Abstrakt
Virkningerne af Som
4O
6 som adjuvans på fotodynamisk terapi (PDT) blev undersøgt. Som
4O
6 anses for at have anticancer aktivitet via flere biologiske aktioner, såsom frie radikaler produktion og hæmning af VEGF-ekspression. PDT eller AS
4O signifikant inhiberede TC-1-celleproliferation
6 på en dosis-afhængig måde (
P
0,05) ved MTT-assayet. Den anti-proliferative effekt af kombinationsbehandlingen var signifikant højere end i TC-1-celler behandlet med enten fotodynamisk terapi eller som
4O
6 alene (62,4 og 52,5% reduktion sammenlignet med vehikel-only behandlede TC-1-celler henholdsvis
P
0,05). Desuden celledeling i kombination med fotodynamisk terapi og som
4O
6 behandling signifikant faldt med 77,4% (
P
0,05). Cell overlevelse vejen (
Naip1, Tert
Aip1
) og p53-afhængige vej (
Bax, p21
Cip1, Fas, GADD45, IGFBP-3
Mdm-2
) blev markant forøget ved kombinationsbehandling af fotodynamisk terapi og som
4O
6. Desuden immunresponset i NEAT pathway (
Ly-12, CD178
IL-2
) blev også moduleret efter kombinationsbehandling, hvilket tyder forbedrede antitumorvirkninger ved at kontrollere uønsket vækst-stimulerende pathways. Kombinationen effekt tilsyneladende afspejlede konkordans med in vitro data, i at begrænse tumorvækst
in vivo
og i forhold til nogle fælles signalveje til dem observeret
in vitro
. Disse resultater tyder på fordelen ved kombinatoriske behandling med fotodynamisk terapi og som
4O
6 for hæmning af livmoderhalskræft vækst kræftcelle
Henvisning:. Kim YW, Bae SM, Battogtokh G, Bang HJ, Ahn WS (2012) Synergistisk anti-tumor effekter af Kombination af Fotodynamisk terapi og arsenforbindelse af livmoderhalskræft celler: in vivo og in vitro studier. PLoS ONE 7 (6): e38583. doi: 10,1371 /journal.pone.0038583
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
Modtaget: December 19, 2011; Accepteret: 7 maj 2012; Udgivet: Juni 8, 2012 |
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Den katolske Harvard Wellman Photomedicine Core Teknik Development center, Seoul, Republikken Korea (Grant # 5-2012-A0154-00001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Fotodynamisk terapi (PDT) involverer kombinationen af ikke-toksiske farvestoffer kendt som fotosensibilisatorer (PSS) og synligt lys af den korrekte bølgelængde, der skal absorberes af PSS. I nærværelse af oxygen, dette fører til generering af reaktive oxygenarter (ROS), som kan skade cellebestanddele, hvilket fører til celledød [1], [2]. Opdagelsen af programmeret celledød, eller apoptose, har revolutioneret området for cytotoksisk terapi i almindelighed og PDT især [3] – [5]. Men en fuldstændig udryddelse af tumorceller ved PDT alene er ikke garanteret [6]. . Yderligere undersøgelse kontrollere uønskede vækst-stimulerende veje efter PDT er ønskeligt at minimere risikoen for skadelige bivirkninger
arsenforbindelser har vist sig at besidde livsbevarende kvaliteter i kræftbehandlingen [7] – [10]. Lovende resultater blev rapporteret, der viser, at Diarsenic oxid (Som
2O
3) behandling kunne tilbyde et alternativ til kemoterapi for akut promyelocyt leukæmi (APL). Cytopatologiske undersøgelser viste også induktion af apoptose i APL celler. Nylige rapporter foreslået, at arsenforbindelser inhiberer proliferation af humane umbilical vene endotelceller (HUVEC) via G1 og G2 /M-fase standsning af cellecyklussen [8]. Derudover de inhiberende virkninger på bFGF- eller VEGF-stimuleret celleproliferation foreslå antiangiogene potentiale arsenforbindelser [11]. Desuden tetra-arsen oxid (Som
4O
6) blev rapporteret at have antiangiogeniske virkninger på NGF-induceret dannelse af nye fartøjer i rottens hornhinde, sammenlignet med kontrolgruppen og As
2O
3 behandlede gruppe [9]. Det har været derfor foreslået, at Som
