PLoS ONE: Operatør Afhængig Valg af prostatakræft Biopsi Har begrænset indvirkning på en Gene Signatur Analyse for de Highly udtrykte gener IGFBP3 og F3 i prostatakræft epithelial Cells

Abstrakt

Baggrund

Forudsigelse af prognose for prostatakræft sygdom via genekspression analyse modtager stigende interesse. I mange tilfælde er sådanne analyser baseret på formalin-fikseret, paraffin indstøbt (FFPE) kerne nål biopsi materiale, som Gleason Vurdering af diagnose er blevet udført. Da hver patient har typisk flere biopsiprøver, og siden Gleason sortering er en operatør afhængig procedure kendt for at være vanskelig, blev virkningen af ​​operatørens valg af biopsi evalueret.

Metoder

Flere biopsiprøver fra 43 patienter blev vurderet ved anvendelse af en tidligere rapporteret gen underskrift IGFBP3, F3 og VGLL3 med potentiel prognostisk værdi som grundlag samlet overlevelse ved diagnose af prostatacancer. En fire multipleks ettrins QRT-PCR test kit, designet og optimeret til måling af signaturen i FFPE core needle biopsiprøver blev anvendt. Overensstemmelse af genekspression niveauer mellem primære og sekundære Gleason tumor mønstre, såvel som godartede vævsprøver, blev analyseret.

Resultater

De genekspression niveauer af IGFBP3 og F3 i prostatakræft epitelial celle- indeholder væv, der repræsenterer den primære og sekundære Gleason mønstre var høje og konsekvent, mens den lave udtrykte VGLL3 viste mere variation i sit udtryk niveauer.

Konklusion

vurderingen af ​​IGFBP3 og F3 genekspression niveauer i prostatakræft væv er uafhængig af Gleason mønstre, hvilket betyder, at virkningen af ​​operatørens valg af biopsi er lav

Henvisning:. Peng Z, Andersson K, Lindholm J, Bodin i, Pramana S, Pawitan Y, et al. (2014) Operatør Afhængig Valg af prostatakræft Biopsi Har begrænset indvirkning på en Gene Signatur Analyse for de Highly udtrykte gener IGFBP3 og F3 i prostatakræft epitelceller. PLoS ONE 9 (10): e109610. doi: 10,1371 /journal.pone.0109610

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 4, 2014, Accepteret: September 1, 2014; Udgivet: 8 oktober 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information fil

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Uppsala Bio (https://www.uppsalabio.com/), den svenske Cancer Society (http: //www.cancerfonden.se/sv/Information-in-English/), King Gustaf V Jubilee Foundation (https://www.rahfo.se/Metamenyn/In-English/), og Stockholms amtsrådet (http: //www.sll.se/om-landstinget/Information-in-English1/). De finansieringskilder ydet støtte i form af løn til Zhuochun Peng, Karolinska Institutet, men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser: Dr. Chunde Li er en af ​​medstifterne, aktionær og næstformand for bestyrelsen af ​​Chundsell Medicals AB, en start-up virksomhed sigter mod at udvikle en Prostatype ® QRT-PCR kit baseret på det tidligere rapporterede signatur undersøgelse nævnt i Referencer. Han er også en af ​​opfinderne af svensk patent (SE 536.352), der ejes af Chundsell Medicals AB. Zhuochun Peng arbejder som videnskabelig konsulent og produktchef for Chundsell Medicals AB, ud over at være aktionær. Hun er også en af ​​opfinderne af en svensk patentansøgning (SE 536.352), der ejes af Chundsell Medicals AB. Karl Andersson arbejder som statistik konsulent for Chundsell Medicals AB. Han er tilknyttet Ridgeview Instruments AB, som er en kontraktlig udvikler for Chundsell Medicals AB. Den ovenfor beskrevne konkurrerende interesse ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Forudsigelse prognosen for kræft sygdom ved hjælp af genekspression analyse er en metode rapporteret i et stigende antal undersøgelser [1]. For mange kræftdiagnoser, en bekvem og tilgængelig prøvetype er formalin fast paraffin indstøbt (FFPE) materiale fra enten biopsi materiale eller kirurgisk fjernet tumorvæv. For prostatakræft (PCA), FFPE biopsier er let tilgængelige i de kliniske rutinemæssige patologilaboratorier og egnede til sådanne analyser. Men i mange tilfælde flere biopsier er tilgængelige for hver patient, og genekspression analyse udføres normalt på kun én prøve pr patient. Det betyder, at patologen har at vælge, hvilken biopsi at analysere.

