PLoS ONE: ErbB2 og NFKB Overekspression som indikatorer for Chemoradiation Resistance og Formodede Mål at overvinde modstand i Muscle-invasiv blærekræft

Abstrakte

Radikal cystektomi for muskel-invasiv blærekræft (MIBC) patienter ofte forringer deres livskvalitet (QOL) grundet urinafledning. For at forbedre deres QOL, har en blære-besparende alternativ strategi ved hjælp chemoradiation blevet udviklet. I blære-besparende protokoller, komplet respons (CR) til induktion chemoradiation er en forudsætning for blære konservering og gunstige overlevelse. Således forudsige chemoradiation modstand og overvinde det vil øge de enkelte MIBC patienternes chancer for blære konservering. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge formodede molekylære mål for behandling med henblik på at forbedre chemoradiation respons. Ekspressionsniveauer af erbB2, NFKB, p53, og survivin blev vurderet immunhistokemisk i forbehandling biopsi prøver fra 35 MIBC patienter, hos hvem chemoradiation følsomhed var blevet patologisk evalueret i cystektomi prøver, og sammenslutninger af disse ekspressionsniveauerne med chemoradiation følsomhed og kræft-specifikke overlevelse (CSS ) blev undersøgt. Af de 35 patienter, 11 (31%) opnåede patologisk CR, mens tumorer i de resterende 24 patienter (69%) var chemoradiation-resistente. Multivariat analyse identificeret erbB2 og NFKB overekspression og hydronefrose så betydelige og uafhængige risikofaktorer for chemoradiation modstand med respektive relative risici for 11,8 (

P

= 0,014), 15,4 (

P

= 0,024) og 14,3 (

P

= 0,038). Den chemoradiation modstand sats var 88,5% for tumorer overekspression erbB2 og /eller NFKB, men kun 11,1% for de negative for begge (

P

0,0001). Den 5-årige CSS sats var 74% samlet. Gennem multivariat analyse, overekspression af erbB2 og /eller NFKB blev identificeret som en selvstændig risikofaktor for blærekræft død med marginal betydning (hazard ratio 21,5,

P

= 0,056) sammen med chemoradiation modstand (

P

= 0,003) og hydronefrose (

P

= 0,018). Den 5-årige CSS sats for de 11 patienter, der opnåede patologisk CR var 100%, mens der for 24 med chemoradiation-resistent sygdom var 61% (

P

= 0,018). Således erbB2 og NFKB overekspression er relevante for chemoradiation modstand og er formodede mål sigter på at overvinde chemoradiation modstand i MIBC

Henvisning:. Koga F, Yoshida S, Tatokoro M, Kawakami S, Fujii Y, Kumagai J, et al. (2011) ErbB2 og NFKB Overekspression som indikatorer for Chemoradiation Resistance og Formodede Mål at overvinde modstand i Muscle-invasiv blærekræft. PLoS ONE 6 (11): e27616. doi: 10,1371 /journal.pone.0027616

Redaktør: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de kræft, Brasilien

Modtaget: 27. september 2011; Accepteret: 20 Oktober 2011; Udgivet: November 10, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet, delvist af tilskud-in-støtte til videnskabelig forskning (19.791.102, 19.791.103), fra Undervisningsministeriet , Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er 5

