Abstrakt
galectin-3 (Gal-3), en 31 kDa medlem af familien af beta-galactoside- bindende proteiner, er blevet impliceret i progressionen af forskellige humane cancere. Men de foreslåede roller er meget forskellige, lige fra tumor-fremmende cellulære funktioner og negativ indflydelse på patientens prognose for tumor-undertrykkende egenskaber og positiv prognostisk effekt. Vi og andre har tidligere identificeret Gal-3 som overudtrykt i bugspytkirtelkræft sammenlignet med kronisk pancreatitis og normal pancreasvæv. Formålet med denne undersøgelse var således den omfattende analyse af formodede cellulære funktioner af Gal-3 ved forbigående samt stabil dæmpning eller overekspression af Gal-3 i et panel af 6 veletablerede pancreas cancercellelinier. Vore resultater bekræfter, at galectin-3 opreguleres på mRNA-niveauet i bugspytkirtelkræft og udtrykkes kraftigt i størstedelen af pancreascancer cellelinier. I enkelte cellelinjer, forbigående knockdown af Gal-3-ekspression resulterede i moderate hæmmende virkning på proliferation, migration eller forankringsuafhængig vækst af cellerne, men disse effekter var ikke konsekvent i hele spektret af analyserede cellelinier. Desuden blev funktionelle virkninger af modulation af Gal-3-ekspression ikke observeret i stabile Knockdown eller overekspression tilgange
in vitro
og ændrede ikke vækstkarakteristika af nøgne mus xenotransplantattumorer
in vivo
. Vores data derfor ikke støtte en direkte funktionel rolle Gal-3 i den maligne transformation af pancreas epitelceller, selvom parakrine eller systemiske virkninger af Gal-3-ekspression ikke er udelukket
Henvisning:. Hann A, Gruner A Chen Y, Gress TM, Buchholz M (2011) omfattende analyse af Cellular galectin-3 afslører Ingen Konsekvent Onkogen funktion i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 6 (6): e20859. doi: 10,1371 /journal.pone.0020859
Redaktør: Iris Schrijver, Stanford University School of Medicine, USA
Modtaget: April 15, 2011; Accepteret: 10 maj 2011; Udgivet 16. juni, 2011
Copyright: © 2011 Hann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret delvist af den tyske ministerium for uddannelse og forskning (BMBF) inden for rammerne af den NGFN program for medicinsk genomforskning (PaCa-Net; -projektet ID PKB-01GS08) samt EU FP6 tilskud LSHB-CT-2006- 018.771 (Integrated Project “MolDiag-Paca”). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Pancreas ductal adenocarcinom, den mest almindelige form af kræft i bugspytkirtlen, har en samlet 5-års overlevelse på 5%. Over 80% af patienterne stede på et fremskredent sygdomsstadie uden mulighed for potentiel kurativ tumorresektion [1], [2]. Skønt kemoterapi kombineret med en lille-molekyle inhibitor målretning EGF-receptor signalering nylig er blevet vist at resultere i en beskeden, men signifikant stigning i overlevelse med lokalt fremskreden eller metastatiske tumorer, er prognosen forbliver dystre, med median overlevelse på ikke over 6,2 måneder [3] . Således er nye diagnostiske og terapeutiske metoder, der forbedrer resultatet presserende behov.
Familien af beta-galactosid proteiner (Galectins) består af 14 medlemmer i pattedyr. Et fælles træk, der adskiller Galectins fra andre lektiner er deres kulhydrat-anerkendelse domæne. Galectin-3 (Gal-3), den 31. kDa medlem af denne familie, er blevet forbundet med en lang række tumorer, omend med meget forskellige roller [4]. Gal-3 overekspression i cancervæv er blevet forbundet med en dårlig prognose i forskellige typer cancer, herunder hepatocellulært carcinom [5], [6], klarcelle renal carcinoma [7], [8] og blærecancer [9]. Omvendt reducerede Gal-3-ekspression i tumorvæv sammenlignet med normalt væv blev rapporteret i ovariecancer [10], uterin adenocarcinom [11], brystcancer [12], [13] og cervikal neoplasi [14]. I kolorektal cancer, har rapporter været modstridende. Nogle forfattere beskriver en positiv association med høje niveauer af Gal-3-ekspression med avancerede tumor stadier og dårlig prognose [15] – [17], mens andre korrelerer nedsat ekspression af Gal-3 med dårlig prognose [18] – [20]. I mavekræft, Okada et al rapporterede, at reducerede Gal-3-ekspression korreleret med lymfeknude metastaser og avanceret tumor stadie [21], mens to andre grupper identificeret forøget ekspression af Gal-3 i gastrisk kræft, men kunne ikke finde en sammenhæng med histopatologisk differentiering eller tumorprogression [22], [23].
