PLoS ONE: Hedgehog Hæmning Fremmer en Skift fra type II til type I celledød receptorsignalering i Cancer Cells

Abstrakt

TRAIL er et lovende terapeutisk middel for humane maligniteter. TRAIL kræver ofte mitokondriel dysfunktion, benævnt type II dødsreceptor pathway, at fremme cytotoksicitet. Imidlertid adskillige maligne celler er TRAIL resistente grund af hæmning af denne mitokondrie pathway. Brug af cholangiocarcinom celler som en model for TRAIL modstand, fandt vi, at hedgehog signalering blokade sensibiliseret disse cancerceller for TRAIL cytotoksicitet uafhængig af mitokondriel dysfunktion, kaldet type I dødsreceptor signalering. Denne kontakt i krav TRAIL fra type II til type I døden receptor signalering blev påvist ved den manglende funktionel afhængighed Byd /Bim og Bax /Bak, proapoptotiske komponenter i mitokondrie vej. Hedgehog signalering moduleret ekspression af X-bundet inhibitor af apoptose (XIAP), som tjener til at undertrykke type I dødsreceptor pathway. siRNA målrettet knockdown af

XIAP

efterligner sensibilisering til mitokondrier-uafhængig TRAIL drab opnås ved Hedgehog hæmning. Regulering af XIAP-ekspression ved hedgehog signalering medieres af gliom-associerede onkogen 2 (GLI2), en nedstrøms transkriptionsfaktor af Hedgehog. Som konklusion, disse data giver yderligere mekanismer modulerende celledød ved TRAIL og foreslå Hedgehog hæmning som en terapeutisk tilgang til TRAIL-resistente neoplasmer

Henvisning:. Kurita S, Mott JL, Cazanave SC, Fingas CD, Guicciardi ME, Bronk SF, et al. (2011) Hedgehog Hæmning Fremmer en Skift fra type II til type I celledød receptorsignalering i kræftceller. PLoS ONE 6 (3): e18330. doi: 10,1371 /journal.pone.0018330

Redaktør: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Januar 4, 2011; Accepteret: 25 Februar 2011; Udgivet: Marts 31, 2011

Copyright: © 2011 Kurita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health R01 Tilskud DK59427 (GJG), Division of Oncology Research, Mayo Clinic Cancer center, Mayo Clinic i bugspytkirtlen SPORE P50 CA102701, og Mayo Clinic center for cellesignalering i Gastroenterology NIDDK P30 DK084567 (MEF-Z) og Mayo Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL), en potent dødsligand, der fortrinsvis inducerer apoptose i transformerede celler, initierer signalering kaskader ved ligering to dødsreceptorer, DR4 (TNFRSF10A, også omtalt som TRAIL receptor 1) og DR5 (TNFRSF10B, også omtalt som TRAIL receptor 2 /KILLER /trick-2) [1]. TRAIL-induceret klyngedannelse og oligomerisering af DR4 og DR5 resulterer i konformationsændringer død domæner inden for deres cytoplasmatiske haler, der letter rekruttering og aktivering af caspaser 8 og 10 inden for en død inducerer signalering kompleks (DISC) [2], [3], [ ,,,0],4]. Hvis aktivering af disse initiator-caspaser er tilstrækkelig robust, de direkte aktivere caspase 3, som igen resulterer i cellulær død af den såkaldte type I død receptor pathway af apoptose [5], [6]. Men hvis omfanget af caspase 8 og 10 aktivering ikke er tilstrækkelig til direkte at aktivere caspase 3 kan TRAIL stadig inducere apoptose gennem spaltning af proapoptotiske BH3-only protein Bid at generere trunkeret Bud (tBID). tBid protein udløser mitokondriel ydre membran permeabilisering ved at fremme oligomerisering af pro-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner Bak og /eller Bax under denne membran. Mitokondriske ydre membran permeabilisering medfører udgang af pro-apoptotiske proteiner fra den mitokondriske intermembrane rum (dvs. cytochrom c, Smac /DIABLO, HtrA2, AIF, og endonuklease G), som kulminerer i den mitokondriske pathway af apoptose [7], [8 ]; afhængigheden af ​​mitokondriel dysfunktion for celledød betegnes som type II død receptor pathway af apoptose [6]. Type I død receptor signalering ser ud til at blive reguleret på niveauet for caspase-3-aktivering, hvorimod type II død receptorsignalering reguleres på niveauet for mitokondrier af medlemmer af den antiapoptotisk Bcl-2-protein familien [7], [8], [ ,,,0],9], [10]. TRAIL sædvanligvis signalerer gennem type II, mitokondrier-afhængige vej [11], en vej som ofte inhiberet i cancere resulterer i TRAIL resistens [12], [13].