4O
6 kunne være en ny arsenforbindelse, da det induceret apoptose i cancerceller ved meget lavere koncentration end Som
2O
3 [10]. Arsenforbindelser kan øge reaktive oxygenarter (ROS) i celler og derved forøge apoptoseinducerende faktor (AIF) sekretion gennem aktivering af PARP-1, og til sidst inducere celle apoptose. Frigivelse af cytochrom c og apoptoseinducerende faktor (AIF) er fintunet af Bcl-2-familien proteiner i en af følgende to måder: ifølge en mulig mekanisme, er Bax stede i cytoplasmaet translokeres til den mitokondriske membran, hvor den gennemgår konformationsændringer bistået af Bid. Bindingen af Bax til den ydre membran (OM) forårsager dens
in situ
multimerisering, hvorved PTP er indhegnet og cytochrom c er frigivet. Bcl-2 og Bcl-XL inhiberer konformationsændringer i Bax og derfor inhiberer frigivelse af cytochrom c og apoptose. Højt niveau af ROS produktion er den vigtigste årsag til apoptose ved arsenforbindelse. Som frit radikal, kan ROS reagere med de fleste biologiske makromolekyler, og derfor ikke blot kan inducere oxidativ skade på DNA, men også ændre struktur og funktion af proteinet [12] – [14].
På den anden side, ROS kan modulere genetisk ekspression ved at fungere som en anden messenger. Adskillige undersøgelser har antydet, at oxidativ skade kan være involveret i initiering begivenheder i cancer, og kunne hjælpe inducerer initiering af apoptose efter en stigning i celleproliferation [15], [16]. Arsenforbindelse kunne også sigende regulere immunresponset på involvere anti-cancer-funktion, gennem fald i VEGF-ekspression [12] – [14]
I denne undersøgelse, for det første viste vi den forbedrede antitumorvirkning af PDT. hjælp Radachlorin med som
4O
6 i mus med tumorer forårsaget af human papillomavirus (HPV) 16 E6 /E7 onkogen udtrykte TC-1 tumorceller. Den foreliggende undersøgelse viste, at kombinationsbehandling med PDT plus Som
4O
6 var meget mere effektivt om bekæmpelse af tumorvækst sammenlignet med PDT eller som
4O 6
alene.
Resultater
In vitro cellevækst hæmmende virkning af As
4O
6 plus Radachlorin /PDT på TC-1 celler
for at se væksthæmning effekt af PDT på TC -1 celle, på baggrund af 6.25J /cm
2 blev eksponeret ved 12 timer efter Radachlorin behandling på cellerne, og derefter blev cellevækst blev målt i et forudbestemt tidsrum. Levedygtighed celler behandlet med forskellige doser af Radachlorin efterfulgt af lysbestråling blev reduceret på en dosisafhængig måde sammenlignet med kontrollen, henholdsvis (figur 1A). For at se vækstinhibering virkning Som
4O
6 på TC-1-celle, cellevæksten blev målt i et forudbestemt tidsrum efter Som
4O
6 behandling. Levedygtighed celler behandlet med forskellige doser af As
4O
6 blev reduceret på en dosisafhængig måde sammenlignet med kontrol, henholdsvis (figur 1B). Under anvendelse af disse data, blev bestemt levedygtigheden af celler efter behandling af dyrkede TC-1-celler med 3 uM af As
4O
6 og forskellige doser af Radachlorin /PDT per dag. Kombinationsbehandlingen viste synergistisk virkning, faldende levedygtighed på en dosisafhængig måde sammenlignet med kontrol, som vist i figur 1C. Cellelevedygtighed blev fundet at være 62,4% for PDT alene og 52,5% efter Som
4O
6 alene behandling med en lav dosis. I modsætning hertil efter PDT plus Som
4O
6 behandling, var procentdelen af cellevækst blev fundet under 23%. Vi observerede også den kombinerede virkning vs. enkeltdoser over tid for at belyse, om den kombinatoriske fremgangsmåde kan resultere i længere levetid begrænsning af celleproliferation sammenlignet med individuelle terapier (figur 2). Cellelevedygtighed blev fundet at være mindre end 10% for 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT plus Som
4O