trods de modstridende resultater vedrørende en mulig prognostisk rolle Gal-3-ekspression, er nogle rapporter beskrevet tumorfremmende funktioner af Gal-3 i tumorcellelinjer
in vitro
. Knockdown af Gal-3 resulterede i reduceret migration celle og cellevækst i prostata cancerceller [24], forstærkede apoptose induktion i gastriske cancerceller [25], og inhiberede
in vitro
kolonidannelse samt nøgne mus xenograft induktion i brystcancerceller [26]. Vi og andre har tidligere vist, at Gal-3 konsekvent overudtrykt i bugspytkirtelkræft sammenlignet med både kronisk pancreatitis og normal pancreas [27] – [30]. Imidlertid har undersøgelser en mulig funktionelle rolle af Gal-3 ekspression i bugspytkirtelkræftceller ikke blevet rapporteret. Formålet med denne undersøgelse var således eksperimentelt evaluere effekten af overekspression eller knockdown af Gal-3 i et omfattende sæt af kræft i bugspytkirtlen cellelinier (PATU 8988s, Patu 8988t, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 og MIA PaCa-2). Funktionelle analyser omfattede analyser for cellelevedygtighed, apoptose, proliferation, migration og forankringsuafhængig vækst samt tumorvækst i en xenotransplantat musemodel. Bortset fra isolerede effekter i enkelte cellelinjer, modulation af Gal-3-ekspression havde nogen konsekvent effekt på tumor-relevant karakteristika bugspytkirtelkræftceller.
Materialer og metoder
Humane væv og cellelinier
Den menneskelige pancreas adenocarcinom cellelinie IMIM-PC-1 [31] er venligst leveret af FX Real (Insitute Municipale de Investigacion Medica, Barcelona, Spanien). S2-028 og S2-007 [32] var fra T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). MIA PaCa-2 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, RMD, USA). Patu 8988t og Patu 8988s blev venligst stillet til rådighed af H.P. Elsässer (Institut für Klinische Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps Universität, Marburg, Tyskland). Alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede minimale essentielle medium (GIBCO, Invitrogen Corp., NY, USA) suppleret med 10% FCS (GIBCO, Invitrogen Corp., NY, USA) og gentamicin 0,045 mg /ml (GIBCO, Invitrogen Corp. , NY, USA).
Etik Statement
Kirurgisk resektion pancreas adenocarcinom og kronisk pancreatitis væv blev leveret af de kirurgi afdelinger på universiteterne i Ulm og Homburg /Saar. Normale bugspytkirtel prøver blev opnået fra raske områder ved grænserne af kronisk pancreatitis resectates. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter forud for brug af vævsprøver. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité på universitetet i Ulm, Tyskland (Ethikkommission der Universitaet Ulm) samt den etiske komité på universitetet i Homburg /Saar, Tyskland (Ethikkommission der Universitaet Homburg).
Transfektion cellelinier
Små interfererende RNA (siRNA) blev transficeret i Patu 8988s, S2-007 og S2-028 celler ved anvendelse siLentFect Lipid Reagent (Bio-Rad, Munchen, Tyskland) ifølge producentens protokol. SiRNA transfektion ind MIA PaCa-2-celler blev udført under anvendelse Transmessenger reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) og IMIM-PC-1 celler blev transficeret med X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens protokoller, henholdsvis. De Gal-3-specifikke siRNA’er var: Sigal-3-1, Hs_LGALS3_1 flexirør siRNA SI00470036 og Sigal-3-2, Hs_LGALS3_2 flexirør siRNA SI00470043 (Qiagen). Lyddæmper Negativ kontrol fra Ambion blev anvendt som ikke-silencing kontrol.
Gal-3-ekspressionsvektoren blev konstrueret ved kloning af PCR-amplificerede Gal-3 åbne læseramme ind i pcDNA V3.2 /V5 dest vektor ved anvendelse Gateway rekombination kloning teknologi (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland). Efter transfektion af Patu 8988t celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen), blev selektion af stabilt transficerede cellekloner udført ved tilsætning af 800 ug /ml G418 til dyrkningsmediet.
