv udføres under anvendelse af Ab-3. Minimal BMCC1 farvning blev observeret i godartet prostatahyperplasi kirtelepitel og stroma, med stærkere farvning observeret i kirtelepitel af prostata tumorer (figur S5).

BMCC1 interagerer med AP-2 i prostata kræftceller

for at få indblik i den cellulære funktion af BMCC1, interagerende proteiner blev identificeret ved rensning med BMCC1-GST affinitetsresiner. Vi genererede en række overlappende BMCC1-GST kloner i pGEX, som dækker den fulde længde cDNA (tabel S1). Rekombinante proteiner blev udtrykt og tværbundet til glutathion agarose til at generere en serie af affinitet matricies for interagerende proteiner. Tværbundne GST-BMCC1 fusion harpikser blev inkuberet med samlede LNCaP-lysat at oprense BMCC1 interaktionskandidater. Resin associerede proteiner blev elueret, løst og visualiseret ved sølvfarvet SDS-PAGE. BMCC1 GST fragmenter 1-2 og 4-10 trak ned en række proteiner ofte identificeret som ikke-specifikke eller ikke-funktionelle interaktionskandidater. Disse omfatter eEF1γ, 40S ribosomale protein, Grp75 og GRP78 (data ikke vist). BMCC1 GST F3 (aminosyrerne 575-904) udfældet specifikke bånd på 50 kDa og 110 kDa (figur 2A). Den 50 kDa og 110 kDa interagerende blev udskåret og identificeret ved massespektrometri (MALDI MS /MS på en Bruker Ultraflex III). Et resumé af Mascot search data er vist i tabel S2. Dette viste, at BMCC1-F3 interagerer med flere medlemmer af adapteren Relaterede protein Complex 2 (AP-2). AP-2 komplekset er et endosom associeret heterotetramer bestående af tre forskellige konstitutive komponenter (AP-2S1, AP-2M1 og AP-2B1 /β-adaptin) og en af ​​to indbyrdes eksklusive komponenter (AP-2A1 eller AP-2A2) [ ,,,0],21]. Den 50 kDa BMCC1-F3 interagerende protein blev identificeret som AP-2M1, baseret på to særskilte identifikationer med i alt 8 ikke-redundante peptider (tabel S2). 110 kDa BMCC1 interagerende bånd indeholdt en blanding af tre højmolekylære AP-2 komplekse medlemmer: AP-2A1, AP-2A2, og AP-2B1 (tabel S2). AP-2B1 blev identificeret i to prøver med i alt 5 unikke peptider. Homologien mellem AP-2A1 og AP-2A2 gør individuel unik identifikationer kompleks (fig S6). AP-2A1 blev identificeret i 3 prøver med i alt 6 peptider, som ikke svarer til AP-2A2. AP-2A2 blev identificeret i én prøve med et peptid ikke kan henføres til AP-2A1. I disse prøver, kan tre individuelle peptider have svaret til enten AP-2A1 eller AP-2A2 og kan ikke tilskrives med sikkerhed til den ene eller den anden grund sekvensidentitet (Tabel S3). Ingen beregningsmæssigt identificerbare domæner kunne tilskrives denne region, er så funktionel interaktion kortlægning af BMCC1 identificeret et nyt protein-protein interaktion motiv. Samspillet mellem BMCC1 og AP-2-komplekset blev bekræftet ved co-immunoudfældning. BMCC1 blev immunpræcipiteret fra LNCaP-lysater og de resulterende interagerende proteiner blev elueret og analyseret ved Western blotting (figur 2B) afslører, at endogene BMCC1 interagerer med β-adaptin og AP-2A1 /2 (Figur 2B). Den endogene samspil mellem BMCC1 og AP-2-komplekset blev yderligere underbygget af BMCC1 immunopræcipitation fra lysater af celler, som var blevet BMCC1 udtømt med siRNA. Et 340 kDa bånd blev detekteret på det højmolekylære løse Coomassie farvede gel (figur 2C). Dette bånd var med reduceret intensitet i immunopræcipitatet fra BMCC1 depleteret celler sammenlignet med kontrollen siRNA celler. Selvom immunofældning er ikke en kvantitativ tilgang, dette reduceret intensitet guidet band udvælgelse til efterfølgende MS-analyse. Identifikationen af ​​dette bånd som BMCC1 blev bekræftet ved MALDI-TOF /TOF af tryptiske peptider fra udskårne gel skive. Vigtigt er det, den ekstreme BMCC1 N-terminale peptid TEFNYFTETR, ikke til stede i den trunkerede isoform (BMCC1-3) rapporteret af Machida et al. [7] blev identificeret blandt disse (Tabel S4). Dette gav

de novo

beviser for BMCC1-1 proteinekspression i LNCaP celler. Interaktionen profil BMCC1 blev undersøgt ved Western blotting disse immunopræcipitater for AP-2A1 /2 og β-adaptin. I overensstemmelse med det reducerede niveau af BMCC1 protein i siBMCC1 immunoprecipate, reducerede signaler for AP-2A1 /2 og β-adaptin blev påvist i bundfald siBMCC1 lysat end kontrol lysat. Dette gav yderligere beviser for, at disse proteiner specifikt interagerer med BMCC1 (Figur 2C).