Heri påviser vi, at inhibering af onkogen Hedgehog pathway undertrykker udtryk for XIAP og sensibiliserer kræftceller til TRAIL cytotoksicitet, hjælp cholangiocarcinom celler som en model til at studere TRAIL modstand. Disse cancerceller rigeligt udtrykker anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner, især MCL-1, hvilket medierer TRAIL resistens [14], [15]. MCL-1 hæmning af mitokondrier vej af celledød er især relevant for cholangiocarcinoma celler som de paradoksalt nok udtrykker TRAIL

in vivo

, og sandsynligvis skal løbende omgå TRAIL cytotoksisk signalering for overlevelse [16]. I betragtning af den spirende data implicerer onkogenisk Hedgehog signalering i gastrointestinal tumor biologi [17], [18], vi udforsket Hedgehog signalering som en mekanisme bidrager til TRAIL modstand ved kræftceller. Vi har tidligere rapporteret, at pindsvineoverføringsvejen er konstitutivt aktiv i disse celler, og at dets inhibering sensibiliserer cholangiocarcinom celler til TRAIL cytotoksicitet sammenfaldende med opregulering af TRAIL receptor DR4 [19]. Det var imidlertid uklart, hvordan opregulering af DR4 alene kunne overvinde MCL-1 blokade af det mitokondrielle pathway af apoptose. I denne undersøgelse har vi vist, at nedregulering af XIAP af Hedgehog inhibering omdanner type II TRAIL signalering til et type I-vejen. Således er vores data definere en mekanisme, ved hvilken Hedgehog signalering modulerer TRAIL-induceret celledød i cancerceller og foreslå inhibering af dette kaskade som potentiel terapeutisk tilgang til TRAIL-resistente neoplasmaer ..

Materialer og Metoder

Etik Statement

The Mayo Clinic IRB Udvalg og godkendt for humane studier af protokollen med titlen “genom udtryk analyse af menneskelig kolangiokarcinom (CCC).” Udvalget fastslog, at dette udgør minimal risiko forskning. Data blev analyseret anonymt.

Cell Kultur

menneskelige cholangiocarcinom cellelinjer, KMCH, HuCCT-1, og Mz-cha-1, blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100.000 enheder /i penicillin, 100 mg /L streptomycin og 100 mg /l gentamicin som tidligere beskrevet [20], [21].

Kvantitativ revers-transkription-polymerase-kædereaktion (RT- PCR)

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og cDNA blev fremstillet under anvendelse af tilfældige primere og Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase som tidligere beskrevet detaljeret [22]. CDNA produkt blev amplificeret ved PCR med Taq-DNA-polymerase under anvendelse af standardprotokoller. PCR-primere er vist i tabel 1. Primere til 18S ribosomal RNA (rRNA) blev indkøbt fra Ambion Inc. (Austin, TX). Real-time PCR blev udført med Roche LightCycler hjælp SYBR green som fluorophoren som tidligere beskrevet [20]. Kopiantallet af mål-mRNA’et i hver prøve blev normaliseret som en procent med kopiantallet for 18S rRNA i nævneren.