6 behandling i tre dage, sammenlignet med individuel behandling. Til vurdering af synergi mellem Radachlorin /PDT og som
4O
6 behandling, brugte vi en kombination indeks, der beregnes af Chou og Talalay metode (tabel 1). Blandt de mange kombinationer af behandling, 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT plus 3 uM af As
4O førte
6 på dag 3 og 4 til den højeste celledød sats og det viste synergi. En par flere cellelinjer, såsom HaCaT, HeLa og SiHa celler blev medtaget for at vurdere hæmning af cellevækst (Supplement Figur S1). Mens resultaterne af HaCaT og SiHa stemte overens med tidligere estimater af MTT-assay viste HeLa Radachlorine /PDT-resistente tendens i forhold til de andre celler. Cellelevedygtigheden af de to cellelinie viste sig at være mindre end 25% for 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT plus Som
4O
6 behandling i fire dage, sammenlignet med individuel behandling. Vi kendetegnet celledød ved farvning af TC-1-celler behandlet med 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT eller /og 3 uM af As
4O
6 i 1 dag. Som forventet, effekten af kombinationsbehandlingen var større end hver enkelt behandling. I mangel af Radachlorin /PDT eller AS
4O
6, cellerne opnået en fuldstændig konfluent, tætte monolag efter 48 timers kultur (figur 1D). Cellerne forblev fastgjort til vævskultur substratet og de vedtaget en aflang morfologi. I modsætning er de fleste af de celler behandlet med Radachlorin /PDT plus Som
4O
6 blev løsrevet fra pladen og var afrundede; karakteristisk for celler, som undergår død ved apoptose. De celler behandlet med Radachlorin /PDT eller som
4O
6 imidlertid vedtaget morfologier, der var mellemprodukt i naturen. Vi tælles forskellige apoptotisk cellepopulationer induceret af 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT eller /og 3 uM af As
4O
6 i 1 dag. Som vist i tillæg Figur S2, den celledød steget markant efter Radachlorin /PDT plus Som
4O
6 behandling. Tidlig apoptotisk befolkning var 9,9% ved Radachlorin /PDT plus Som
4O
6 behandling. I modsætning hertil tidligt apoptotiske cellepopulationer var 4,3% og 4,1% ved Radachlorin /PDT og som
4O
6 behandling hhv. Dette viser, at kombinationsbehandlingen inducerede mere tidlige apoptotiske celler sammenlignet med individuelle terapier.
(A) TC-1-celler (3 x 10
3) blev dyrket i plader med 12 brønde i tre eksemplarer natten over og behandlet med forskellige koncentrationer af Radachlorin og PDT (6,25 J /cm
2) som beskrevet i Materialer og Metoder. Efter PDT, blev cellerne dyrket i et forudbestemt tidsrum. (B) Hæmning effekter af cellevækst af As
4o
6 på TC-1 celler. TC-1-celler blev dyrket og behandlet som beskrevet i Materialer og Metoder. Efter Som
4O
6 behandling, blev cellerne dyrket i et forudbestemt tidsrum. Cellernes levedygtighed blev bestemt på grundlag af MTT-analysen. (C)
In vitro
celle væksthæmmende effekter af Som
4O
6 plus Radachlorin /PDT om TC-1 celler. TC-1-celler blev dyrket med 3 uM af As
4O
6 og forskellige doser af Radachlorin /PDT i 1 dag, som beskrevet ovenfor. Cellernes levedygtighed blev bestemt på grundlag af MTT-analysen. Hver bjælke repræsenterer en middelværdi [± SD (lodret linje)] af tre replikater pr dosis (
n
= 3). * Og #: signifikant forskellige (
P
0,05) fra kontrollen og PDT af t-test. (D) morfologiske ændringer af TC-1-celler. TC-1-celler blev behandlet med 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT eller /og 3 uM af As
4O
6 i 1 dag. Celler blev derefter betragtet under mikroskop. Billeder blev taget med fasekontrast mikroskopi på X300. (A) ikke-behandlede; (B) 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT alene; (C) 3 uM Som
4O
6 alene; (D) 3 uM Som
4O
6 plus 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT.
