Abstrakt
phosphoinositid 3-kinase (PI3K) -mammalian mål for rapamycin (mTOR) signalering akse er opstået som en ny mål for kræftbehandling. Midler, der hæmmer PI3K, mTOR eller begge er i øjeblikket under udvikling. MTOR allosterisk inhibitor, RAD001, og PI3K /mTOR dual kinaseinhibitor, BEZ235, er eksempler på disse midler. Vi var interesseret i at udvikle strategier til at forbedre mTOR målrettet caner terapi. I denne undersøgelse fandt vi, at BEZ235 effektivt alene hæmmede væksten af rapamycin-resistente cancerceller. Interessant, at kombinationen af suboptimale koncentrationer af RAD001 og BEZ235 udøvede synergistisk hæmning af væksten af humane lunge kræftceller sammen med induktion af apoptose og G1 anholdelse. Endvidere kombinationen var også mere effektivt end alene til inhibering af væksten af lungekræft xenotransplantater i mus enten agent. Kombinationen viste forbedrede virkninger på inhibering mTOR signal- og reducere ekspressionen af c-myc og cyclin D1. Tilsammen tyder vore resultater, at kombinationen af RAD001 og BEZ235 er en hidtil ukendt strategi til cancerterapi
Henvisning:. Xu C-X, Li Y, Yue P, Owonikoko TK, Ramalingam SS, Khuri FR, et al. (2011) Kombinationen af RAD001 og NVP-BEZ235 Udøver Synergistisk Anticancer aktivitet mod ikke-småcellet lungekræft
In vitro
In Vivo
. PLoS ONE 6 (6): e20899. doi: 10,1371 /journal.pone.0020899
Redaktør: Gen Sheng Wu, Wayne State University, USA
Modtaget: 31 Mar 2011; Accepteret: 12. maj 2011; Udgivet 14. juni, 2011
Copyright: © 2011 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Georgia Cancer Coalition Distinguished Kræft Scholar award, NIH R01 CA118450 og P01 CA116676 (Projekt 1), Department of Defense IMPACT (Imaging og molekylære markører for patienter med lungekræft: indflyvninger med Molecular Targets, Komplementære /innovative behandlinger og Terapeutisk Retningslinjer) tildeling W81XWH-05-0027 (Project 5), BATTLE (Biomarkør tilgange for målrettet terapi for lungekræft Elimination) award W81XWH-06-1-0303 (Projekt 4) og BESCT (Biologi, Uddannelse, Screening, Chemoprevention og Terapi) award DAMD17-01-1-0689 (Projekt 2). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
K-Ras, LKB1 og epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) er hyppigt muteret i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Disse mutationer resulterer i afvigende aktivering af phosphoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt /mammalian target of rapamycin (mTOR) signalvejen [1], [2], [3]. Derfor har PI3K /Akt /mTOR-signalvejen dukket op som et lovende terapeutisk mål for NSCLC.
RAD001 (Everolimus) er et derivat af rapamycin og er funktionelt ligner rapamycin som en allosterisk inhibitor af mTOR. Hos patienter med fremskreden renalcellecancer tidligere behandlet med VEGF målrettede agenter, RAD001 forbedrer progressionsfri overlevelse og er derfor blevet godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration for denne indikation [4]. Det har også vist sig at forbedre progressionsfri overlevelse hos patienter med neuroendcorine kræft i bugspytkirtlen. I mange andre faste orgel maligniteter, RAD001 og andre rapamycin analoger (rapalogs) de rapalogs udøver beskedne anti-cancer effekter, at selv lovende, ikke er tilstrækkelige til at berettige monoterapi med disse stoffer [5].
De seneste bestræbelser på at effektivisering af de rapalogs har fokuseret på at udvikle ny kombination af strategier. NVP-BEZ235 (BEZ235) er en ny og oralt administreret dobbelt PI3K og mTOR-hæmmer. Denne forbindelse er et potent, reversibel inhibitor af både klasse I PI3K og mTOR kinase katalytisk aktivitet ved at konkurrere på deres ATP-bindingssted [6]. BEZ235 er i øjeblikket under evaluering i fase I /II kliniske forsøg. I prækliniske studier, inducerer BEZ235 slående anti-proliferative virkninger både i transgene mus med onkogent K-Ras-induceret NSCLC og i NSCLC cellelinjer, der udtrykker onkogen K-Ras. Desuden er det effektivt sensibiliserer NSCLC cellelinjer, der udtrykker oncogen K-Ras til de pro-apoptotiske virkninger af ioniserende stråling både
in vitro
in vivo
[7]. Da BEZ235 blev kombineret med en MEK-inhibitor, mærket synergi blev opnået i faldende K-Ras mutant murine lungecancere [8].