immunoblotanalyse Salg

helcellelysater blev opnået som tidligere beskrevet af os i detaljer [21]. Proteinprøver blev adskilt ved SDS-PAGE-geler, overført til nitrocellulosemembraner, og blottet med de angivne primære antistoffer ved en fortynding på 1: 500 til 1: 1.000. Peroxidasekonjugerede sekundære antistoffer (Biosource International, Camarillo, CA) blev inkuberet ved en fortynding på 1: 3.000 til 1: 5.000. Bundne antistoffer blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens reagenser (Amersham, Arlington Heights, IL) og Kodak X-OMAT film (Eastman Kodak, Rochester, NY). Primære antisera blev sådanne som er tiltrukket til actin, Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, og Smoothened (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien: C11, B19, S18, S19, og H-300, henholdsvis), Bud og CIAP-1 (R

Bax,

5′-AAG ACG AAC TGG ACA GTA ACA FTT GTC TC-3 ‘(delvis T7-promoter sekvens er fed). Som en kontrol blev celler transficeret med en kodet RNA duplex med følgende sekvens: 5’-AAC GTG ATT TAT GTC ACC AGA-3 ‘. Kort fortalt blev celler dyrket i 6-brønds skåle blev transient transficeret med 30 nM siRNA anvendelse af 5 pi /mL siPORT

TM NeoFX

TM (Ambion Inc.). Target proteinekspression blev vurderet ved immunoblotanalyse efter transfektion med siRNA.

Kort hårnål RNA (shRNA) for Bid var fra Sigma Aldrich [MISSION kort hårnål RNA lentiviral plasmid, rettet nukleotider 376-396, Genebank tiltrædelse # NM_001196 ]. For at generere Bim målrettet shRNA konstrukt blev pSSH1 plasmid indeholdende det humane H1-promotoren til ekspression af shRNA anvendes. Et dobbeltstrenget DNA-skabelon (5′-GAT CCC CGC AAT AGG CTT TAG GAA AAT TCA AGA GAT TTT CCT AAA GCC TAT TGC TTT TTG GAA A-3 ‘) blev indsat i pSSH1 plasmidet efter H1 RNA promotoren. DNA insert indeholder mening og antisense-sekvenser (Fed type) for Bim mRNA og en 9-nukleotid linker sekvens, hvilket giver transskription af en shRNA målrettet Bim. For stabil transfektion blev KMCH celler transficeret under anvendelse OPTI-MEM I (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende 5 pi /mL LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), og 3 ug /ml plasmid-DNA. Otteogfyrre timer efter transfektion blev frisk medium indeholdende 2 ug /ml puromycin tilsat for shRNA plasmid målretning bud eller 1,2 g /l neomycin blev tilsat for shRNA plasmid målretning Bim. Overlevende kloner blev separeret ved anvendelse af kloningsringe og blev individuelt dyrket. Lentivirale partikler indeholdende shRNA til SMO blev konstrueret under anvendelse af BLOCK-iT Inducerbar H1 Lentiviral RNAi System (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol. Sekvenser (indsat i pLenti4 /BLOCK-iT-DEST) blev afbildet som tidligere beskrevet af os [19]. For stabil transfektion, frisk medium indeholdende 10 ug /ml Blasticidine-S og 500 ug /ml Zeocin (Invitrogen) blev tilsat til cellerne 48 timer efter transduktion. Overlevende kloner blev separeret ved anvendelse af kloningsringe og blev individuelt dyrket. Ekspression blev induceret med 1 mg /ml tetracyclin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Efter yderligere 48 timer blev celler anvendt til eksperimenter. Target suppression blev vurderet ved immunoblotanalyse.

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

Nuclear celleekstrakter blev fremstillet ved anvendelse NE-PER nukleare og cytoplasmiske udvinding reagenser (Pierce, Rockford, IL) ifølge producentens anvisninger. For EMSA, blev 20 ug kerneproteiner inkuberet ved stuetemperatur i 20 minutter i bindingsbuffer (25 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM EDTA, 6% glycerol, 0,1% Triton X-100, 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid fluorid, 0,4 mM dithiothreitol, 0,5 ug /uL poly (dI-dC), 0,5 ng /nl laksesperma) med 0,04 pmol Cy5.5-mærkede dobbeltstrengede DNA-oligonukleotid (syntetiseret ved Mayo Clinic Advanced Genomics Technology Core, Rochester MN) indeholdende vildtype formodede GLI-bindende sekvenser i promotorområdet af human