Gleason Score (GS) klassificering system er den dominerende histopatologisk klassificeringsmetode for prostata karcinom hele verden, både i forskning og i klinisk rutine. Gleason score er summen af ​​Gleason kvaliteter af de mest almindelige og den anden mest almindelige tumor mønstre. GS er en af ​​de vigtigste kliniske parametre til angivelse prognosen for overlevelse for patienter med prostatacancer. Der er dog en stor gråzone i GS 7 i form af overlevelse forskelle: for eksempel patienter med GS 3 + 4 har en langt bedre prognose end patienter med GS 4 + 3 [2]. Det er et almindeligt bemærket, at Gleason sortering, selv når evalueret af faglærte patologer, er en operatør afhængig metode. Dette fører til risiko for rapportering ikke-overensstemmende resultater på samme tumor materiale, især når diskriminere 3 + 4 fra 4 + 3 [3]. Denne type operatør afhængighed kan have en indvirkning på genekspression analyse.

En nylig rapport fra vores laboratorium viste, at en genekspression underskrift IGFBP3, F3 og VGLL3 kunne estimere prostata kræftpatienters samlet overlevelse på tidspunktet for diagnose [4]. De tre gener blev udvalgt på en trinvis måde ud fra et udgangsmateriale sæt af 641 stamcelletransplanterede gen prædiktorer. Derfor denne signatur potentielt fanger stamceller tilbøjelighed eller “stemness ‘af kræftceller uafhængige af histopatologiske subtype [4]. Det blev vurderet på en svensk kohorte af 189 PCA patienter diagnosticeret mellem 1986 og 2001 med næsten afsluttet opfølgende overordnede overlevelsesdata. I denne kohorte var 78% af patienterne primært kun behandlet med hormonbehandling. Den genekspression signatur blev vist tilstrækkeligt til at kategorisere patienter i høj risiko, mellemliggende risiko og lav risiko undertyper.

IGFBP3 blev F3 og VGLL3 gen signatur identificeret ved hjælp finnålsaspiration (FNA) cytologiske prøver . Den nuværende klinisk praksis for prostatakræft diagnose er at bruge FFPE kerne nål biopsi prøver. En fordel ved FFPE prøver er, at de let kan arkiveres, og at mange årgange har lang tid opfølgende kliniske data, hvilket i høj grad letter kliniske studier. Selvom det ekstraherede RNA fra FFPE prøver kan være af relativ lav kvalitet, har flere nylige undersøgelser vist lovende resultater ved anvendelse af nedbrudt RNA ekstraheret fra arkivering FFPE prøver til kvantificering genekspressionsniveauer ved optimerede QRT-PCR-fremgangsmåder [5] – [7]. Et eksempel er den Prostatype QRT-PCR kit, som er udviklet og optimeret til måling af genekspressionsniveauer af et gen underskrift IGFBP3, F3 og VGLL3 især i FFPE prøver.

I analysen af ​​RNA ekspressionsniveauer i FFPE biopsiprøver, er der en lang række faktorer, der har indflydelse på resultaterne. Hver biopsi har en anden del af tumor materiale og opbevaringsforholdene kan have påvirket RNA kvalitet på forskellige måder. Til dette er der en række faktorer i den analytiske procedure, der vil fremkalde variation, således at RNA-ekstraktion effektivitet, pipetteringsfejl, stabilitet reagens over tid, urenheder, forurening og så videre.

I lyset af den variabilitet og operatør afhængighed af Gleason score ranking, undersøgte vi ekspressionsniveauet for IGFBP3, F3 og VGLL3 i multiple biopsier fra den samme patient, og fokuserede på variationen i forbindelse med meget valg af hvilken biopsi, der skal analyseres. Dette gjorde det muligt at vurdere virkningen af ​​operatørens valg af prøve på det målte genekspression niveau.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Research etiske komité af Karolinska Universitetshospital (autorisationsnummer: 00-164) og blev udført i overensstemmelse med de etiske principper, der er beskrevet i 1964-erklæringen af ​​Helsinki

informeret skriftligt samtykke til generel bio-bank materiale samling. blev opnået fra alle deltagere i henhold til den svenske bio-bank lov, før deres optagelse i undersøgelsen.

