PLoS ONE: Blodpladeadhæsion og Degranulering Fremkald Pro-overlevelse og Pro-angiogenetisk Signalering i kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Trombose er almindelig i kræft i æggestokkene. Men interaktionen af ​​blodplader med ovariecancerceller er ikke kritisk undersøgt. For at løse dette, vi undersøgte blodplade interaktioner i en række æggestokkene kræft cellelinjer med forskellige metastatiske potentialer [Hio-80, 59m, SK-OV-3, A2780, A2780cis]. Blodplader klæbet til ovariecancerceller med den mest signifikante vedhæftning til 59m cellelinie. Ovariecancerceller induceret blodpladeaktivering [P-selektinekspression] på en dosisafhængig måde, med den mest betydende aktivering ses som reaktion på 59m cellelinie. De blodplade-antagonister [cangrelor, MRS2179, og apyrase] hæmmede 59 celle induceret aktivering antyder en P2Y12 og P2Y1 receptor medieret mekanisme for trombocytaktivering afhængig frigivelse af ADP med 59 celler. A2780 og 59m celler forstærkes PAR-1, PAR-4, og TxA2 receptor blodpladeaktivering, men havde ingen virkning på ADP, epinephrin, eller collagen-induceret aktivering. Analyse af genekspression ændringer i ovariecancerceller efter behandling med vaskede blodplader eller blodplade frigjort viste en subtil men gyldig opregulering af anti-apoptotisk, anti-autofagi pro-angiogene, pro-cellecyklus og metaboliske gener. Således ovariecancerceller med forskellige metastatisk potentiale overholde og aktivere blodplader forskelligt mens begge blodplader og blodplader frigjort mægle pro-overlevelse og pro-angiogene signaler i æggestokkene cancerceller

Henvisning:. Egan K, Crowley D, Smyth P , O’Toole S, Spillane C, Martin C, et al. (2011) Blodpladeadhæsion og Degranulering Fremkald Pro-overlevelse og Pro-angiogenetisk Signalering i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 6 (10): e26125. doi: 10,1371 /journal.pone.0026125

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Modtaget: May 10, 2011; Accepteret: September 20, 2011; Udgivet: 12 oktober 2011

Copyright: © 2011 Egan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Science Foundation Ireland [SFI] som en del af Biomedical Diagnostics Institute [BDI-2 Center for Videnskab Excellence og Teknologi (CSET)]. KE er støttet gennem National Biophotonics og Imaging Platform, Irland, og finansieret af den irske regerings program for forskning i tredje niveau Institutioner, Cyklus 4, National Development Plan 2007-2013. DC er støttet af Health Research Board (Irland) Scholars Program: Molekylær Medicin – fra gener til at fungere. BF og LMcE understøttes af Emer Casey Foundation, Irland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræft dødsfald hos kvinder [1]. Det er den mest almindelige gynækologisk malignitet og har den højeste dødelighed til tilfælde forholdet mellem alle gynækologiske maligniteter. Den dårlige overlevelse er resultatet af sene stadie diagnoser. De fleste patienter er asymptomatiske indtil sygdommen har spredt [2]. Spredning af ovariecancer er blevet overvejet at forekomme primært i peritoneum [3]. Men obduktionen og billeddiagnostiske undersøgelser [4], samt bevis for tilstedeværelsen af ​​micrometastases i knoglen aspirater af patienter tidligt stadie ovariecancer [5] tyder på, at hæmatogen metastasering er mere udbredt end hidtil antaget.