TC-1-celler blev dyrket med 3 uM af As
4O
6 og (A) 0,15 ug /ml og (B) 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT hhv. Cellernes levedygtighed blev bestemt på grundlag af MTT-analysen. Hver bjælke repræsenterer en middelværdi [± SD (lodret linje)] af tre gentagelser (n = 3). * Og #:. Signifikant forskellige (P 0,05) fra kontrollen og PDT af t-test
Gen-ekspression profil TC-1 celler behandlet med Som
4O
6 plus Radachlorin /PDT
Vi brugte RT
2 Profiler PCR Array System til at forstå de cellulære procesændringer hvorigennem TC-1 celler kunne påvirkes af kombinationsbehandling med som
4O
6 plus Radachlorin /PDT. Vi fandt 63 gener, der var mindst to gange op- eller nedreguleret (hvert gen er detaljeret beskrevet i tabel 2) og brugte hierarkiske clustering at vise differentielt udtrykte gener (figur 3A). For at detektere forskelle i de funktionelle profiler, vi tilføjet differentielt udtrykte gener i forbindelse med nærværende interactome viden, under anvendelse opfindsomhed Pathways Analyseværktøjer (
P
for alle 0,05), hvilket viser, at den forbedrede cellevækstinhiberingen og antitumorvirkninger blev signifikant relateret med genekspressionsniveauer af gener relateret med celledød, dvs. p53 og NFAT pathway (figur 3B). Hvert gen i reaktionsvejen blev testet ved kvantitativ PCR (figur 4), og resultaterne af PCR array og QRT-PCR var ens. Disse omfattede gener kodende for Tert, Aip1, Bax, p21, Fas, GADD45, IGFBP-3, Mdm-2, Ly-12, og IL-2 i forhold til svagt udtrykt gener, såsom Naip1 og CD178. Markant opreguleret molekylære funktioner for kombinationsbehandlingen gruppen var p53 pathway. Den molekylære funktion nedreguleret var NEAT vej. MAPK, cytokin-cytokin receptor-interaktion, fokal adhæsion blev celleadhæsion pathways også undersøgt i gensæt, men ikke strengt korreleret med forøget cellevækstinhiberingen (
P
for alle 0,05) (Figur 3C- F).
(a) Alle data blev median centreret og grupperet ved hjælp af en hierarkisk klyngedannelse. En klynge billede, der repræsenterer 63 af generne er vist i matrix-format, hvor rækkerne repræsenterer individuelle gener og kolonner repræsenterer hvert assay. Hver celle i matricen repræsenterer ekspressionsniveauet af et gen i et individ assay. Røde og grønne celler afspejler høje og lave ekspressionsniveauer hhv. (B) Ti gener (p53 og NEAT veje) viser statistisk signifikante forskelle i tre grupper er vist som en klynge billede. (C) MAPK-vejen som en klynge billede. (D) Cytokine-cytokin receptor-interaktion pathway. (E) Focal vedhæftning vej. (F) Celleadhæsion pathway.
Resultaterne præsenteres som transkriptniveauer i forhold til niveauet i ubehandlede kontrolceller ved hjælp af CT-metoden, med gennemsnitlig mRNA-niveau på fem intern kontrol gener, herunder b- actin anvendt som normalisering kontrol. (A) Celleoverlevelse pathway. (B) NEAT pathway. (C) p53 pathway.
Som
4O
6 plus Radachlorin /PDT undertrykker tumorvækst i TC-1 dyremodel
For at bestemme den synergistiske antitumor virkninger af Som
4O
6 plus Radachlorin /PDT
in vivo
blev C57BL /6 mus udfordret sc med TC-1-celler og derefter behandlet med Som
4O
6 eller /og Radachlorin /PDT. Behandling blev initieret på dag 0, da tumorer var ~230 mm
3 i størrelse. Som vist i figur 5A, som
4O
6 eller Radachlorin /PDT behandlede dyregrupper viste signifikant undertrykkelse af tumorvækst sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe. Men dyrene behandlet med kombinationen af As
4O
6 plus Radachlorin /PDT viste den mest betydningsfulde tumor suppression, sammenlignet med de andre grupper. Dette antydede, at Som
4O
6 kan spille en vigtig rolle i inhibering af væksten af Radachlorin /PDT.