A Gal-3-specifikke shRNA ekspressionskonstruktion i pGIPZ vektoren blev købt fra Open Biosystems, Huntsville, AL, USA (kat. # RHS4430-99137619). Ikke-silencing shRNAmir (kat. # RHS4348, Open Biosystems) blev anvendt som negativ kontrol. Stabil transfektion af S2-007 celler blev udført under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Stabilt transficerede kloner blev selekteret ved tilsætning hygromycin (400 ug /ml) til dyrkningsmediet.
RNA-ekstraktion og QRT-PCR
RNA fra cellelinier blev ekstraheret under anvendelse peqGold Total RNA Kit (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Tyskland) ifølge producentens protokol. Bulk tumor- vævsprøver blev homogeniseret på tøris /flydende nitrogen under anvendelse af en morter og støder. RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Første-streng cDNA blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA ved anvendelse af Omniscript RT Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Kvantitativ real time PCR (QRT-PCR) blev udført under anvendelse SYBR Green MasterMix (Applied Biosystems, Wellesley, MA, USA) og specifikke primerpar udformet med PrimerExpresss program (Applied Biosystems). Følgende primerpar blev anvendt til QRT-PCR: ribosomale protein, store, P0 (RPLP0) fwd: 5′-TGGGCAAGAACACCATGATG-3 ‘; rev. 5’-AGTTTCTCCAGAGCTGGGTTGT-3 ‘; Galectin-3 fwd: 5’-AGAGGGAATGATGTTGCCTTCC-3 ‘; rev:. ACAATGACTCTCCTGTTGTTCTCATT-3 ‘
Subcellulær fraktionering og immunoblotting
Subcellulær fraktionering blev udført som tidligere [33] beskrevne. Kort beskrevet blev cellerne vasket to gange med iskold PBS og opsamlet ved centrifugering ved 1.600 omdrejninger pr ved 4 ° C. Lysater blev derefter resuspenderet i puffer A (10 mM HEPES pH 7,9; 10 mM KCI; 0,1 mM EDTA; 0,1 mM EGTA; 1 mM DTT; proteinaseinhibitorer) i 15 min og derefter centrifugeret i 20 minutter ved 3.600 omdrejninger pr Supernatanter blev overført til nye kopper og centrifugeret ved 14.000 omdrejninger pr for yderligere 4 min. Pellets blev resuspenderet i 30-100 ml buffer C (20 mM Hepes pH 7,9; 0,4 M NaCI; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM DTT; proteinaseinhibitorer) og inkuberet på is i 30 minutter. Et sidste centrifugeringstrin ved 14.000 rpm i 10 minutter blev udført for at separere kerneproteiner fra cellerester. Til Western blotting blev de resulterende proteinekstrakter nukleare elektroforese gennem en 7,5% SDS-polyacrylamidgel og overført til PVDF Immobilon-P-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) som tidligere beskrevet [34]. Membraner blev probet med enten anti-Gal-3 (muse-monoklonalt, kat. # A3A12, Abcam, Cambridge, UK), anti-ORC2 (polyklonale kanin, kat. # 559.266, BD Biosciences), anti-PARP (kanin polyklonalt, kat . # 9542, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), eller anti-β-actin (muse monoklonalt, kat. # A1978, Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) antistoffer, vasket i TBS vaskebuffer og inkuberet med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer. Forøget kemiluminescens reaktionssystem (Roche) blev anvendt til visualisering. Salg
MTT celleviabilitetstest
Celler blev genpodedes 24 timer efter transfektion i 3,9 cm
2 retter på 60.000 til 100.000 celler /brønd . Efter yderligere 24 timer eller 48 timer af dyrkning blev mediet erstattet med MTT-holdige medium (thiazolyl blå, Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) og retter blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. MTT medium blev erstattet af solubilisering opløsning (10% Triton X-100 (Carl Roth), 0,1 molær saltsyre (Fisher Scientific, Schwerte, Tyskland) opløst i isopropanol (Sigma-Aldrich)) og ekstinktion måles ved 570 nm. 48 h værdier blev divideret med 24 timer værdier til at korrigere for eventuelle variationer i antallet af podede celler.