Ligesom rapamycin, RAD001 forårsager Akt aktivering i humane cancerceller, herunder NSCLC celler, mens inhibering af mTOR signalering [9]. Vi har for nylig rapporteret om forbedret effekt af kombinationen af RAD001 med en PI3K-inhibitor på væksten af NSCLC celler både
in vitro
in vivo
[9]. Interessant, BEZ235 kunne overvinde rapamycin modstand, da det effektivt hæmmede væksten af rapamycin- eller RAD001-resistente NSCLC celler. Derfor har vi vurderet effekten af kombinationen af RAD001 og BEZ235 på væksten af NSCLC celler og fandt, at kombinationen var mere effektiv end enten agent alene i at hæmme væksten af NSCLC celler både
in vitro
in vivo
. Denne rapport vil primært dokumentere vores forskningsresultater i denne henseende.
Materialer og metoder
Reagens
RAD001 og BEZ235 blev leveret af Novartis Pharmaceuticals Corporation (East Hanover, NJ), opløst i DMSO og opbevaret ved -80 ° C. Kanin polyklonalt anti-actin-antistof blev købt hos Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Antistoffer mod Akt, p-Akt (S473), p-S6 (S235 /S236), S6, p-4EBP1 (S65) p-4EBP1 (Thr37 /46), 4EBP1, eIF4G, eIF4E, og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), henholdsvis blev indkøbt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Goat polyklonalt mTOR (FRAP, N-19) og monoklonale muse c-Myc (9E10) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), hhv. Polyklonalt Rictor (BL2178) antistof blev indkøbt fra Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX). Mus monoklonale cyclin D1 antistof blev købt fra Dako (Carpinteria, CA).
cellelinjer og Cell Culture
Den menneskelige NSCLC cellelinjer A549, H460 og H157 blev beskrevet tidligere [10]. HCC827 blev indkøbt fra American Type Culture Collection ATCC (Manassas, VA). Rapamycin-resistente A549-cellelinje (A549-RR) blev etableret tidligere [9]. Disse cellelinier blev dyrket i monolagskultur i RPMI 1640 medium suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære bestående af 5% CO
2 og 95% luft.
Growth Inhibition Assay
Celler blev dyrket i 96-brønds celledyrkningsplader og behandlet den næste dag med midlerne angivet. Levedygtige celletal blev estimeret ved anvendelse af sulforhodamin B (SRB) assay som tidligere beskrevet [10]. Kombination indeks (CI) for lægemiddelinteraktion (f.eks synergi) blev beregnet ved hjælp af den CompuSyn software (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ).
Colony Formation Assay
Virkningerne af den givne lægemidler på kolonidannelse på plader blev målt som tidligere beskrevet [11].
påvisning af apoptose
apoptose blev vurderet ved Annexin V-farvning under anvendelse af Annexin V-PE apoptose afsløring kit indkøbt fra BD Biosciences ( San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner.
Western blot-analyse
Fremstilling af helcelle proteinlysater og Western blot-analyse blev beskrevet tidligere [12], [13].
m
7GTP Pull-down for analyse af eIF4F Complex Dannelse
eIF4F kompleks i celleekstrakter blev detekteret ved anvendelse af affinitetskromatografi m
7GTP-Sepharose som beskrevet tidligere [14].