(A) Tumor vækstkurver for TC-1 i mus behandlet med Radachlorin /PDT og /eller som
4O
6 (n = 7 for hver gruppe). Tumorbærende mus fik intravenøst injiceret Radachlorin (10 mg /kg legemsvægt) og /eller peritoneale injektioner af 7,5 mg /kg af As
4o
6. Tre timer senere blev cellerne eksponeret for laser, tumorstørrelse blev monitoreret derefter som beskrevet i Materialer og Metoder, og dens gennemsnitlige ellipsoide volumen blev afbildet over tid. Signifikant hæmning af tumorvækst blev detekteret ved ANOVA. *:
P
0,01, sammenlignet med kontrolgruppen, #:
P
0,01, sammenlignet med den alene Radachlorin /PDT-gruppen og $:
P
0,01, sammenlignet med den som
4O
6 alene gruppen. (B) Perfusion og morfologiske ændringer i TC-1-tumorer i C57BL /6 mus behandlet med Som
4O
6 (10 mg /kg legemsvægt, i.p.). Tumorvæv blev høstet efter 48 timer efter Som
4O
6 behandling. Væv blev set ved en bølgelængde på 365 nm og fotograferet ved x200 forstørrelse. (C) Procent område perfusion område med TC-1-tumorer i C57BL /6 mus behandlet med Som
4O
6 sammenlignet med ikke behandlede tumorer. De tumorvæv blev høstet ved angivne tidspunkter efter Som
4O
6 behandling. Sekventielle ændringer af perfunderede områder på 1, 3, 6, 12, 24, og 48 timer efter Som
4O
6 behandling. *
P
0,05, sammenlignet med ubehandlede kontroller. (D) CD31-immunfarvet tumor sektioner (original forstørrelse, x400) og As
4O
6-behandlede sektioner vises. Fireogtyve timer efter Som
4O
6 behandling, viste TC-1 tumorer omfattende tab af CD31 farvning indikerer betydelig As4O6-induceret vaskulær skade.
Effekt af arsen behandling på regionalt blod perfusion i tumorvæv
Hoechst 33342 blev brugt til at visualisere perfunderet fartøjer som beskrevet i materialer og metoder. I kontrol væv, blev vaskulære endotelceller klart farvet ved Hoechst 33342 ved både deres ydre kant og centrale region (figur 5B). Behandlede væv var centralt affarvet og periferien fluorescens-signalet var næsten upåviselig. Dette fænomen fortsatte til 24 timer punkt. Imidlertid fluorescens ved periferien af celler var helt tydelig ved 48 timer efter behandling, mens det centrale farvning var stadig til stede. For at observere ændringer i fartøjets funktion i hele tumor, blev tumor sektion scannet felt for felt. De sekventielle ændringer perfusion området efter Som
4O
6 behandling er vist i figur 5C. Ved hvert tidspunkt, den procentdel af hvert afsnit til tumor felt var sammenlignelig med kontrolvæv på hvert tidspunkt. Det perfusion Området blev straks reduceret efter Som
4O
6 behandling. Ved 6 og 12 timer, perfusionen område var den mindste, ved 24 timer perfusionen område var 14,4% sammenlignet med væv fra PBS-behandlede kontrol væv. Tumor mikrokarrør massefylde dimensioner blev målt efter administration af As
4O
6 til mus med TC-1 tumorxenoplantater. Som vist i figur 5D, var der en signifikant forskel i tumor fartøj tæthed som påvist ved CD31 farvning mellem Som
4O
6-behandlede gruppe og den tid-matchede PBS behandlede kontrolgruppe efter 24 timer af As
4O
6 behandling. Mus behandlet med AS
4O
6 havde en reduktion i tumor fartøj dimensioner sammenlignet med kontroldyrene, med CD31 farvede mikrokar stadig er synlige ved den ydre kant af tumoren.