BrdU celleproliferationsassay
DNA-replikation som et direkte mål for mitotisk aktivitet blev målt ved anvendelse af Cell proliferation ELISA, BrdU kemiluminescens Kit (Sigma) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev 5.000 til 10.000 celler reseeded 24 timer efter transfektion i en 96 brønd μClear plader (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland). BrdU holdigt medium blev tilsat til 4 eller 6 timer. Efter fjernelse af BrdU medium blev celler fikseret i 1 time og efterfølgende inkuberet med peroxidase-konjugeret anti-BrdU-antistof i 1,5 time. Den kemiluminescens reaktionen blev målt i relative lysenheder per sekund (RLU /s).
Trail induceret apoptose
For at extrinsically inducere apoptose i Patu 8988s celler blev 300.000 celler podet i 9,6 cm
2 dyrkningsskåle og behandlet med Trail protein (R CP: kronisk pancreatitis; NP: normal pancreas. Proteinekspression i forskellige pancreas cancer cellelinjer blev bestemt ved Western blot (C) analyser. β-actin blev anvendt som lastning kontrol.
Expression niveau af Gal-3 har ingen indflydelse på tumorcellevækst
in vitro
For at vurdere den funktionelle rolle af udtrykkes afvigende Gal-3 i bugspytkirtelkræftceller, Gal-3 blev forbigående eller stabilt overudtrykt eller tavshed i forskellige bugspytkirtelkræft cellelinjer og analyseret i forskellige
in vitro
funktionelle assays effekter. For forbigående nedregulering blev to uafhængige siRNA sekvenser samt et ikke-lyddæmpende kontrol siRNA anvendes. For hver af de fem cellelinier analyseret (Patu 8988s, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 og MIA PaCa-2), blev transfektionsreagenser og -conditions optimeret til at opnå knockdown effektiviteter 80% (fig. 2A).
(a) forbigående knockdown af Gal-3 blev udført ved transient transfektion af flere cellelinjer under anvendelse af to forskellige Gal-3 specifikke siRNA-sekvenser (Sigal-3 1 og 2) eller en ikke-silencing kontrol siRNA (NC). (B) Stabilt knockdown i S2-007 blev udført ved hjælp af shRNA ekspressionskonstrukter. Tre Gal-3 specifikke shRNA transficerede kloner (shGal-3 1, 2 og 3) og tre nonsilencing kontrol shRNA transficerede kloner (SHC 1, 2 og 3) blev udvalgt til yderligere analyse. (C) Stabil overekspression af Gal-3 blev opnået ved transfektion af Patu 8988t celler med en Gal-3 ekspressionsvektor (pGAL-3 1, 2 og 3) eller et kontrol-vektor (pC 1 og 2). U betegner utransficerede celler. Totale cellelysater blev analyseret ved QRT-PCR (øvre paneler) og Western blot (underpanel) for Gal-3 ekspressionsniveauer. Gal-3-mRNA-niveauer blev bestemt i forhold til RPLP0. Sigal-3 1 og 2 blev normaliseret til NC. β-actin blev anvendt som lastning kontrol for Western blotting.
Stabile Knockdown kloner blev genereret ved hjælp af S2-007 celler transficeret med shRNA sekvenser klonet i pGIPZ vektor. Tre stabilt transficerede kloner samt tre kontrol vektor transficerede kloner blev valgt til yderligere analyse (Fig. 2B).
Siden Patu 8988t celler viste meget lave endogene Gal-3 niveauer, blev denne cellelinje valgt til konstruktion af stabil Gal-3 overudtrykkende kloner. Tre uafhængige kloner blev etableret. To af disse viste moderat overekspression af rekombinant Gal-3 på mRNA-niveau, som var meget mere udtalt på proteinniveauet (Fig. 2C, bane 4, 6). Den resterende klon viste ikke mærkbar udtryk for rekombinant Gal-3 (fig. 2C, bane 5), men blev inkluderet i yderligere eksperimenter som ekstra kontrol klon. Interessant kontrol kloner transficeret med tom vektor viste også noget forhøjede Gal-3 niveauer (fig. 2C, bane 2, 3).
I en første funktionel analyse indflydelse af Gal-3-ekspression på cellelevedygtigheden var analyseret ved MTT-assays. Hverken forbigående knockdown i nogen af de 5 testede cellelinjer, heller ikke stabil knockdown i S2-007 celler eller stabil overekspression i Patu 8988t celler haft nogen væsentlig effekt på celle levedygtighed under normale dyrkningsbetingelser i forhold til de egnede kontroller (Fig. 3 A- C).