XIAP

gen. Protein-DNA-komplekserne blev separeret fra det ubundne DNA-probe ved elektroforese gennem 5% native polyacrylamidgeler indeholdende 0,5X Tris borat-EDTA. Fluorescens blev visualiseret direkte på gelen under anvendelse af en Odyssey fluorescerende imager (Licor Biosciences, Lincoln, NE). For kompetitive assays blev et 200 gange molært overskud af umærket dobbeltstrenget oligonukleotid tilsat til reaktionsblandingen 20 min før tilsætningen af ​​den fluorescerende probe.

chromatin immunoprecipitation

Chippen blev udført fra KMCH celler behandlet med 250 nM rekombinant Sonic Hedgehog i 5 timer ved hjælp af total cellulært DNA klippet til ~500 bp fragmenter, hjælp ExactaCHIP kromatin immunoprecipitation kit (R Rev:. 5 ‘CATCTCTCCATGCTCTGAACTC

Statistisk analyse

Alle data repræsenterer mindst tre uafhængige forsøg og er udtrykt som gennemsnit ± SE. Forskelle mellem grupper blev sammenlignet ved hjælp af ANOVA med Bonferroni post hoc korrektion

Materialer

Reagenser blev købt fra følgende leverandører:. DAPI var fra Sigma; rekombinant humant TRAIL og rekombinant Sonic Hedgehog var fra R anti-humant Fas-antistof (CH-11) var fra MBL International (Nagoya, Japan); cyclopamin var fra LC Laboratories (Woburn, MA).

Resultater

Smoothened hæmning nedregulerer CIAP-1 og XIAP udtryk

Givet en central mekanistisk rolle for inhibitor af apoptose proteiner (IAP) i døden receptorsignalering [23] og den rolle Hedgehog i cellulær overlevelse, vi først fastslået, hvorvidt inhibere Smoothened (SMO), signaleringen komponent af Hedgehog receptorkomplekset, modulerer ekspression af IAP. Behandling med cyclopamin, et veletableret farmakologisk inhibitor af SMO [24], [25], nedsat cellulær IAP-1 (CIAP-1) og X-bundet IAP (XIAP) proteinniveauer, men havde ingen virkning på CIAP-2-protein udtryk. Den nedregulering af XIAP var hurtigere, forekommer inden for 4 timer, mens tab af CIAP-1 protein skete først efter 24 timer (Fig. 1A). Den farmakologiske virkning af cyclopamin blev valideret ved anvendelse shRNA målrettet knockdown af SMO, en signalering komponent af Hedgehog receptoren, hvilket også faldet både CIAP-1 og XIAP cellulære proteinniveauer, men ikke CIAP-2 (fig. 1B). At afgøre, om SMO hæmning påvirket mRNA-niveauer eller handlet udelukkende post-transkriptionelt,

CIAP-1

,

CIAP-2

, og

bestemtes XIAP

mRNA-ekspression efter cyclopaminbehandling eller shRNA at SMO. Begge

XIAP

CIAP-1

mRNA niveauer blev reduceret med SMO hæmning (fig. 1C). Den kliniske relevans af IAP forordning blev vurderet i tumor og tilstødende godartede prøver fra patienter med cholangiocarcinoma. En to-fold stigning i

XIAP

mRNA-niveauer blev observeret i tumorvæv (fig. 1D). Niveauerne af

CIAP-1

og

-2

var ikke signifikant forskellige. Det

CIAP-1

ikke forhøjet i tumorprøver trods regulering af Hedgehog (Fig. 1C) kan indikere yderligere som-endnu-ukendte faktorer bidrager også til styring af IAP udtryk i tumoren. Disse data tyder på Hedgehog signalvejen regulerer

CIAP-1

og

XIAP

udtryk, men at kun

XIAP

niveauer er forhøjede i kliniske prøver. Derfor er vi i høj grad fokuseret på

XIAP

for resten af ​​vores studier.