In vivo genekspression niveauer af tumorvæv behandlet med som
4O
6 plus Radachlorin /PDT
TC-1-celler blev behandlet med AS
4O
6 og Radachlorin /PDT i 1 dag, som nævnt i afsnittet “Materialer og metoder”. Ekspressionen af gener mRNA i tumorvæv blev undersøgt ved QRT-PCR (figur 6A). Resultaterne er præsenteret som transkriptniveauer i forhold til niveauet i ubehandlede kontrolceller ved hjælp af CT-metoden, og b-actin mRNA-niveauer blev anvendt som normalisering kontrol. Brug af CD5 antigen i kombinationsbehandling gruppen, Ly-12 og IL-2-genekspression steg 26 og 17 gange, sammenlignet med kontrolgruppen, som viser, at p53 var involveret i regulering af NFAT pathway af p21, GADD45, IGFBP-3 , Mdm-2 og andre gener. Genekspression blev fundet forøget i tre på hinanden følgende forsøg. For at bestemme de roller p53 signalveje i synergistiske antitumor virkninger af Som
4o
6 plus Radachlorin /PDT
in vivo
, vi yderligere undersøgte de p53, p21, og GADD45 protein niveauer i vivo (figur 6B). Som
4O
6 eller Radachlorin /PDT behandlede dyregrupper viste ingen signifikante ekspressionssystemer ændringer sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe. I modsætning hertil p53, blev p21, og GADD45 protein steg betydeligt i kombinationsbehandling med Som
4O
6 plus Radachlorin /PDT.
(A) ekspression af gener mRNA i tumorvæv var undersøgt ved Q-PCR. Resultaterne er præsenteret som transkriptniveauer i forhold til niveauet i ubehandlede kontrolceller ved hjælp af CT-metoden, med b-actin mRNA-niveauer anvendes som normalisering kontrol. (B) Western blot analyse af in vivo tumorvæv behandlet med 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT og /eller 3 uM af As
4O
6 i flere dage.
Diskussion
i denne undersøgelse har vi forholdsvis analyserede resultater af enkelt behandling af As
4O
6 eller fotodynamisk terapi grupper med dem, der opnås ved co-behandling med E6 /E7 udtrykker TC-1-cellelinje og C57BL /6-musemodellen transplanteret med denne celle. Vi endelig rapporterer de forbedrede cellevækstinhiberingen og antitumorvirkninger og ændringer i genekspression niveauer af gener relateret med celledød, dvs. p53 og NFAT pathway, induceret af denne Som
4O
6 og PDT co-behandlingsmetode.
Disse virkninger blev fremstillet ved fotodynamisk terapi afhængig af koncentrationen af fotosensibilisatoren Radachlorin og ved As
4O
6 behandling i en koncentrationsafhængig måde. I PDT-ubehandlede celler, blev cellevæksten konsekvent fastholdt indtil udgangen af observationsperioden. PDT-behandlede celler blev regression kun for 1 dag efter PDT, men cellevæksten blev re-forøget efter 2 dage efter PDT. Jo lavere Som
4O
6 niveau var, jo langsommere cellevækst inhiberende virkning blev vist. Under tre uM af As
4O
6, celievækstinhiberingen syntes at begynde på den 1. dag i behandling og blev konsekvent holdt under 60-80% niveau af cellevækst i løbet af de første 4 dage af behandlingen. I modsætning hertil koncentrationer af As
4O
6 højere end 3 uM syntes at være cytotoksisk. I co-behandlingsgruppe af As
4O
6 og PDT blev der fundet mere signifikante virkninger på cellevækst hæmning og mere morfologiske ændringer, sammenlignet med hver enkelt behandlingsgruppe. Det er kendt, at antitumormidler generere reaktive oxygen og reaktive nitrogenforbindelser at inducere apoptose og nekrose af cellen [17] – [19]. Som en af de antitumormidler, til antitumor mekanisme arsenforbindelse generere reaktive oxygen og nitrogen arter i colorektal cancercellelinie er også blevet rapporteret [20]. Tilførslen af tilstrækkelig oxygen og generering af reaktive oxygenarter (ROS) er kendt for at være væsentlige faktorer, der bestemmer effekten af fotodynamisk terapi [4], [21]. Derfor induktion af ROS medieret af antitumormidler kan have bidraget til at øge effektiviteten af PDT.