Påvisning af mTOR komplekser (mTORCs)
mTORCs herunder mTORC1 og mTORC2 blev immunfældet med ged polyklonale mTOR (FRAP; N-19) antistof og fulgte med Western blotting at opdage mTOR, raptor og Rictor henholdsvis som tidligere beskrevet [9].
lungekræft Xenografter og behandlinger
Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Emory University. Protokollen nummer er 222-2008. Fem til seks uger gamle kvindelige atymiske (nu /nu) mus blev bestilt fra Taconic (Hudson, NY) og opstaldet under patogenfrie betingelser i microisolator bure med laboratorie chow og vand
ad libitum
. A549-celler ved 5 x 10
6 i serum-frit medium blev injiceret s.c. i flanken region nøgne mus. Når tumorerne nåede en størrelse på cirka 100 mm
3, blev musene randomiseret i fire grupper (n = 6 /gruppe) ifølge tumorvolumener og legemsvægte for følgende behandlinger: vehikelkontrol, BEZ235 (20 mg /kg /dag, og), RAD001 (3 mg /kg /dag, og), og deres kombination. Tumorvolumener blev målt ved hjælp af caliper målinger en gang hver anden dag og beregnet med formlen
V
= π (længde × bredde
2) /6.
Statistik Analyse
Den statistiske signifikans af forskelle mellem to grupper eller blandt flere grupper blev analyseret med dobbeltsidet uparret Students
t
tests (for ens varianser) eller med Welch er korrigeret
t
test (ulige varianser) eller envejs variansanalyse (ANOVA) ved anvendelse af Graphpad InStat 3 software. Resultaterne blev anset for at være statistisk signifikant på
P
. 0,05
Resultater
BEZ235 effektivt hæmmer væksten af rapamycin-resistente NSCLC Celler
I en forudgående undersøgelse, vi etableret en rapamycin-resistent cellelinje (dvs. A549-RR). Denne cellelinie er også modstandsdygtige over for RAD001 [9]. Vi forventede, at denne cellelinie ville være, i hvert fald delvist, modstandsdygtig over for BEZ235 da det er en PI3K og mTOR dual inhibitor. Uventet BEZ235 demonstreret potent inhibering af væksten af A549-RR-celler (Fig. 1A). Desuden BEZ235 også induceret apoptose i A549-RR-celler (fig. 1B). Faktisk induktionen af apoptose og vækstinhibering med BEZ235 var lidt mere effektiv i A549-RR celle end i forælder A549-celler (fig. 1). Således behøver rapamycin-resistente celler viser ikke krydsresistens over for BEZ235.
A
, De angivne cellelinier blev podet i 96-brønds plader og derefter behandlet med forskellige koncentrationer af BEZ235 som angivet på den anden dag. Efter 3 dage blev celleantallet estimeret ved anvendelse SRB-assay. Points, midler til fire replikate bestemmelser; barer, ± SD.
B
, De angivne cellelinier blev udpladet i plader med 6 brønde og derefter behandlet næste dag med forskellige koncentrationer af BEZ235 som angivet. Efter 24 og 72 timer blev cellerne høstet og udsat for detektion af apoptose ved hjælp af Annexin V-farvning. Kolonner, hjælp af dobbeltbestemmelser; barer, ± SD.
Kombinationen af RAD001 og BEZ235 Synergistisk hæmmer væksten af NSCLC Celler sammen med induktion af apoptose og G1 anholdelse
Vi har tidligere vist, at kombinationen af rapamycin eller RAD001 med PI3K inhibitor LY294002 resulterede i øget vækst-hæmmende virkninger mod NSCLC celler både
in vitro
in vivo
[9], [15]. Vi har nu studeret om kombinationen af BEZ235 og RAD001 udøver augmented anti-cancer aktivitet i NSCLC celler. Uventet fandt vi, at kombinationen af lave koncentrationer af BEZ235 og RAD001 var meget mere potent end hvert enkelt middel til inhibering af væksten af adskillige NSCLC cellelinier (fx A549, H460, H157 og HCC827). CIS for de fleste kombinationer var 1 (. Figur 2A, højre paneler), hvilket indikerer synergistiske virkninger på inhibering af væksten af NSCLC-celler. Efter aftale, at kombinationen af BEZ235 og RAD001 var signifikant mere potent end hvert enkelt middel til at inducere apoptose (figur 2B.) Og G1 anholdelse (figur 2C.) (
P
0,001). Således forøget induktion af både apoptose og cellecyklusstandsning bidrager til augmented vækstinhiberende virkninger induceret af kombinationen.