Transient Gal-3 tavshed cellelinjer (A), stabilt Gal-3 lyddæmpet S2-007 cellekloner (B) eller stabilt Gal-3 overudtrykker PATU 8988t cellekloner (C) blev dyrket i 24 og 48 timer efterfulgt af inkubering med MTT reagenset. 48 h værdier blev divideret med 24 t værdier (for at korrigere for eventuelle variationer i antal seedede celler) og normaliseret til at styre siRNA transficerede celler (NC). Værdier af stabile Gal-3 knockdown cellekloner (shGal-3 1, 2 og 3) og stabile Gal-3 overudtrykkende cellekloner (pGAL-3 1, 2 og 3) blev normaliseret til gennemsnittet af kontrolvektoren transficeret stabile cellekloner ( SHC 1, 2, 3 og PC 1, 2) hhv. Data omfatter mindst tre uafhængige forsøg.
Analyse af celleproliferation ved hjælp af BrdU-assays afslørede en moderat, men signifikant inhibering af proliferative aktivitet i S2-028 celler efter knockdown af Gal-3 (fig. 4A , panel 3). Men tendensen til reduceret proliferation nåede ikke betydning i Patu 8988s og S2-007 celler, var fraværende i IMIM-PC-en og endda vendt i MIA PaCa-2-celler (fig. 4A). Hverken stabil knockdown i S2-007 celler, heller ikke stabil overekspression af Gal-3 i Patu 8988t celler havde nogen signifikant virkning på spredning af de resulterende celle kloner.
Forbigående Gal-3 tavshed cellelinjer (A), stabilt Gal-3 lyddæmpet S2-007 cellekloner (B) eller stabilt Gal-3 overudtrykker PATU 8988t celle kloner (C) blev dyrket med BrdU agent for 2 eller 4 timer. BrdU-inkorporering ved prolifererende celler blev målt ved ELISA. Værdier for celler transient transficeret med forskellige Gal-3 specifikke siRNA’er (Sigal-3 1 og 2) blev normaliseret til kontrol siRNA transficerede celler (NC). Værdier af stabile Gal-3 knockdown cellekloner (shGal-3 1, 2 og 3) og stabile Gal-3 overudtrykkende cellekloner (pGAL-3 1, 2 og 3) blev normaliseret til gennemsnittet af kontrolvektoren transficeret stabile cellekloner ( SHC 1, 2, 3 og PC 1, 2) hhv. Dataene omfatter mindst tre uafhængige forsøg. * Angiver
s
0,05 sammenlignet med kontrol siRNA transfekterede celler (dobbeltsidet uparret
t
-test)
Ligeledes forbigående Gal-3. knockdown havde ingen virkning på apoptotisk aktivitet (som målt ved PARP-spaltning) af Patu 8988s celler i fravær (fig. 5, bane 1-4) eller nærvær (fig. 5, bane 5-8) af det ydre apoptoseinducer Trail. PARP-spaltning blev induceret ved transfektionsproceduren og var mere udtalt i nærvær af Trail (fig. 5, bane 2 og 6), men ikke yderligere forøget ved knockdown af Gal-3 (fig. 5, bane 3-4 og 7 -8). Salg
celler transient transficeret med Gal-3 specifikke siRNA’er (Sigal-3 1 og 2), nonsilencing kontrol siRNA (NC) eller utransficerede celler (U) blev analyseret ved Western blot for poly ADP-ribose polymerase (PARP) spaltning. Øget spaltning, angivet ved det forbedrede signal af det nederste bånd, blev set i alle transficerede celler. PARP spaltning blev forbedret ved behandling med den ydre apoptose inducer Trail, men blev ikke påvirket af Gal-3 knockdown. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. De viste resultater er repræsentative for tre individuelle eksperimenter.
Replikering af dette sæt af eksperimenter under serum-fri betingelser producerede lignende resultater, ikke at påvise nogen konsekvent indflydelse modulation af Gal-3-ekspression på cellevækst eller apoptose i de testede cellelinier (data ikke vist).