A,

Cellelysater fra KMCH celler behandlet med cyclopamin (5 uM) for de angivne tidspunkter blev immunblottet for CIAP-1, CIAP-2 og XIAP. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

B,

KMCH celler blev transficeret med en tetracyklin-inducerbare shRNA ekspressionsvektor målretning Smoothened (shSMO) eller en kodet shRNA vektor; shRNA blev induceret i 48 timer ved behandling med tetracyclin (1 mg /ml) efterfulgt af immunoblotting for CIAP-1, CIAP-2 og XIAP anvendelse af hele cellelysater.

C

, Cellerne blev behandlet med køretøj, cyclopamin (5 uM) i 24 timer, eller transficeret med shSMO som i panel

B,

derefter analyseret ved real-time RT-PCR for

CIAP-1

,

CIAP-2

og

XIAP

hjælp total RNA.

D

, Total RNA fra vævsprøver af enten cholangiocarcinom (CCA) eller tilgrænsende godartet lever blev anvendt til at vurdere

XIAP, CIAP-1, og CIAP-2

mRNA-ekspression, normaliseret til 18S og udtrykt som fold ændring fra godartede. Middelværdi ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 sammenlignet med køretøj

GLI2 binder sig til

XIAP

promotor og regulerer dens udtryk

For at afgøre, om

XIAP

transkriptionelt reguleret af Hedgehog-responsive GLI transkriptionsfaktorer, vi søgte 5 Kb 5′-flankerende region af det humane

XIAP

gen for det 5′

GACCACCCAXXXXG

-3 ‘GLI konsensus bindende motiv. To lovende, potentielle GLI-bindingssteder (fig. 2A) blev identificeret opstrøms af

XIAP

transkriptionsstartsitet (NM_001167) ved positionerne -2820 /-2807 (site I) og -1594 /-1581 (site II ). Hver havde to fejlparringer i forhold til konsensussekvensen [26]; Sted I er identisk med den validerede 9-nukleotid Bcl-2 GLI-bindingssted, BS1 [27], mens sted II er identisk med den bekræftede DR4 GLI-bindingssted [19]. Vi udførte elektroforetisk mobilitet shift assay eksperimenter. Binding til både formodede GLI bindende sekvenser blev observeret i nukleare ekstrakter fra KMCH celler. Mobilitet skift af CY 5,5-mærket probe kunne forhindres ved tilsætning af et 200-fold molært overskud af umærket probe (konkurrent. Figur 2B). Af de tre GLI familiemedlemmer, siRNA til GLI2 forårsagede et signifikant fald i XIAP-proteinekspression mens siRNA til GLI1 eller GLI3 ændrede ikke XIAP niveauer (Fig. 2C). For at konstatere, om GLIS binder til

XIAP

promotor, vi udførte kromatin immunopræcipitationsforsøg at vurdere besættelse af det endogene

XIAP

promotor ved hjælp af antistoffer mod GLI1, GLI2, og GLI3. Binding af GLI2 blev observeret ved anvendelse af primere, der amplificerer site I (fig. 2D). Kontrol IgG gav ikke et produkt, der viser specificitet antisera anvendt og positiv-kontrol promoter sites viste den forventede besættelse GLI1 og GLI2 (

Bcl-2

promotor), og GLI3 (

GLI1

promotor). Disse data tyder på, at Hedgehog direkte regulerer

XIAP

udtryk ved GLI2 transskriptionsfaktorbindende til Site I i

XIAP

promotor.

A,

Formodede GLI bindingssteder i XIAP promotorregionen. Nukleotidpositioner blev talt fra transkriptionsstartstedet (TSS). Potentielle bindingssteder blev observeret som angivet ved pile på den skematiske (I og II).

B,

nukleare proteinekstrakter blev isoleret fra KMCH celler. EMSA blev udført under anvendelse Cy5.5-mærkede dobbeltstrengede oligonukleotider indeholdende de formodede GLI bindingssekvenser i det menneskelige XIAP promotor og konkurrence-forsøg med 200 gange molært overskud koldt oligonukleotider som beskrevet under “Materialer og metoder”.

C

, Totalt cellulært protein blev isoleret 48 timer efter transient transfektion med det anførte siRNA mod GLI familiemedlemmer. XIAP-protein-ekspression blev bestemt ved immunoblotting og signalet blev kvantificeret ved densitometri i forhold til actin ekspression.