A
, de indikerede cellelinier blev podet i plader med 96 brønde og derefter behandlet næste dag med forskellige koncentrationer af BEZ235 (BEZ), RAD001 (RAD), og deres respektive kombinationer som angivet. Efter 3 dage blev celleantallet estimeret ved anvendelse af SRB-assayet og cis blev beregnet med CompuSyn software (højre paneler). Points, midler til fire replikate bestemmelser; barer, ± SD.
B
og
C
, De angivne cellelinier blev udsået i 6-brønds plader og derefter behandlet med 10 nM BEZ235 alene, 2 nM RAD001 alene, og deres kombination. Efter 48 timer blev cellerne høstet til påvisning af apoptose ved hjælp af Annexin V-farvning (
A
) og for cellecyklus-analyse med en flowcytometri (
C
). Kolonner, hjælp af dobbeltbestemmelser; Barer, ± SD. *,
P
0,05, **
P
0,01 og ***,
P
0,001 sammenlignet med DMSO kontrol; ###,
P
0,001 sammenlignet med RAD001 eller BEZ235 alene
Kombinationen af RAD001 og BEZ235 effektivt hæmmer dannelsen og vækst af NSCLC Cell Kolonier
Vi yderligere bestemmes de langsigtede virkninger af kombinationen af RAD001 og BEZ235 på væksten af NSCLC-celler i en koloni-dannelse assay. Dette assay giver os mulighed for at gentage behandlingerne i lang tid (fx 12 dage). RAD001 i en dosis på 1 nM og BEZ235 ved 5 nM alene havde minimal virkning på undertrykkelse af kolonidannelse af NSCLC-celler; men kombinationen enten elimineret kolonidannelse (fx A549) eller drastisk reduceret koloni numre (for eksempel H460 og H157) (fig. 3). Således er det klart, at kombinationen er langt mere effektiv end både enkelt middel i inhibering af kolonidannelse og vækst af NSCLC-celler (
P
0,001). Vi sammenlignede også virkningen af rækkefølgen af administration af de to agenter på koloni dannelsen af NSCLC celler. Under de samme eksperimentelle betingelser er beskrevet ovenfor, sekventielle behandlinger med RAD001 først efterfulgt af BEZ235 behandling (RAD001 → BEZ235) eller BEZ235 først efterfulgt af RAD001 behandling (BEZ235 → RAD001) viste virkninger kan sammenlignes med hver alene med minimal undertrykkelse af væksten af NSCLC celle kolonier . Den samtidige kombination af RAD001 og BEZ235 var meget mere potent end enten sekventiel behandling til inhibering af dannelsen og væksten af NSCLC kolonier (
P
0,001) (Fig. 2). Derfor samtidig indgivelse af RAD001 og BEZ235 er klart bedre end sekventielle behandlinger i inhibering af væksten af NSCLC cellekolonier.
De angivne cellelinier ved en densitet på ca. 200 celler /brønd blev podet i plader med 24 brønde. På den anden dag blev cellerne behandlet med 1 nM RAD001 (RAD), 5 nM BEZ235 (BEZ) eller deres samtidige kombinationer (RAD + Bez). Cellerne blev også behandlet med 1 nM RAD001 i 6 dage fulgt med 5 nM BEZ235 i yderligere 6 dage (RAD → BEZ) eller med 5 nM BEZ i 6 dage fulgt med 1 nM RAD001 i yderligere 6 dage (BEZ → RAD). Efter 12 dage blev pladerne farvet for dannelsen af cellekolonier med krystalviolet farvestof. Billedet af kolonierne blev derefter taget med et digitalt kamera (
A
) og koloni-numre blev talt (
B
). ***,
P
0,001 sammenlignet med DMSO kontrol; ###,
P
0,001 sammenlignet med alle andre behandlinger
Vi yderligere i forhold virkningerne af kombinationen af RAD001 og LY294002 med sekventielle behandlinger på koloni dannelse af NSCLC celler. . Konsekvent, samtidig kombinationsbehandling, men ikke den sekventielle behandling enten med RAD001 først efterfulgt af LY294002 eller med LY294002 efterfulgt af RAD001, genererede forøgede virkninger på inhibering af kolonidannelse af NSCLC-celler (fig. S1).