inkonsekvent effekt af Gal-3 på cellemigrering
Vi ext analyseret indflydelse af Gal-3-ekspression på cellemigration i et Boyden kammer assay. Kunne celler der vandrer gennem et filter langs en føtalt kalveserum gradient. Antal transient Gal-3 tavshed migrerede celler blev normaliseret til ikke-silencing kontrol siRNA transficerede celler. Forbigående knockdown af Gal-3 resulterede i en tendens mod reduceret cellemigration i tre ud af fem analyserede cellelinier, selv om denne virkning ikke nåede signifikans i de fleste tilfælde (fig. 6A). Desuden blev denne effekt ikke gengivet i S2-007 celle kloner med stabil Gal-3 knockdown (fig. 6, B). Omvendt analogi til resultaterne af de forbigående Knockdown eksperimenter, stabil overekspression af Gal-3 i Patu 8988t celler inducerede en tendens til øget celle migration (fig. 6, C), selv om denne tendens igen nåede ikke signifikans og var også tydelig i klon pGAL-3 2, som viste lav eller fraværende ekspression af rekombinant Gal-3 (se fig. 2C). Tilsammen modulering af Gal-3-ekspression havde en mild og snarere inkonsekvent effekt i Boyden kammer assays, således at argumentere imod en vigtig rolle for cellulær Gal-3 i dirigeret migration af bugspytkirtelkræftceller.
Transient Gal- 3 tavshed cellelinjer (A), stabilt Gal-3 lyddæmpet S2-007 cellekloner (B) eller stabilt Gal-3 overudtrykker PATU 8988t celle kloner (C) blev dyrket i Boyden-kammer skær til 2 eller 4 timer. Celler migrerer gennem porerne på indsatsene langs en kalvefosterserum gradient blev fikseret, farvet methylenblåt og talt under anvendelse af lysmikroskopi. Antal migrerede celler transient transficeret med forskellige Gal-3-specifikke siRNA (Sigal-3 1 og 2), blev normaliseret for at kontrollere siRNA transficerede celler (NC). Migrerede stabile Gal-3 Knockdown celler (shGal-3 1, 2 og 3) og stabile Gal-3 overudtrykkende celler (pGAL-3 1, 2 og 3) blev normaliseret til gennemsnittet af kontrolvektoren transficeret stabilt cellekloner (SHC 1, 2, 3 og PC 1, 2) hhv. Dataene omfatter mindst tre uafhængige forsøg. * Angiver
s
0,05 sammenlignet med kontrol siRNA transfekterede celler (dobbeltsidet uparret
t
-test)
Hæmning af Gal-3-ekspression. svækker forankring uafhængig vækst i en delmængde af bugspytkirtelkræft cellelinjer men har ingen effekt på væksten af xenotransplantattumorer
in vivo
potentialet for forankringsuafhængig vækst af kræftceller blev vurderet ved at evaluere antallet af kolonier dannet i blød agar-assays. Forbigående knockdown af Gal-3 resulterede i en klar reduktion i kolonidannelse kapacitet for cellelinier Patu 8988s, S2-007 og IMIM-PC-1, med den stærkeste effekt og højeste statistisk signifikans observeret for S2-007 celler (Fig. 7A ). Omvendt blev S2-028 og MIA PaCa-2-celler ikke påvirket af Gal-3 knockdown. Da tidligere rapporter havde tilkendegivet, at tumorfremmende funktioner af Gal-3 i andre cellesystemer kan afhænge af den subcellulære lokalisering af proteinet [26], [36], [37], vi undersøgt, om den differentierede virkning af Gal-3 knockdown kolonidannende kapacitet korreleret med forskellige subcellulære lokalisering af Gal-3 i de testede cellelinier. Gal-3 protein blev jævnt fordelt mellem kerne og cytosol i MIA Paca-2 og S2-007 celler og var lidt overrepræsenteret i de cytosoliske fraktioner i Patu 8988s, S2-028 og IMIM-PC-1-celler (fig. 7B), således viser ingen sammenhæng med følsomhed over for Gal-3 knockdown.
(A) Gal-3 blev forbigående tavshed i bugspytkirtelkræft cellelinjer bruger to uafhængige siRNA sekvenser (Sigal-3 1 og 2). Knockdown og kontrolceller blev podet i blød agar og kolonidannelse vurderes efter 7 dage. Resultater blev normaliseret til kontrol siRNA transficerede celler (NC). Dataene omfatter mindst tre uafhængige forsøg. * Angiver p 0,05 sammenlignet med kontrol siRNA transficerede celler (dobbeltsidet uparret
t
-test). (B) Western blot-analyse af nukleare (n) og cytoplasmatiske (C) proteinfraktioner afledt af pancreatiske cancercellelinier. Gal-3 er vist i den øverste bane. p-actin-farvning blev anvendt som indlæsning kontrol. Farvning for den nukleare faktor ORC2 blev anvendt til at vurdere renheden af de subcellulære fraktioner. (C) xenograft tumorer blev induceret i nøgne mus ved subkutan injektion af to stabile Gal-3 knockdown S2-007 cellekloner (shGal-3 2 og 3) og to nonsilencing kontrol shRNA transficerede S2-007 kloner (SHC 2 og 3). Seks mus pr forsøgsgruppe blev analyseret. Box-og-knurhår plots illustrerer tumorvolumener på dag 22 efter injektion. Whiskers betegne 1,5 × interkvartile område (IQR). Værdier uden for dette område er vist som udfyldte trekanter. (D) Gal-3 mRNA-niveauer i bulk væv af xenotransplantattumorer hvor bestemt ved QRT-PCR. RPLP0 blev anvendt som reference-genet.