Dernæst analyserede vi forholdsvis ændringen af intracellulære signalvej af hver enkelt /co-behandlingsgruppen, ved hjælp af RT
2Profiler
TM PCR vifte metode, og disse resultater blev bekræftet af real-time PCR undersøgelse ved hjælp 13 forskellige primere. Brug af real-time PCR-metode, analyserede vi ændringen i ekspressionsniveauer af 84 gener involveret i 15 signalveje. Vi fandt væsentlige ændringer i ekspressionsniveauerne af gener vides at være involveret i celle overlevelse vejen (f.eks Naip1, Tert, Aip1, etc.), p53-vejen (f.eks Bax, p21, Fas, GADD45, IGFBP-3, MDM- 2, etc.), og NFAT (nuklear faktor aktivere T-celle) pathway (f.eks Ly-12, CD178, IL-2, etc.) er involveret i modulering af immunresponset. Især ekspressionsniveauer af Naip1, der er kendt som apoptose-inhiberende gen, og tert, telomerase revers transkriptase, blev nedsat i hver celle overlevelse pathway, mens ekspressionsniveauet af apoptoseinducerende genet Aip1 blev forbedret. Desuden viste PCR array-resultaterne nedsatte niveauer af Tert-genekspression på 2,7, 17,1 og 34,6 gange i As
4O
6 alene, PDT alene og co-behandlingsgrupper henholdsvis hver sammenlignet med kontrolgruppen . Tert-genet er kendt for at være relateret til aktivering af telomerase, og i tilfælde af livmoderhalskræft, c-myc-genet synes at inducere telomerase aktivering med tert-ekspression [22]. Derfor foreslår vi, at nedregulering af Tert gen induceret af dette samarbejde behandling af As
4O
6 og PDT kan have været involveret i celledød. Hæmningen af Tert genet blev også bekræftet af real-time PCR undersøgelse udført efter RT
2 Profiler
TM PCR array analyse, og denne reduktion af Tert genekspression niveau konsekvent vist i co-behandlede gruppe, både
in vitro
in vivo
.
Vi observerede også ændringer i ekspressionsniveauerne af p21, Fas, GADD45, IGFBP-3, og Mdm-2 gener, kendt at være involveret i p53 pathway, og co-behandlingsgruppen viste mere signifikant stigning i forhold til hver enkelt behandlingsgruppe. Imidlertid blev enhver betydelig ændring af Bax-genekspression (der vides at blive aktiveret af p53) ikke observeret. Desuden fra fraværet af væsentlige ændringer af p53-niveau, disse ændringer af p21, Fas, GADD45, synes IGFBP-3, og Mdm-2 genekspressionsniveauer at være medieret af p53-uafhængige veje.
Ud betragtning ekspressionsniveauerne af gener som Ly-12, CD178, og IL-2, vides at være involveret i NFAT pathway, Ly-12-ekspression øges, hvorimod CD178 og IL-2 udtryk snarere faldt i den samtidigt behandlede gruppe, sammenlignet med hver enkelt behandlingsgruppe. Som det intracellulære vej af NFAT har været kendt for at være forbundet med øgede immunresponser, forventede vi, at det kunne være opreguleret af PDT; imidlertid genekspressionsniveauer i denne vej, herunder IL-2, faldt efter PDT-behandling og yderligere fald blev fundet i den samtidigt behandlede gruppe. Men da vi forsøgte at bekræfte resultaterne af RT
2Profiler
TM PCR array ved hjælp af real-time PCR-metode, fandt vi modsatte resultater i forhold til de af RT
2Profiler
TM PCR array, dvs. IL-2-ekspression faldt i PDT alene behandlingsgruppe og steg i co-behandlingsgruppen begge viser lignende resultater
in vitro
og
in vivo
betingelser. Det blev rapporteret, at PDT kan stimulere tumorvækst-fremmende immun signaler og kunne forbedres ved at kontrollere uønskede vækst-stimulerende veje [23], [24]. Derfor er vores resultater for IL-2 synes at vise, at PDT faldt ekspressionen af dette gen, hvorimod det blev forøget med arsenforbindelse behandling, hvilket indikerer, at kombinationsterapi kombinere to fordele ved at inducere immune mediatorer og antitumorvirkninger. Desuden er denne samtidig behandling øgede
in vitro
in vivo
ekspressionsniveauerne af den CD5 antigen genet og Ly-12 op til 23 og 26 gange. Men ekspressionsniveauer af Ly-12 eller IL-2 ikke signifikante ændringer i PDT alene behandlingsgruppe; derfor, den forøgede genekspression syntes at være induceret af arsenforbindelse. Men indtil videre er der ikke andre studier rapporteret forholdet mellem den kombinerede PDT-As
4O
6 behandling og NFAT pathway, og mere intensive undersøgelser bør gennemføres.