th mest almindelige kræftform i USA, med 70,530 nye patienter og 14,680 dødsfald registreret i 2010 [1]. Muskel-invasiv blærekræft (MIBC) tegner sig for en tredjedel af alle tilfælde blærekræft [2]. Radikal cystectomy er referencen standard for pleje af patienter med MIBC, men urinafledning, som skal udføres samtidig med radikal cystektomi, og postsurgical sygelighed potentielt kompromittere patienternes livskvalitet. For at overvinde disse problemer, har blære-besparende tiltag med forskellige modaliteter blevet undersøgt. Blandt dem, har trimodality protokoller, der består af transuretral resektion (TUR), kemoterapi og strålebehandling gav de mest gunstige onkologiske udfald, med 5-års samlet overlevelse på 50 til 60%, der kan sammenlignes med nutidige overlevelsesrater for øjeblikkelig radikal cystektomi serien [3], [4]. I de fleste strålebehandling (CRT) -baserede blære-besparende protokoller, er patienter, der opnår komplet respons (CR) efter induktion CRT selektivt udsat for consolidative behandlinger for blære konservering, mens dem, der ikke opnår CR anbefales at gennemgå radikal cystektomi [5] . Hertil kommer, at svar på induktion CRT har en stærk indflydelse på overlevelsen af ​​MIBC patienter uanset efterfølgende radikal cystektomi med helbredende hensigt [6], [7]. Således, evnen forudsige ikke-CR patienter og udvikling af en hidtil ukendt strategi til at forbedre deres reaktion på CRT ville øge chancerne for blære konservering og potentielt forbedre overlevelse resultater i MIBC patienter.

En række translationelle studier der er blevet udført for at identificere molekylære markører, der forudsiger terapeutiske respons på kemoterapi og /eller strålebehandling i patienter med MIBC eller mere avancerede former af sygdommen. Adskillige molekyler og genetiske modifikationer er blevet identificeret som prædiktorer for CRT respons i MIBC [8], [9], [10], [11], [12]. Men de fleste undersøgelser har fokuseret på at forudsige CRT respons uden også specifikt forsøger at forbedre CRT respons ved at målrette molekylerne er ansvarlige for CRT modstand.

Formålet med den aktuelle undersøgelse er at identificere formodede molekylære mål at forbedre CRT følsomhed og dermed at forbedre patientens prognose. Af flere molekylære markører sigende forudsige ugunstig tumor respons på CRT eller strålebehandling [8], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], der der kan målrettes af små molekyler eller monoklonale antistoffer indbefatter erythroblastic leukæmi viral onkogen homolog 2 (erbB2, også kendt som HER2 /neu) [8], nuklear faktor-KB (NFKB) [13], [14], mutant p53 [17 ], [18], og survivin [19]. Vi undersøgte sammenslutninger af udtrykket profiler af disse oncoproteiner med både CRT sensitivitet og cancer-specifik overlevelse (CSS) hos en gruppe MIBC patienter for hvem CRT følsomhed tumorer var blevet patologisk evalueret i cystektomi prøver.

Metoder

etisk erklæring

den etiske komité i Tokyo Medicinsk og Dental University og godkendt den aktuelle undersøgelse protokol (godkendelsesnummer 602). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, hvis tumor væv blev undersøgt for ekspression af CRT resistens-associerede proteiner.

Patienter

Mellem 1997 og 2008, 162 MIBC patienter uden klinisk metastaser blev behandlet i overensstemmelse med vores institutionelle terapeutisk protokol, som er beskrevet andetsteds [7], [21], [22]. Kort beskrevet patienter gennemgik transuretral resektion (TUR) af blæren tumor og induktion CRT bestående af strålebehandling ved ekstern bestråling til den lille bækken (40 Gy) og to cykler af samtidige intravenøs cisplatin (20 mg /dag i 5 dage) adskilt af en tre-ugers interval. Når blærekræft blev intravesikalt lokaliseret og ikke involvere blærehalsen og trigone, og resterende sygdom var klinisk fraværende eller kun til stede i en lille mængde efter induktion CRT, kunne patienten selektivt gennemgå consolidative partiel cystektomi med bækken lymfeknude dissektion for blære konservering; ellers radikal cystektomi blev anbefalet. Af de 162 patienter, 88, som gennemgik synligt komplet TUR før CRT og en anden 39, der ikke undergår cystektomi blev udelukket. I de resterende 35 patienter, hvor tumor følsomhed over for CRT blev vurderet patologisk i cystectomy prøver, undersøgte vi kliniske og molekylære variabler er relevante for CRT resistens, som blev defineret som tilstedeværelse af patologisk residual sygdom (ikke-CR) i cystektomi prøver.

TNM stadie

Klinisk fase blev bestemt i henhold til TNM-systemet 2002 [23] baseret på resultater opnået gennem TUR, bimanual undersøgelse og CT af brystet, maven og bækken. MR-scanning af bækkenet var også inkluderet startende i 2007.