The kombination af RAD001 og BEZ235 udøver Augmented aktivitet mod vækst af NSCLC Xenografter i nøgne mus
på grund af de lovende vækst-hæmmende virkninger af RAD001 og BEZ235 kombination NSCLC celler
in vitro
, vi derefter valideret virkningen af kombinationen mod vækst af NSCLC-tumorer i mus. Både RAD001 og BEZ235 delvist, men væsentligt, hæmmede væksten af A549 xenografter (
P
0,01); men kombinationen af RAD001 og BEZ235 var signifikant mere potent end hvert enkelt middel til inhibering af væksten af xenotransplantater som målt ved både tumor størrelser og vægte (
P
0,01) (. 4A og 4B). Disse
in vivo
data viser yderligere, at kombinationen af RAD001 og BEZ235 skærme augmented anticancer aktivitet. Vi observerede en højere grad af vægttab i mus behandlet med kombinationen (op til 19% af kontrolmusene) især i behandlingsperioden tidligt. Vægtforskellen i slutningen af eksperimentet forbedret til kun 13% af kontrol (fig. 4C), hvilket tyder på mulig tilpasning og bedre tolerance af kombinationsbehandlingen,
A549 xenotransplantater blev behandlet (én gang dagligt) med vehikel kontrol, RAD001 (3 mg /kg, og), BEZ235 (20 mg /kg, og) og deres kombination (BEZ + RAD) begynder på den samme dag efter gruppering. Tumor størrelser (
A
) og kropsvægt (
C
) blev målt en gang hver anden dag. Efter 14 dage blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet og vejet (
B
). Hver måling er en middelværdi ± SD (n = 6). Tallene i
C
repræsenterer vægttab i kombinationen sammenlignet med kontrolgruppen. *
P
0,05 sammenlignet med kontrol køretøjet **
P
0,01 sammenlignet med kontrol køretøjet ***
P
0,001 sammenlignet med kontrol køretøjet
##
P
0,01 sammenlignet med RAD001 eller med BEZ235
Kombinationen af RAD001 og BEZ235 udøver Forbedret Virkninger på bekæmpelse af mTOR signalering og nedregulering af c. Myc og cyclin D1
for at få indblik i de mekanismer, som kombinationen af RAD001 og BEZ235 øve forbedret anticancer aktivitet, vi analyserede virkningerne af kombinationen på mTOR signalering og udtryk for sine regulerede proteiner i sammenligning med hvert middel alene. Ved de testede doser, BEZ235 havde en minimal effekt på reduceret p-S6-niveauer, men ingen effekt på niveauerne af p-4EBP1 (både S65 og T37 /46), c-myc og cyklin D1. Faktisk observerede vi øget niveauer af 4EBP1 (T37 /46) (i både A549 og H157) og c-myc (fx i H157). RAD001 på 2 Nm stærkt hæmmet S6 og 4EBP1 (S65) fosforylering, men ikke reducere mængden af p-4EBP1 (T37 /46), c-myc og cyclin D1. Svarende til BEZ235, RAD001 steg også niveauet af p-4EBP1 (T37 /46) og c-myc i både A549 og H157 celler. Men kombinationen af RAD001 og BEZ235 enten ophævet stigningen i p-4EBP1 (T37 /46) (fx i A549 celler) induceret af den enkelt middel eller udøvede forstærket effekt på reduktion p-4EBP1 (T37 /46) niveauer (fx i H157 celler). Vigtigt er det, havde kombinationen af RAD001 og BEZ235 augmented effekter på faldende niveauerne af c-myc og cyklin D1 i både A549 og H157 celler sammenlignet med hvert enkelt middel alene (fig. 5).
A
blev de angivne cellelinier udpladet i 10 cm diameter celle dyrkningsskåle og behandlet næste dag med de givne koncentrationer af BEZ-235 i fravær og nærvær af RAD001 i 24 timer. Cellerne blev derefter høstet til fremstilling af hel-celle-proteinlysater og efterfølgende Western blot-analyse til påvisning af de angivne proteiner.
B
, De angivne cellelinjer blev behandlet med 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 eller deres kombination. Efter 24 timer blev cellerne høstet til fremstilling af hel-celle-proteinlysater og efterfølgende m
7GTP pull-down assay følges med Western blot-analyse til påvisning af de givne proteiner.