FFPE prostata kerne nål biopsier

de FFPE prostata kerne nål biopsi prøver blev indsamlet i tid af PCa diagnose ifølge den rutinemæssige procedure, der anvendes hos Aleris diagnostik AB (Aleris Medilab) i Stockholm, Sverige. For hver patient blev 6-10 nålebiopsier tages for Gleason grading [2]. Biopsier fra 43 patienter diagnosticeret med PSA mellem 2004-2007 hvor der anvendes til denne undersøgelse. Indtil udgangen af ​​2013, 22 af disse patienter var døde af PCa, 10 var døde af andre sygdomme og 11 stadig var i live. Alle biopsier havde været opbevaret i Aleris Medilab biobank facilitet på betingelser egnet til FFPE prøver i mindst 6 år før brug i denne analyse.

prøveforberedelse og RNA-ekstraktion

Prøven forberedelsesprocessen forud til RNA ekstraktion beskrevet trin for trin som følger

trin a:.. Sektionsinddeling af FFPE prøver

FFPE kerne nål biopsier blev skåret i separate sektioner og blev fastgjort på matteret objektglas væsentlige i overensstemmelse med rutinemæssige histopatologiske protokoller [8], bortset fra, at DNase /RNase-frit vand blev anvendt og trinnet med smeltning paraffin efter tørresektioner blev udeladt. Den første kvalificerede sektion af 5 um tykkelse var H . E farvede glas dias som et kort, de tilsvarende områder af ufarvede 10 um tykke FFPE sektioner blev identificeret. For hver Gleason mønster, et areal på mindst 10 mm

2 kræft celle, der indeholder væv blev skrabet ind DNase /RNase fri mikro centrifugerør ved hjælp af en ny engangs skalpel for hver prøve, der skal udvindes. De fleste af skrabet prøver indeholdt mere end 70% kræft epitelceller.

Sample målinger

For hver prøve måling, tumor materiale fra én type patologisk mønster (Gleason tumor mønster eller godartet mønster) blev indsamlet, undertiden fra forskellige biopsier fra den samme patient, til et hætteglas til yderligere analyse. Det betyder, at patologer indsamlet cancer områder med samme histopatologiske type celler fra et eller flere biopsier at høste tilstrækkeligt væv til den analytiske metode. Procentdelen af ​​tumor materiale i hvert cancer celle indeholdende prøve blev evalueret og bekræftet af patologer ved hjælp digitalt scannede billeder af H 0,37; 2,61 /0,71, og for VGLL3, de var 5,12; 0,36; 5,91 /3,76. Baseret på dette, at den typiske variation af delta Ct-værdier fra run køre på grund af analysen som sådan blev anslået til at være to standardafvigelser, dvs. 0,84 for IGFBP3, 0,74 for F3 og 0,72 for VGLL3.

Figur 1D , E, F viser histogrammer af Diff (delta Ct) for de tre signatur gener, når man sammenligner primær tumor mønster med godartet væv. I denne sammenligning IGFBP3 konsekvent billede værdier svarende til den Diff (delta CT) inden for de primære og sekundære cancer prøver fra hver patient (figur 1 D). Faktisk det primære mønster var næsten lige så ligner den godartet mønster som til den sekundære mønster. For F3, den primære-godartet lighed var mindre end den primære-sekundære lighed (figur 1E). VGLL3 viste store Forskel (delta CT) uoverensstemmelser mellem den primære Gleason tumor mønster og den godartede prøve (figur 1F).

En alternativ måde at illustrere forskellene i genekspression mellem primære og sekundære tumor mønstre er at gøre scatterplots af delta Ct-værdier fra målinger af disse cancer prøver (figur 2). I denne opfattelse er det klart, at sammenlignelighed er godt, især for lav delta Ct-værdier, med undtagelse af et par outliers (røde cirkler). Den lavere grad af sammenlignelighed for VGLL3 skyldes hovedsagelig forskelle ved høj delta Ct-værdier betyder relativt lave ekspressionsniveauer (stiplet linie firkant).

For at måle hvor ens de primære og sekundære cancer prøver var i form af genekspressionsniveauer og yderligere til outlier analyse, genereret vi scatterplots af genekspression niveauer af de to målinger. Ekspressionsniveauerne for de tre signatur gener er vist som delta Ct-værdier ved hjælp af samme ligning som beskrevet i teksten i figur 1. De primære og sekundære cancer sample målingerne refererer til to målinger, der indeholder den første og anden mest almindelige Gleason mønstre. De to typer af prøver kræft fra 43 patienter sammenlignes ved hjælp scatterplots. Røde cirkler angiver de afvigende værdier, som yderligere blev undersøgt med hensyn til væv input mængde og procentdele af cancer epitelceller. Stiplet linje firkant angiver VGLL3 målinger, der havde høj delta Ct-værdier og dårlig reproducerbarhed.