Under hæmatogen spredning, er evnen af ​​cirkulerende tumorceller til at interagere med blodplader menes at fremme deres overlevelse i cirkulationen og dermed lette metastase. eksperimenter prækliniske dyreforsøg har vist, at farmakologisk [6] eller genetisk [7] induceret trombocytopeni, samt defekter i blodpladefunktion [7] – [10] er forbundet med reduceret metastase. Samspillet af kræftceller med blodplader menes at indebære en række fordele, der fremmer vellykket metastase, herunder beskyttelse mod immunologisk overfald og unddragelse af immun overvågning [11], [12], frigivelse af vækst, angiogene, og vaskulære permeabilitet faktorer under aktivering og degranulering [13]

Trombose og trombocytose er hyppige komplikationer af kræft i æggestokkene og er forbundet med dårlig prognose [14] – [16]., fremhæver betydningen af ​​blodplader i patologi kræft i æggestokkene. Men interaktionen mellem blodplader og ovariecancerceller er ikke blevet godt undersøgt. I denne undersøgelse var det et mål at karakterisere interaktionen af ​​blodplader med ovarieceller, ved anvendelse af en normal ovariecellelinie [HIO-80] og ovariecancerceller linjer med forskellige biologiske egenskaber og metastatiske potentialer [59m, SK-OV-3, A2780, og A2780cis].

for det første, vi studerede blodpladeadhæsion til æggestokkene cancerceller under statiske betingelser for at afgøre, om en klæbende vekselvirkning mellem blodplader og ovariecancerceller eksisterer. For det andet, vi vurderede evne ovariecancerceller at fremkalde trombocyt aktivering og degranulering [P-selektinekspression]. Efter at have konstateret, at blodplader klæber til æggestokkene kræftceller, og ovariecancer celler er i stand til at fremkalde trombocyt aktivering og degranulering, vi næste vurderet genekspression ændringer på transkriptomet niveau i kræft i æggestokkene celler behandlet med blodplader eller blodplade releasat. Vores resultater viser differentielle interaktioner mellem blodplader og æggestokkræft cellelinjer, ikke blot med hensyn til blodpladeadhæsion og aktivering, men også i genekspression ændringer i cancerceller behandlet med vaskede blodplader eller blodplade releasat. Flere interaktioner forekomme mellem blodplader og ovariecancerceller herunder faktorer frigivet af blodplader og cancerceller, såvel som direkte blodplade-ovarie celle-interaktioner. Denne interaktion resulterer i en pro-overlevelse, pro-angiogene signal til æggestokkene kræftcelle.

Metoder

Etik erklæring

Blood samling til denne undersøgelse blev godkendt af Royal College of Surgeons i Irland etiske udvalg og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle donorer før tapning.

reagenser

alle reagenser blev købt fra Sigma-Aldrich [St Louis, MO, USA] medmindre andet er angivet. Collagen [opløseligt kalveskind], adenosin-5′-diphosphat, epinephrin og arachidonsyre blev opnået fra BioData [Horsham, PA, USA]. Alexa Fluor-488-mærket Phalloidin, Calcein AM, og fibrinogen blev opnået fra Invitrogen [Carlsbad, CA, USA]. Phycoerythrin [PE] -mærket anti human P-selectin [muse IgG], PE-mærket muse-IgG-isotype-kontrol, og PE-mærket anti human CD42a [muse IgG] antistoffer blev indkøbt fra BD Pharmingen [San Diego, CA, USA]. Salg

cellelinjer

Et udvalg af æggestokkene cellelinier af epitel oprindelse blev valgt til at indgå i denne undersøgelse som epitelial ovariecancer er den mest almindelige histologiske type. HIO-80 [en gave fra Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA] repræsenterer en ikke-tumorigen normalt humant ovarie epitelcellelinje, som er blevet immortaliseret ved transfektion med et plasmid, der koder for SV40 store T-gen. De HIO-80 celler blev holdt i en 01:01 blanding af medium 199 og MCDB-105 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 0,2 IU /ml af rekombinant humant insulin som anbefalet af Fox Chase. 59m [europæisk samling af cellekulturer (ECACC), Salisbury, UK] repræsenterer en tumorigen human ovarie epithelial carcinoma endometrioide typen med klare cellekomponenter oprindeligt isoleret fra ascites fra en 65 år gammel patient med metastatisk ovariecancer. 59m celler blev holdt i DMEM, 1 g glucose /l, suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin som anbefalet af ECACC. SK-OV-3 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA] repræsenterer en tumorigen human ovarie epitel adenocarcinom, oprindeligt isoleret fra ascites fra en 64-årig patient med metastatisk ovariecancer. SK-OV-3 blev dyrket med McCoys 5A medium, suppleret med 10% føtalt bovint serum [Invitrogen, Holland], 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin som anbefalet af ATCC. A2780 [ECACC, Salisbury, UK] er afledt af et ovarie serøs epiteltumor væv i en ubehandlet patient. Den cisplatin-resistente cellelinje A2780cis blev udviklet af kronisk eksponering af forælder cisplatin-sensitive A2780 cellelinie til stigende koncentrationer af cisplatin. Begge cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin som anbefalet af ECACC. Alle cellelinier blev dyrket i standardbetingelser i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C.