RAD001 øget Akt phosphorylering i både A549 og H157 cellelinier som vi tidligere rapporteret [9]. Interessant nok ved lave doser, BEZ235 steg også p-Akt niveauer. Tilstedeværelsen af BEZ235 ved den testede dosisområder enten svagt reducerede niveauer af p-Akt induceret af RAD001 (f.eks, i A549-celler) eller påvirkede ikke RAD001-inducerede stigning i p-Akt (fx i H157 celler) (fig. 5). Det synes således, at kombinationen RAD001 og BEZ235 kan vise øget virkning på at undertrykke mTOR signalering og udtryk for sine regulerede proteiner med begrænset eller ingen hæmmende effekt på Akt phosphorylering.
Kombinationen af RAD001 og BEZ235 Udøver Udvidet virkninger på Undertrykkelse eIF4F Assembly
Da mTOR signalering er kendt for at positivt regulere cap-afhængige translationsinitiering, vi yderligere analyseret virkningerne af RAD001 og BEZ235 kombination på hætten binding af eIF4E og eIF4G (f.eks eIF4F samling) med den m
7GTP-Sepharose pull down assay. Som vist i fig. 5B, RAD0001 og BEZ235 alene reducerede mængden af eIF4G der kommunikerede med eIF4E. Kombinationen af RAD001 og BEZ235 var meget mere effektivt at enten middel alene i faldende mængderne af eIF4G binding til eIF4E. Specialer resultater indikerer klart, at kombinationen af RAD001 og BEZ235 udøver forbedret effekt på at undertrykke hætten binding af eIF4E og eIF4G eller eIF4F forsamling.
Kombinationen af RAD001 og BEZ235 ikke udviser øget virkning på Hæmning forsamlingen af mTORCs
det er kendt, at samlingen eller sammenslutning af mTOR med sine partnere (f.eks raptor og Rictor) er afgørende for forskellige enzymaktiviteter og biologiske funktioner. RAD001, ligesom rapamycin, undertrykker mTOR signalering ved at inhibere samlingen af mTORCs [16]. Således har vi yderligere besluttet, om kombinationen af RAD001 og BEZ235 udøvede forbedrede hæmmende på samlingen af de mTORCs herunder mTORC1 (mTOR /raptor) og mTORC2 (mTOR /Rictor). Til dette formål, gjorde vi immunopræcipitation (IP) med anti-mTOR antistof til trække ned både mTORC1 og mTORC2 og derefter fulgte med Western blotting at opdage raptor og Rictor i immunopræcipitaterne. Som vist i fig. 6, BEZ235 havde minimale virkninger på at nedbringe niveauerne af raptor og Rictor i immunopræcipitaterne, mens RAD001 væsentligt reduceret niveauerne af både raptor og Rictor trækkes ned af mTOR antistof. Kombinationen af RAD001 og BEZ235 havde samme styrke til RAD001 alene i reduktion af indholdet af raptor og Rictor i immunopræcipitaterne, hvilket indikerer, at kombinationen ikke udviser forbedrede virkninger på hæmme samlingen af mTORC1 og mTORC2.
A549 celler blev behandlet med 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 eller deres kombination. Efter 24 timer blev cellerne høstet til fremstilling af hel-celle proteinlysater og efterfølgende IP-Western blotting.
Diskussion
Udvikling af rapamycin resistens er et kritisk spørgsmål i behandlingen af cancer med rapamycin og dets analoger [17]. BEZ235 er en PI3K og mTOR dual kinaseinhibitor [6]. Vores undersøgelse viste, at BEZ235 hæmmede væksten af rapamycin-resistente celler og induceret apoptose så effektivt som det gjorde i de matchede moderceller. Faktisk rapamycin-resistente celler var lidt mere følsomme end deres parentale celler til BEZ235 (fig. 1). Disse data antyder, at rapamycin-resistente celler ikke krydsresistente over for BEZ235. Da denne cellelinie havde vist sig at være fuldt resistente over for RAD001, vores resultater tyder på, at BEZ235 hæmmer væksten af cancerceller gennem forskellige mekanismer end dem, der medierer virkningerne af rapalogs. Det vil være interessant at vide, om BEZ235 besidder yderligere mekanisme ud over dobbelt hæmning af PI3K og BEZ235. Udover vores data også indebære, at BEZ235 kan anvendes til at overvinde rapamycin resistens.