De store udsving i scatterplots af de tre gener i figur 2 (røde cirkler), blev yderligere undersøgt ved at kontrollere vævet input, de procentdele af kræftceller afmærkede områder eller særlige histopatologiske mønstre af de udvalgte kræft områder. Størstedelen af ​​afvigende værdier blev opnået fra prøver, der havde en af ​​følgende egenskaber: 0,1 mm

3 væv input, indeholdende 30% stromaceller eller repræsenterer infiltrativ /invasiv cancer type, inden for hvilken cancerceller sædvanligvis er indkapslet ved stromale celler. Denne vævstype blev fundet i 4 af 5 outliers for IGFBP3, for F3 3 af 5 og for VGLL3 4 af 6. Én patient producerede outliers i alle tre sammenligninger, og en anden patient producerede outliers for både F3 og VGLL3. Resterende outliers kunne ikke forklares.

Diskussion

Dette arbejde vurderer operatørens indflydelse på valget af hvilken biopsi, der skal bruges til genekspression analyse. For at minimere den samlede variation af testresultaterne i genekspression-assays, er det vigtigt at vurdere variabiliteten fremkaldt af subjektive beslutninger og dermed muligheden for at reducere variationen gennem forbedrede praktiske procedurer. I virkeligheden er denne undersøgelse af en tre gener ekspressionssignatur i prostatacancer indeholdt en stor andel (80%) af patienterne med ulige Gleason score såsom 3 + 4/4 + 3 (dvs. 7) eller 4 + 5/5 + 4 ( dvs. 9), hvor vi overveje risikoen for operatøren fejl at være størst.

IGFBP3 og F3 gener viste begrænsede forskelle i ekspressionsniveauerne inden kræft epitel celleprøver, når man sammenligner delta Ct-værdier fra forskellige biopsier stammer fra samme patient. Inden målinger kræft væv, der repræsenterer forskellige histopatologisk bestemt Gleason mønstre, den typiske variation var 1-2 delta Ct værdi enheder. Når man sammenligner en biopsi med godartede celler med den for primære Gleason mønster blev en lignende variation observeret for IGFBP3 og lidt større variation for F3. Da den positive variation kontrol var 0,7-0,8 delta Ct værdienheder, valget af biopsi er en kilde til fejl og variation af samme størrelsesorden som selve assayet.

Sammenligningen af ​​delta Ct-værdier fra vævsprøver stammer fra den samme patient kan udføres på mange måder. Med adgang til flere biopsier fra kun 43 patienter, er antallet af egnede fremgangsmåder til at sammenligne outputtet desværre begrænset. Vi har valgt at bruge histogrammer at præsentere forskellene, fordi det giver en klar illustration af fordelingen af ​​forskelle. For eksempel i figur 1A er det klart, at størstedelen af ​​de delta Ct forskelle, når sammenligner primær og sekundær cancer prøve er mellem 0 og 2 delta Ct enheder, ledsaget af et par outliers. Ethvert forsøg på at estimere konkordans ved hjælp af statistiske metoder vil blive kraftigt påvirket af de afvigende værdier, hvorfor valg af histogram repræsentation af resultaterne, ledsaget af scatterplots.

Målinger af VGLL3 ekspressionsniveauerne viste større variation mellem biopsier, der hovedsagelig var forårsaget af et lavt ekspressionsniveau i prostatacancerceller sammenlignet med de andre to signatur gener. Den gennemsnitlige delta Ct af VGLL3 i positive kontrol assays viste proben og primere til VGLL3 er tilstrækkeligt funktionelt, hvilket betyder, at ekspressionsniveauet af VGLL3 er virkelig lav i prostatavæv. Nøjagtig kvantificering af sådanne lave ekspressionsniveauer kan sandsynligvis forbedres ved at øge tilførslen af ​​cancervæv materiale for at forstærke signalet. Andre faktorer, der kan påvirke variabilitet VGLL3 målinger er variationer i stromacelle- indhold i de forskellige biopsi prøver eller uensartet mRNA nedbrydning, hvilket betyder, at VGLL3 måske lider af mere omfattende nedbrydning end de andre testede gener eller kan forskelligt fordelt mellem epitel og forskellige stromaceller.