D,

kromatin immunofældning hjælp antiserum til GLI1, GLI2, GLI3, eller en kontrol IgG blev udført efterfulgt af PCR ved anvendelse af primere flankerer websted I (341 bp) i

XIAP

promoter region, som angivet. Som en positiv kontrol blev ChIP udført under anvendelse af primere, der flankerer

Bcl-2

promotor GLI-bindingssted (GLI1 og GLI2), eller primere flankerer GLI3 bindende sted inden i

GLI1

promotor.

Sensibilisering af Hedgehog hæmning er uafhængig af mitokondrie apoptotiske mediatorer, Bud /Bim eller Bax /Bak

XIAP er en vigtig diskriminator til konvertering type II til type i døden receptor signalering [9 ], således, overvejede vi tab af XIAP protein som en mekanisme, hvormed Hedgehog hæmning sensibiliserede cholangiocarcinom celler til Trail-induceret apoptose. Byd og Bim er centrale signalering mellemprodukter i type II proapoptotiske død receptor signalering [28], [29]. Baseret på denne information, vi næste konstateret hvis Hedgehog hæmning sensibiliserede celler til TRAIL cytotoksicitet i fravær af bud eller Bim. shRNA konstruktioner målrettet bud og Bim effektivt slået ned de respektive cellulære protein niveauer (fig. 3A). Den næsten fuldstændige lyddæmpning af Bid eller Bim protein niveauer blev funktionelt bekræftet ved at udnytte den iagttagelse, at Fas Type II død receptor signalering er afhængig Byd eller Bim [30]. Faktisk Bid eller Bim knockdown var tilstrækkelig til at inhibere Fas-induceret celledød ved det agonistiske antistof CH-11 (fig. 3B og 3C), en klassisk type II pathway af celledød [31]. Hvis således TRAIL-induceret celledød i cyclopaminbehandlede sensibiliserede celler var afhængig af type II-signalering, derefter byde eller Bim dæmpning bør ligeledes beskytte mod TRAIL cytotoksicitet. Men på trods af fraværet af bud eller Bim, the Hedgehog inhibitor cyclopamin stadig sensibiliserede humane cholangiocarcinom celler til TRAIL-induceret celledød (fig. 3D og 3E).

A,

Immunblotanalyse blev udført på helcellelysater opnået fra KMCH celler stabilt transficeret med det specifikke shRNA rettet mod

Byd

eller

Bim,

hjælp indikerede antisera. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

B

, KMCH celler stabilt transficeret med bid-eller Bim-shRNA og utransficerede parentale KMCH celler blev behandlet med Fas agonistisk antistof CH-11 (100 ug /ml) i 5 timer efterfulgt af DAPI-farvning. Celler med apoptotisk morfologi blev talt. Middelværdi ± SEM, *** p 0,001 sammenlignet med parentale celler behandlet med CH-11.

C,

Samtidig caspase-3/7 aktivitet blev målt i celler behandlet som i panel

B

. Middelværdi ± SEM, *** p 0,001.

D

blev KMCH celler stabilt transficeret med bid-eller Bim-shRNA forbehandlet med vehikel eller cyclopamin (5 uM) i 24 timer og derefter behandlet med TRAIL (5 ng /ml) i 5 timer efterfulgt af DAPI farvning. Celler med apoptotisk morfologi blev talt. Middelværdi ± SEM, *** p 0,001 sammenlignet med celler behandlet med TRAIL alene.

E

blev KMCH stabile cellelinjer behandles som i panel

D

, og efter 5 timer caspase-3/7 aktivitet blev målt. Middelværdi ± SEM, *** p 0,001 sammenlignet med celler behandlet med TRAIL alene.

F

, Helcellelysater fra KMCH, HuCCT-1, og Mz-Cha-1-celler behandlet med vehikel eller cyclopamin (5 uM) i 24 timer blev analyseret ved immunblot under anvendelse af anti-Bcl-2, Mcl- 1, eller Bcl-x-antisera. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

G

blev Helcellelysater opnået fra shBid-, shBim- og utransficerede parentale KMCH celler behandlet med vehikel eller cyclopamin (5 uM) i 24 timer og blev analyseret ved immunblot under anvendelse af anti-Bcl-2, Mcl- 1, eller Bcl-x-antisera. Actin blev brugt som en belastning kontrol.