Selvom BEZ235 hæmmer både PI3K og mTOR, i kombination med RAD001, det udøver synergistiske virkninger i inhibering af væksten af et panel af NSCLC-celler som påvist i en 3-dages monolagskultur (med SRB-assayet) og i et langsigtet 12 dage kolonidannelse assayet (fig. 2 og 3). Denne synergi skyldes sandsynligvis øget virkning på induktion af cellecyklus G1 og apoptose (fig. 2). Efter aftale, kombinationen af RAD001 og BEZ235 var signifikant mere effektiv end hvert middel til inhibering af væksten af NSCLC xenografter i nøgne mus (fig. 4). I dyr undersøgelse, bemærkede vi, at kombinationen oprindeligt forårsagede signifikant tab af legemsvægt (op til 19% af kontrol); imidlertid ved afslutningen af eksperimentet, mus, der modtog kombinationsbehandling syntes at genvinde noget af vægttab (13% af kontrollen). Dette antyder, at mus kan tilpasse og vinder tåler behandlingen med kombinationen af RAD001 og BEZ235. Ikke desto mindre bør vi bevidst potentiale forbedret bivirkninger forårsaget af kombinationen mens kombinationen viser lovende synergistisk anticancer aktivitet.
Behandling tidsplaner kan påvirke det endelige resultat af den givne kombinatorisk terapi. I denne undersøgelse fandt vi, at de sekventielle behandlinger med RAD001 efterfulgt af BEZ235 eller med BEZ235 efterfulgt af RAD001 minimalt inhiberet væksten af NSCLC kolonier; i modsætning hertil samtidig behandling af RAD001 og BEZ235 inhiberes væsentligt væksten af NSCLC kolonier eller eliminerede kolonidannelse (Fig. 3). Dette gælder også for kombinationen af rapamycin og LY294002 (fig. S1). Vores data tyder på, at den samtidige kombination af RAD001 og BEZ235 kan være optimal for den videre udvikling af denne kombination.
IC
50’erne (koncentrationer af at hæmme 50% cellevækst) i BEZ235 i humane NSCLC celler spænder fra 10 nM til 100 nM (vores upublicerede data). I vores kombination eksperimenter, vi typisk brugt dosisområder af BEZ235 (fx 1-10 nM) lave. Ved disse doser BEZ235 havde en svag inhiberende virkning på p-S6 phosphorylering, men ikke modulere p-4EBP1 phosphorylering eller niveauerne af c-Myc og cyclin D1. Ved en dosis på 2 nM, RAD001 hæmmede effektivt phosphorylering af S6 og 4EBP1 (S65), men ikke undertrykke 4EBP1 phosphorylering (T37 /46) og c-myc og cyklin D1 udtryk. Kombinationen af RAD001 og BEZ235 inhiberes effektivt p-4EBP1 phosphorylering (ved T37 /46) og reducerede niveauer af c-myc og cyclin D1 (fig. 5A). Desuden viste vi, at kombinationen af RAD001 og BEZ235 var meget mere potent end enten enkelt middel til inhibering hætten binding af eIF4E og eIF4E eller eIF4F samling (fig. 5B), hvilket indebærer, at kombinationen udøver forstærket inhibitorisk virkning på cap-afhængig initiering . Da c-myc og cyclin D1 vides at blive reguleret af mTOR signalering gennem cap-afhængigt protein translation [18], indikerer vore data, at kombinationen af RAD001 og BEZ235 udøver forstærket effekt på inhibering af mTOR signal- og ekspressionen af dens reguleret onkogene proteiner (fx c-myc og cyclin D1). Denne effekt kan bidrage til synergistisk aktivitet mod vækst af NSCLC celler
in vitro
in vivo
af kombinationen af RAD001 og BEZ235.