Opfølgende

Patienter blev væsentligt fulgt med intervaller 3 måneder for de første 2 år, ved 6-måneders interval for følgende tre år, og årligt derefter. Evalueringer bestod af sygehistorie, fysisk undersøgelse, komplet blodtælling og blod kemi, og CT af brystet, maven og bækken. Urincytologi, cystoskopi og bækken MRI blev tilsat for blære-skånet patienter. Overlevelse intervaller blev beregnet ud fra den første dag i CRT til dødsdagen.

Immunhistokemi

Immunfarvning blev udført som tidligere beskrevet [24] ved hjælp af formalin-fikseret paraffinindstøbte tumorvæv opnået ved TUR før induktion CRT. Primære antistoffer blev anvendt, var præ-fortyndet kanin-polyklonalt anti-erbB2-antistof (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark; 1: 300), kanin monoklonalt antistof mod survivin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA; ved 1: 200), mus monoklonalt antistof mod p53 (PAb1801; 1:40) og NFKB p65 (F-6; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; ved 1: 100). Procentdele af tumorceller var positive for immunfarvning blev bedømt. Da NFKB p65 udøver sine onkogene egenskaber som et nukleart transskriptionsfaktor blev nuklear immunreaktivitet bedømt som positive. Glassene blev revideret ved en forstørrelse på × 200 med to uafhængige observatører (Y. S. og J.K.), der var blindet for klinisk-patologiske data. I tilfælde af observatør uenighed, blev en endelig afgørelse truffet af konsensus mellem de to observatører.

Statistisk analyse

Forskelle mellem grupper blev vurderet ved hjælp af Chi-square test for kategoriske data. Cut-off værdier for kontinuerlige variabler bedst forudsige CRT modstand blev bestemt ved partition analyse. Risikofaktorer for CRT modstand og blærekræft død blev evalueret ved hjælp af logistisk regressionsanalyse og Cox proportional hazard model, hhv. I multivariat analyse blev variable valgt ved hjælp af baglæns trinvis metode. Overlevelseskurver blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og deres forskelle blev vurderet ved log-rank test. Disse statistiske analyser blev udført ved anvendelse JMP 8,0 statistisk software (SAS Institute, Cary, NC, USA). Forskelle blev betragtet som signifikante ved

P

0,05

Resultater

Baseline statistik over de 35 egnede patienter er anført i tabel 1. Alle MIBCs omfattede høj kvalitet urothelial karcinomer. . Fire (11%) undergik delvis cystektomi som consolidative terapi for blære konservering mens 31 (89%) undergik radikal cystektomi. Af de 35 patienter, 11 (31%) opnåede patologisk CR; De resterende 24 patienter med CRT-resistent MIBC, patologiske T stadier var Tis i 2 (6%), T1 i 8 (23%), T2 i 4 (11%), T3 i 9 (26%), og T4A i 1 (3%). Patologisk lymfeknudemetastase blev fundet i 3 patienter (9%).

Immunoreaktivitet for erbB2, NFKB, p53, og survivin blev observeret i 20 (57%), 16 (46%), 25 ( 71%), og 28 patienter (80%), henholdsvis (figur 1). Cut-off værdi på immunreaktivitet der bedst forudsagt klinisk CRT modstand var 20% for erbB2, NFKB, og survivin. For p53, blev en tidligere rapporteret cut-off værdi på 10%, der anvendes [25].

Nedsat fra × 400.