Fordi en ubalance mellem anti- og proapoptotiske Bcl-2 familie proteiner ved cyclopamin kunne forklare dens virkninger på sensibiliserende celler til TRAIL drab, vi profileret denne klasse af proteiner ved immunoblotanalyse. Bcl-x

L-protein ekspression var signifikant lavere i KMCH celler end HuCCT-1 eller Mz-Cha-1-celler, men ingen af ​​de tre antiapoptotiske proteiner (Bcl-2, MCL-1, eller bcl-x

L) blev ændret af cyclopaminbehandling (fig. 3F). Cyclopamin heller ikke ændre cellulære protein niveauer af anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner i KMCH celler stabilt transficeret med shRNA målretning Bud eller Bim (fig. 3G). Ligeledes har SMO inhibering ikke ændre eneste BH3-proteiner eller pro-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner, Bax og Bak [19]. Taget sammen antyder disse data, at inhibering af pindsvineoverføringsvejen sensibiliserer humane cholangiocarcinom celler til TRAIL cytotoksicitet ved en fremgangsmåde uafhængig af Bid eller Bim eller ændringer i ekspressionen af ​​multidomain Bcl-2 familie-proteiner. Uafhængighed Byd eller Bim foreslog spændende mulighed, at cyclopamin kan bevidstgøre cholangiocarcinom celler til TRAIL ved at konvertere apoptotisk signalering fra en type II til type I død receptor vej.

For at teste denne hypotese, vi næste afgøres, om Hedgehog hæmning konverterer Type II død receptor signalering til Type i signalering. Den forudsætning for type I død receptor signalering er dens manglende afhængighed af Bax og Bak [32]. Effektiv knockdown af Bax og Bak-proteinniveauer blev opnået ved siRNA rettet mod (fig. 4A). Målrettet knockdown af Bax plus Bak-protein fungerede at inhibere Fas-medieret apoptose med CH-11 (fig. 4B og 4C), i overensstemmelse med type II signalering. TRAIL alene havde en lille apoptotisk virkning på KMCH celler, som blev effektivt blokeret af Bax /Bak lyddæmpning, hvilket indikerer, at TRAIL normalt dræber cholangiocarcinom celler ved type II-vejen (fig. 4D). Imidlertid blev TRAIL-induceret apoptose dramatisk forøget med cyclopamin (fig. 4D og 4E). Den øgede apoptose var fuldstændig (fig. 4E) eller næsten fuldstændigt (fig. 4D) ufølsomt for Bax /Bak nedregulering. Disse data antyder, at Hedgehog inhibering omgår mitokondrie modstand mod TRAIL cytotoksicitet ved at konvertere en type II-signalering til en type I-signalvejen.

A, Salg Helcellelysater fra KMCH celler transient transficeret med specifikke siRNA målretning Bax og /eller Bak eller krypterede siRNA blev opnået 48 timer efter transfektion og analyseret ved immunblot under anvendelse af anti-Bax eller anti-Bak antisera. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

B

, KMCH celler transient transficeret med Bax- og Bak-siRNA eller krypterede siRNA blev forbehandlet (24 timer) med medium eller cyclopamin (5 uM) som angivet, derefter behandlet med Fas agonistisk antistof CH-11 (100 ug /ml) i 5 timer. Celler med apoptotisk cellekernemorfologi blev talt. Gennemsnit +/- SEM; *** P 0,001.

C,

KMCH celler blev behandlet som i panel

B

og caspase-3/7 aktivitet blev målt efter 5 timer. Gennemsnit +/- SEM; *** P 0,001

D

blev KMCH celler transient transficeret med Bax- og Bak-siRNA eller krypterede siRNA forbehandlet med vehikel eller cyclopamin (5 uM) i 24 timer og derefter behandlet med TRAIL (5 ng /ml) i 5 timer. Celler med apoptotisk cellekernemorfologi blev talt. Middelværdi ± SEM, # p 0,05 og *** p 0,001 sammenlignet med celler transficeret med scrambled siRNA og behandlet med TRAIL.