Vi derefter testet, hvis effekt på forankringsuafhængig vækst i S2-007 celler også oversat til forskelle i tumorvækst
in vivo
.
i dette øjemed xenotransplantattumorer blev induceret i nøgne mus ved subkutan injektion af S2-007 celler med stabile Gal-3 knockdown eller kontrol vektor-transficerede celler. Ingen signifikant forskel i tumorvolumener mellem Gal-3 Knockdown og kontrol tumorer blev observeret (fig. 7C). Histologisk undersøgelse af tumorerne også viste ingen systematiske forskelle i differentiering, lokal invasiv eller mikrokar tæthed mellem de forskellige grupper (data ikke vist).
For at bekræfte vedvarende reduktion af Gal-3 niveauer i knockdown tumorer, mRNA blev fremstillet ud fra bulk-tumorvæv og analyseret ved QRT-PCR. Som forventet, Gal-3 mRNA-niveauer var signifikant lavere i tumorerne afledt fra S2-007 knockdown kloner end i dem, der stammer fra kontrol vektor-transficerede kloner (fig. 7D).
Diskussion
Deregulering af Gal-3-ekspression er blevet beskrevet i adskillige humane cancere, skønt den prognostiske betydning af de observerede ændringer stadig anledning til kontrovers [37], [38]. Pancreas duktalt adenokarcinom er blandt de humane tumorer, hvor en betydelig overekspression af Gal-3 både på mRNA samt på proteinniveauet er veletableret [27], [30]. Vore egne resultater fra microarray analyser af Mikrodissekterede pancreas tumorvæv indikerede, at Gal-3 udtrykkes af selve tumorcellerne snarere end af stromacellerne som typisk udgør hovedparten af tumoren [28]. I den aktuelle undersøgelse, bekræfter vi overekspression af Gal-3 mRNA i tumorvæv ved QRT-PCR og viser, at stærke Gal-3-ekspression er bevaret i de fleste af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer
in vitro
.
Som det er tilfældet med oplysninger om den prognostiske rolle i cancer, rapporter om formodede cellulære funktioner i Gal-3 i kræftceller er delvist usikkert eller endda modstridende. Mens Honjo et al. rapport tab af (serum-uafhængige) proliferative kapacitet og ophævelsen af forankringsuafhængig vækst i brystkræftceller efter lyddæmpning af Gal-3 udtryk [26], Matarrese et al. observerede ikke nogen forskel i cellevækst eller proliferation ved modulering af Gal-3-ekspression, men beskriver forbedret resistens over for apoptose efter overekspression af Gal-3 [36]. Ligeledes er den samme gruppe, der blev observeret de væksthæmmende effekter af Gal-3 nedregulering i brystcancerceller beskrevne stærke antitumorvirkninger af Gal-3 knockdown i prostatacancerceller, herunder reduceret cellemigration, invasion, celleproliferation, forankringsuafhængig koloni dannelse, og tumorvækst i nøgne mus xenotransplantater [24]. I modsætning hertil Califice et al. ikke observere nogen effekt af Gal -3 udtryk på spredning af prostata cancer celler i en hvilken som helst konstellation, og rapporterede, at Matrigel invasion, forankringsuafhængig vækst og nøgne mus xenograft dannelse blev forfremmet kun af cytoplasmatisk Gal-3-ekspression, mens nuklear lokalisering af Gal -3 havde den modsatte virkning [37].
et fælles tema i mange af disse undersøgelser er, at der ofte er meget få eller kun en enkelt cellelinje blev analyseret, og at nogle af virkningerne kun blev observeret under meget specifikke eksperimentelle betingelser.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.