Blandt de kliniske og molekylære variabler er anført i tabel 1, univariate analyse viste, at erbB2 overekspression var signifikant associeret med CRT modstand (

P

= 0,003, tabel 2); NFKB overekspression, tilstedeværelsen af ​​hydronefrose, og tumor størrelse ≥ 5 cm blev også forbundet med CRT modstand på trods af ikke at nå statistisk signifikans (

P

= 0,055, 0,056, og 0,075 henholdsvis). Multivariat analyse identificeret erbB2 og NFKB overekspression og tilstedeværelsen af ​​hydronefrose så væsentlig og uafhængige risikofaktorer for CRT modstand, med de respektive relative risici for 11,8 (

P

= 0,014), 15,4 (

P

= 0,024) og 14,3 (

P

= 0,038, tabel 2). Hverken p53 eller survivin var signifikant associeret med CRT modstand. Evne til at forudsige CRT modstand blev styrket, da blev brugt data om ekspression af både erbB2 og NFKB; CRT modstand lå 88,5% blandt tumorer overeksprimerer erbB2 og /eller NFKB men kun 11,1% blandt dem, negative for begge (

P

0,0001). Således erbB2 og NFKB overekspression er relevante for CRT modstand i MIBC.

Under opfølgningsperioden (median 60 måneder, interval 19-104), 10 patienter døde af blærekræft. Den 5-årige CSS sats var 74%. Klinisk-patologiske og molekylære variabler forbundet med blærecancer død, er anført i tabel 3. univariat analyse afslørede, at CRT modstand og tilstedeværelsen af ​​hydronefrose var signifikant associeret med blærecancer død (

P

= 0,003 og 0,008, henholdsvis). Multivariat analyse viste, at CRT modstand var den stærkeste og mest selvstændig risikofaktor (

P

= 0,003) efterfulgt af tilstedeværelsen af ​​hydronefrose (

P

= 0,018). Overekspression af ErbB2 og /eller NFKB blev også identificeret som en selvstændig risikofaktor for blærekræft død med marginal statistisk signifikans (

P

= 0,056). Den 5-årige CSS blandt de 11 patienter med patologisk CR var 100%, mens der for de resterende 24 med CRT-resistente MIBC var 61% (

P

= 0,018). Således høj følsomhed til CRT er forbundet med fremragende overlevelse resultater blandt MIBC patienter.

Diskussion

Den aktuelle undersøgelse viste, at erbB2 og NFKB overekspression spiller en potentiel rolle i CRT modstand og uafhængigt forbundet med ugunstige CSS med marginal betydning i MIBC patienter behandlet med induktion CRT plus cystektomi. Dette indikerer, at erbB2 og NFKB er formodede terapeutiske mål for behandlinger til formål at forbedre CRT følsomhed i MIBC. Dette er den første undersøgelse for at påvise sammenhængen mellem NFKB overekspression og CRT modstand i MIBC og den potentielle prognostiske effekt af en kombineret udtryk profil erbB2 og NFKB hos patienter behandlet med induktion CRT og cystektomi. Som vi og andre har demonstreret, er en bedre respons på CRT forbundet med mere favorable overlevelse resultater [4], [7], [26]. Således øge CRT følsomhed ved at målrette erbB2 og NFKB kan forbedre overlevelsestid blandt patienter behandlet med CRT.

ErbB2 er medlem af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) familie af receptortyrosinkinaser, som genererer et komplekst program af signaltransduktionshændelser som modulerer celleproliferation, differentiering, invasion, og overlevelse [27]. I modsætning EGFR, går erbB2 ikke sin egen ligand; i stedet, det heterodimeriserer med andre aktiverede EGFR medlemmer til at forbedre og forlænge deres signalering. I kræftceller overudtrykker erbB2 grund genamplifikation, høj basal autophosphorylering af erbB2 fremmer onkogene aktiviteter, herunder metastaser og terapeutisk modstand [27]. Ifølge tidligere rapporter om MIBC, erbB2 overekspression er en uafhængig risikofaktor for kræft død hos patienter radikal cystektomi [28] og en uafhængig prædiktor for ikke-CR efter CRT, men ikke en risikofaktor for kræft død hos patienter behandlet med CRT [8 ]. Resultaterne af vores undersøgelse er i overensstemmelse med de af dette forsøg, teoretisk støtter supplerende anvendelse af erbB2 inhibitorer til forbedring CRT følsomhed.