Målinger af genet signatur i godartet væv afslørede, at IGFBP3 konsekvent givet samme værdier som i tumorvævet fra den samme patient, F3 forblev ens, men med større variation, og VGLL3 var meget varierende. Da kræft væv, der anvendes til måling indeholdt varierende niveauer af stromale celler, denne type analyse er vigtigt at lære at vejlede operatøren i biopsi valg. I genekspression målinger af både IGFBP3 og F3, de primære og sekundære tumor mønstre forudsat resultater, der var i aftalen, og i disse tilfælde blev det kendt, at kun en mindre brøkdel af tumor prøver i virkeligheden indeholdt stromale celler. Da F3 tabte dele af ekspressionsniveauet sammenlignelighed i retning kun godartet væv, er det vigtigt at have en stor fraktion af tumorceller i biopsiprøve anvendes til genekspression analyse. Vores nuværende bedste skøn er, at ca. 2/3 af vævet materiale skal indeholde kræft epitelceller for F3 til sammenlignelige resultater. For VGLL3, sammenligneligheden er dårlig, men det er uvist, om dette er relateret til dette gen bliver forskelligt udtrykt i tumor contra godartet væv, i epitel kræftceller versus stromale celler, eller hvis det er simpelthen en effekt af de tekniske vanskeligheder i at måle lav ekspression niveauer.

en vigtig observation er, at virkningen af ​​operatørens valg af hvilken biopsi er den primære i form af tumor mønster (Gleason mønster) er ikke en dominerende fejlkilde for de to gener, der var stærkt udtrykt, dvs. IGFBP3 og F3. Det betyder, at et gen-ekspression analyse under anvendelse IGFBP3 og F3 vil være ufølsomt over for moderate forskelle i Gleason grading. Desuden er der for IGFBP3 og F3 proceduren er ufølsom overfor den del af stromaceller, så længe ca. 2/3 af vævet materiale er cancerceller. Disse to aspekter er vigtige faktorer, der bidrager til en virkelig objektiv genekspression vurdering af patienten, der, når det kombineres med traditionelle kliniske parametre såsom Gleason score kan bidrage til mere præcise prognostiske udsagn. En anden vigtig iagttagelse er, at eftersom ekspressionen analyse af prøver, der repræsenterer de primære og sekundære mønstre er ens for IGFBP3 og F3, er der ingen grund til at holde dem adskilt, men alle tumor materiale fra en enkelt biopsi kan sandsynligvis samles i et hætteglas for genekspression analyse. For VGLL3, forekom de mest observerede store forskelle ved lave ekspressionsniveauer. Først efter den analytiske procedure er blevet ændret til at håndtere sådanne lave mængder, kan ydeevnen profil for VGLL3 på tværs af en bred vifte af tumor mønstre undersøges.

Ofte når en prognostisk eller diagnostisk genekspression panel er blevet udviklet på store og frisk (eller frisk frosset) vævsmateriale fra kirurgiske prøver udfordringen vil lægge i at overføre analysen til at håndtere prøver, som er tilgængelige i klinisk rutine, især ved hjælp af biopsi prøver indeholdende mindre kræft områder. FFPE vævssnit er almindelige i rutinediagnostik cancer, men indeholder lavere kvalitet DNA /RNA på grund af de barske vævspræparatet trin og langtidsopbevaring. Denne rapport viser, at for de to stærkt udtrykte gener, valget af hvilken vævsprøve at analysere har små (hvis nogen) indvirkning på analyseresultatet, som er opmuntrende for det generelle tilfælde overføre genekspression-assays fra frisk væv materiale til FFPE materiale .

med henblik på at bruge IGFBP3, F3, VGLL3 genekspression profil for at give supplerende oplysninger om prognosen for enkelte patients prostatakræft sygdom, gyldige assay data er påkrævet. Rapporten konkluderer, at operatøren afhængighed ikke vil være en dominerende fejlkilde for IGFBP3 og F3 i denne genekspressionsprofilen, som er af afgørende betydning for den praktiske gennemførelse af genekspression assay i rutinemæssig brug. Den genekspressionsprofilen øjeblikket evalueres på prostatakræft patientens materiale til det evne til at hjælpe med at gøre prognostiske beslutninger, og resultaterne af denne undersøgelse vil blive rapporteret på et senere tidspunkt.

Hvis konstateringen rapporteret i denne rapport bevise generelt vil den dokumentation for den underliggende ‘stemness’ hypotese i initiering og progression af (prostata) kræft styrkes. Da genekspressionsniveauer af IGFBP3 og F3 var uafhængige af histopatologisk indplacering i prostatacancer område, det samme som i godartet område kan genet signatur afspejler de underliggende patogenetiske mekanismer på prostatakræft. Baseret på denne observation, ville assay overførsler har en høj succesrate-rate i klinisk praksis.

Sammenfattende rapporterer vi, at operatøren valg af hvilken biopsi at foretage genekspression analyse på ikke har nogen dominerende indflydelse på resultaterne af IGFBP3 og F3 genekspression målinger i cancer epitelceller. Analysen af ​​VGLL3 genekspressionsniveauer vil drage fordel af optimering på grund af generelt lave ekspressionsniveauer.

Støtte oplysninger

tabel S1.