På samme måde vores TC-1-cellelinje-transplanterede musemodel viste signifikant forbedret antitumor effekt i PDT og som
4O
6 co-behandlingsgruppen sammenlignet med hver enkelt behandlingsgruppe. For at identificere mekanismen ved denne virkning udførte vi realtids-PCR eksperiment ved anvendelse af 10 forskellige primere og endelig observeret signifikante ændringer i ekspressionsniveauer af gener, der vides at være involveret i celleoverlevelse pathway, p53 pathway og NFAT pathway, svarende til dem, fås fra
in vitro
eksperimenter. Vores western blot data viser, at samtidig behandling forøget ekspression af p53, p21, GADD45 på syv dage i forhold til monoterapi behandling og kontrol. Aktivering af p53-protein spiller en afgørende rolle i kontrollen af tumorcelle reaktion på kemoterapeutiske midler og DNA-ødelæggende midler. p21 og GADD45, nedstrømseffektorer af p53, blev aktiveret i kombinationsbehandling producerer apoptose i TC-1 tumorceller. Disse resultater antyder, at apoptose kan medieres gennem p53 signalvejen via opregulering af proapoptotiske proteiner.
Under PDT, intracellulær nedbrydning af oxygen og kollapsede blodkar kan inducere intracellulær hypoxi, og dette kunne opregulere niveauet af VEGF-ekspression til at katalysere angiogenese [25]. Mange undersøgelser af PDT har forsøgt at forøge effektiviteten af denne metode ved at støtte dannelsen af intracellulær ROS, eller ved at udføre denne fremgangsmåde i kombination med flere inhibitorer af angiogenese, såsom COX-2, MMP eller VEGF [9], [ ,,,0],26] – [31]. Arsenforbindelser anvendes for tiden som terapeutiske midler til akut leukæmi og forskellige faste tumorer, og de også er blevet beskrevet at generere ROS og inhibere VEGF-ekspression [17], [19]. I denne undersøgelse den vaskulære forstyrrelser virkning Som
4O
6 blev bestemt ved Hoechst33342 perfusion og CD31 immunhistokemisk farvning. Blod perfusion område faldt hurtigt efter Som
4O
6 behandling. Fra 3 timer tidspunkt, den centrale del af tumorer forsvandt med hensyn til perfusion aktivitet og endelig kunne påvises næsten ingen signal i hele tumoren området, selv den ydre kant. Interessant nok blev denne reduktion af perfusion område genvundet fra 24 timer tidspunkt, og fluorescens fremgik yderkanten tydeligt på 48 og 72 timer. Selvom blodet perfusion syntes at være genvundet fra den ydre kant 72 timer efter behandling blev intet signal påvist fra indersiden af tumorer. Disse data viste, at langt mere intensive immunreaktive mikrokar blev observeret i tumorvæv fra mus behandlet med PBS, men lidt CD31-farvning var til stede i det centrale område af tumorvæv fra mus behandlet med Som
4O
6. Resultaterne ekko de undersøgelser, der involverer Som
2O
3 og Conbretastatin A-4 [32], [33]. Som
2O
3 nedsat blod perfusion i forhold til kontrol op til 6 timer efter Som
2O
3 behandling med en vis bedring på 24 timer [32], og også CA-4-P, 24 timer efter behandling på P22 tumorer vaskulære funktioner vises delvis genvinde [33]. Derfor i denne undersøgelse anvendte vi et af arsenforbindelser, dvs. som
4O
6, i kombination med PDT metode til at undersøge den stigende antitumorvirkning og også dens intracellulære signalveje. Disse data viste, at virkningen af den kombinatoriske terapi på VEGF og tilhørende veje blev styrket med vurderingerne af tumorassocieret vaskulatur i dyremodellen og af angiogenese markører i tumoren læsioner.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.