NFKB er en transkriptionsfaktor involveret i cellulære respons på forskellige ekstracellulære stimuli, såsom stress og cytokiner [29]. I kræftceller er NFKB ofte aktiveres afvigende, fremme invasionen, metastaser, og overlevelse af disse celler. Faktisk er NFKB overekspression forbundet med dårlig prognose i forskellige maligniteter, herunder MIBC [30] og med CRT resistens i esophageal cancer [13], [14]. Den aktuelle undersøgelse viste, at NFKB overekspression er nært beslægtet med CRT resistens i MIBC og at i samarbejde med erbB2 overekspression, det potentielt påvirker prognosen af ​​MIBC patienter behandlet med induktion CRT og cystektomi. Disse resultater styrker tilfældet for en formodet rolle NFKB hæmmere, hvoraf mange typer er under klinisk undersøgelse [29], at overvinde CRT modstand i MIBC overekspression NFKB.

Den aktuelle undersøgelse viser, at både erbB2 og NFKB er formodede mål for behandlinger til at overvinde CRT resistens i MIBC. Blandt de små molekyler i øjeblikket undersøgt i kliniske studier, kan varmechokprotein 90 (Hsp90) hæmmere samtidigt blokere aktiviteten af ​​begge disse oncoproteiner [31]. Hsp90 er en allestedsnærværende molekylær chaperone kræves for stabiliteten og funktion af talrige klient proteiner, herunder en række oncoproteiner væsentlige for anskaffelse og vedligeholdelse af kræft kendetegnende [31], [32], [33]. Hsp90-inhibitorer destabilisere Hsp90 kunder ved at dissociere Hsp90-Hsp90 klient komplekser og derved udøver antitumoraktivitet [34]. Da både erbB2 og hæmmer af KB-kinase β (IKKβ), der medierer NFKB aktivering, er Hsp90 klient proteiner [31], forventes supplerende anvendelse af Hsp90-inhibitorer til effektivt bevidstgøre MIBCs overeksprimerer erbB2 og /eller NFKB til CRT. Faktisk har vi bekræftet, at lavdosis Hsp90 hæmmere virkningsfuldt forstærke virkningen af ​​CRT på blære cancerceller overeksprimerer erbB2 og NFKB i prækliniske modeller [35].

I de fleste blære-besparende protokoller for MIBC, CR efter induktion CRT er en forudsætning for blære konservering; patienter med residual sygdom har større risiko for blærekræft død trods undergår bjærgning radikal cystektomi [4], [7], [26]. Dette er grunden til, at CRT resistens blev fast defineret som patologisk ikke-CR i den aktuelle undersøgelse. Når CRT resistens blev i stedet defineret som tilstedeværelse af sygdom ved patologisk stadium T2 eller større er tilbage i en cystectomy prøve, overekspression af survivin (med en afskæringsværdi på 40%) blev også identificeret som en uafhængig forudsiger af CRT modstand. Survivin, et medlem af inhibitor af apoptose protein familie, er efter sigende forbundet med lokale svigt i high-grade patienter T1 blære cancer behandlet med CRT [19]. For nylig har et lille molekyle hæmmende survivin blevet identificeret og er nu i kliniske forsøg [36]. Denne forbindelse forventes også at bevidstgøre MIBC at CRT i kliniske omgivelser.

Den aktuelle undersøgelse har nogle begrænsninger, herunder en lille kohorte størrelse, selektionsbias, og dens tilbagevirkende kraft. For præcist vurdere CRT følsomhed i cystektomi prøver fra patienter, som havde synlige tumorer før CRT, kun 35 ud af 162 patienter var berettiget til analyse. Det faktum, at statistisk signifikante resultater blev opnået på trods af sådan et lille antal forsøgspersoner kunne tilskrives den strenge udvælgelse af emner til analyse. En prospektiv undersøgelse i et større kohorte er nødvendig for at validere resultaterne opnået i den aktuelle retrospektiv undersøgelse.

Afslutningsvis erbB2 og NFKB overekspression er relevante for CRT modstand MIBC, og overekspression af mindst ét ​​af disse oncoproteiner potentielt øger risikoen for kræft død i MIBC patienter behandlet med induktion CRT og cystektomi. ErbB2 og NFKB er potentielle mål for behandling for at overvinde CRT modstand MIBC.