E

, KMCH celler forbigående transficeret med angivet siRNA og behandles som i panel

D

, blev analyseret efter 5 timer for caspase-3/7 aktivitet. Middelværdi ± SEM; *** P. 0,001

Knockdown af

XIAP

sensibiliserede cholangiocarcinom celler til TRAIL-induceret apoptose trods hæmning af Bid

Dernæst vi bestemt den funktionelle relevans af XIAP udtryk i disse cancerceller ved hjælp siRNA målrettet knockdown af

CIAP-1

eller

XIAP.

Effektiv målretning af CIAP-1 og XIAP proteinekspression blev bekræftet ved immunoblotanalyse (fig. 5A ). I overensstemmelse med tidligere rapporter [33], [34], [35], [36], knockdown af

XIAP

betydeligt sensibiliserede cellerne til TRAIL cytotoksicitet, mens knockdown af

CIAP-1 kun

beskedent sensibiliserede cellerne til TRAIL-induceret celledød, målt enten morfologisk (fig. 5B) eller biokemisk (fig. 5C). Således reguleringen af ​​XIAP udtryk er en potentiel mekanisme, hvormed Hedgehog signalering forhindrer TRAIL cytotoksicitet.

KMCH celler blev transficeret med røræg siRNA eller specifik siRNA for

CIAP-1

eller

XIAP

.

En

, Helcellelysater blev forberedt immunblotting fra KMCH celler 48 timer efter siRNA transfektion.

B

, Otteogfyrre timer efter transfektion som i panel

A

, celler blev behandlet med human rekombinant TRAIL (5 ng /ml) eller medium i 5 timer. Cellerne blev derefter farvet med DAPI og celler med apoptotisk nukleare morfologi blev talt og udtrykt som en procentdel af de samlede kerner.

C,

Parallelt celler blev transficeret og behandlet med TRAIL som i panel

B

, og efter 5 timer caspase-3/7-aktivitet blev målt. Middelværdi ± SEM, * p 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001

Ovenstående data er i overensstemmelse med et skift fra type II til type I receptor-medieret apoptose af SMO hæmning; SMO hæmning synes at mægle denne kontakt ved at nedregulere

XIAP

genekspression. For at teste denne fortolkning af dataene, vi designet eksperimenter for at konstatere, om knockdown af XIAP-protein var tilstrækkelig til at omdanne TRAIL signalering til en mitokondrier-uafhængig, Type I-vejen. Vi ansat en lille molekyle hæmmer af Bid, BI-6C9, at omgå mitokondrier-afhængig celledød [37]. For det første at bekræfte, at BI-6C9 funktionelt hæmmede celledød i dette system, KMCH celler blev forbehandlet med BI-6C9 eller køretøj (DMSO), efterfulgt af Fas agonistisk antistof. Faktisk farmakologiske hæmning af Bid af BI-6C9 var tilstrækkelig til at undertrykke Fas-induceret apoptose. Igen havde SMO inhibering ikke påvirke apoptose med CH-11 behandling (fig. 6A). I modsætning hertil BI-6C9 ikke funktionelt inhiberer TRAIL-induceret celledød i cyclopaminbehandlede celler (Fig. 6B). Vigtigere er det, siRNA rettet mod XIAP også sensibiliserede celler til TRAIL-induceret apoptose, og BI-6C9 ikke afbøde celledød (fig. 6C). Således SMO inhibering, ved at nedsætte cellulære XIAP proteinniveauer, konverterer Type II TRAIL død receptorsignalering en type I-vejen; en effekt sammenfattet af siRNA målrettet knockdown af

XIAP

.

A,

KMCH celler blev inkuberet i 24 timer i medium eller cyclopamin (5 uM) efterfulgt af behandling med enten vehikel (DMSO, slutkoncentration 0,1% volumen /volumen) eller den Bid-inhibitoren, BI-6C9 (10 uM) i 1 time.