I denne undersøgelse RAD001 øget Akt phosphorylering i både A549 og H157 celler; dette er i overensstemmelse med vores tidligere rapporter [9]. Ved de testede koncentrationer (fx 1-10 nM), BEZ235 øget p-Akt niveauer så godt. Denne observation er i overensstemmelse med en tidligere rapport, hvor BEZ235 viste sig at øge Akt fosforylering ved lave doser (fx 10 nm) [19]. Det var tidligere blevet vist, at højere koncentrationer af BEZ235 er behov (fx 100 nM) til at inhibere Akt sammenlignet med (fx 10 nM), der kræves til inhibering S6 phosphorylering [19]. Det fremgår således, at BEZ235 primært besidder mTOR-inhiberende aktivitet ved lave koncentrationer intervaller. Følgelig er det forståeligt, at BEZ235 ved lave koncentrationsområder øger Akt phosphorylering som ville forventes af en rapalog [9], [15]. Interessant, har kombinationen af RAD001 og BEZ235 ikke reducere p-Akt niveauer, som var lige så høje som i celler behandlet med RAD001 eller BEZ235 alene (fig. 5). Da kombinationen af RAD001 og BEZ235 effektivt inhiberer væksten af NSCLC-celler som beskrevet ovenfor, fremgår det, at kombinationen af RAD001 og BEZ235 kan udøve forbedret anticancer-aktivitet med forhøjede niveauer af p-Akt.
mTOR udøver sin kritiske roller i fremme cellecyklusprogression og celledeling primært gennem interaktion med andre proteiner såsom raptor (danner mTORC1) og Rictor (danner mTORC2) [18], [20]. mTORC2 er generelt menes at være ufølsom over for rapalogs [18]. Men langvarig behandling med disse mTOR inhibitorer forstyrrer samlingen af mTORC2 som påvist af os [9] og andre [21]. I denne undersøgelse, efter en 24 timers behandling, RAD001, men ikke BEZ235, effektivt inhiberer samlingen eller aktiviteten af både mTORC1 og mTORC2. Kombinationen af RAD001 og BEZ235 ikke yderligere at reducere niveauerne af raptor og Rictor i immunpræcipitater (Fig. 6), hvilket viser, at kombinationen ikke viser øget virkning på hæmme samlingen af mTORCs. Baseret på disse observationer, vi spekulere, at de forbedrede virkninger på undertrykkelse af mTOR signalering ved kombinationen skyldes sandsynligvis deres særlige virkninger på inhibering af mTORC samling og mTOR kinaseaktivitet. Det er generelt at tro, at en synergi opnås gennem et selskab af to lægemidler fungerer via distinkte mekanismer. Da BEZ235 effektivt hæmmer væksten af rapamycinet-resistente celler, er det også muligt, at synergien mellem RAD001 og BEZ235 mod vækst af lungecancerceller sker gennem en ukendt mekanisme af BEZ235, som kræver yderligere undersøgelse.
sammenfattende har den nuværende undersøgelse viste, at kombinationen af RAD001 og PI3K /mTOR-hæmmer BEZ235 udviser synergistisk hæmning på væksten af NSCLC celler
in vitro
in vivo
og dermed repræsenterer en hidtil ukendt strategi til at forbedre effektiviteten af mTOR-målrettet cancerterapi. Vores resultater giver rationalet for at evaluere denne kombination i kliniske forsøg for patienter med rapalog-følsomme og ildfaste maligniteter.
Støtte Information
Figur S1.
Samtidig kombination af rapamycin og LY294002 er mere effektiv end sekventielle behandlinger i inhibering af dannelsen og væksten af NSCLC kolonier. De angivne cellelinier ved en densitet på ca. 200 celler /brønd blev podet i plader med 24 brønde. På den anden dag blev cellerne behandlet med 1 nM rapamycin (Rap) alene, 5 nM LY294002 (LY) alene, samtidig kombination af rapamycin og LY294002 (Rap + LY), rapamycin i 3 dage og derefter om LY294002 behandling (Rap → LY), LY294002 i 3 dage og derefter om rapamycin behandling (LY → Rap). De samme cykler af behandlingerne blev gentaget hver 3. dag. Efter 12 dage blev pladerne farvet for dannelsen af cellekolonier med krystalviolet farvestof. Billedet af kolonierne blev derefter taget med et digitalt kamera (A) og kolonierne blev talt (
B
)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020899.s001
(PDF)
Tak
TKO, SSR, FRK og S-Y.S.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.