blodpladefremstilling

Blod blev opnået fra raske donorer, der ikke havde taget medicin kendt for at påvirke trombocytfunktionen i mindst 10 dage. Blod blev opsamlet ved venepunktur gennem en 19-gauge butterfly nål uden årepresse, at undgå blodpladeaktivering. Blodplader blev fremstillet som tidligere beskrevet [17]. Kort fortalt, til fremstilling af blodpladerigt plasma [PRP] blev blod opsamlet i en sprøjte indeholdende 3,2% trinatriumcitrat som antikoagulant [10% vol /vol, derefter centrifugeret ved 170 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Til fremstilling af vaskede blodplader blev blod opsamlet i Acid-citrat-dextrose [ACD: 38 mM citronsyre, 75 mM natriumcitrat, 124 mM D-glucose] som antikoagulant [15% vol /vol]. Blod blev centrifugeret ved 170 g i 10 minutter ved stuetemperatur. PRP blev forsuret til pH 6,5 med ACD, og ​​PGE

1 [1 pM] blev tilsat for at undgå blodpladeaktivering under centrifugering. Blodplader blev pelleteret ved centrifugering ved 720 g i 10 minutter. Supernatanten blev fjernet, og blodpladepelleten blev gensuspenderet i JNL puffer [130 mM NaCl, 10 mM natriumcitrat, 9 mM NaHCO

3, 6 mM D-glucose, og 0,9 mM MgCl

2, 0,81 mM KH

2PO

4, og 10 mM Tris, pH 7,4] til en koncentration på 2,5 × 10

8 /mL og suppleret med 1,8 mM CaCl

2.

Blodpladeadhæsion assay

blodpladeadhæsion assay blev udført som tidligere beskrevet [18]. Kort fortalt blev ovarieceller podet i en plade med 96 [Nunc, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Tyskland] ved en koncentration på 5 × 10

4 /ml og dyrket indtil sammenflydning. Vaskede blodplader [1,5 × 10

8 /ml] præinstalleret med Calcein AM [2 ug /ml] fik lov til at holde sig til cellerne i 45 minutter ved 37 ° C. Den totale fluorescens [485/535 nm] pr brønd blev målt under anvendelse af en Wallac 1420 Victor2 ™ multilabel counter [Perkin Elmer, Waltham, MA., USA] pladelæser. Pladen blev vasket tre gange, 100 ml JNL blev tilsat til hver brønd i pladen, og den resterende fluorescens blev aflæst. % Blodpladeadhæsion blev beregnet som [resterende fluorescens – blank] /[total fluorescens – blank] × 100. Blodpladeadhæsion til ovarieceller blev afbildet ved fluorescensmikroskopi. Når sammenflydende, celler blev løsnet med 7 mM EDTA i Dulbeccos PBS, vasket to gange og resuspenderet i JNL suppleret med 1,8 mM CaCl

2. Celler [1 × 10

5 /ml] blev inkuberet på en BSA coatet poly-L-lysin objektglas i 45 minutter ved 37 ° C. Efter adhæsion, vaskede blodplader [50 × 10

6 /pl] blev tilsat til objektglasset og inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C. Prøver blev fikseret med 3,7% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur og permeabiliseres med 0,1% Triton X-100. Blodplader og ovarieceller blev farvet med Alexa Fluor-488 Phalloidin [41,25 nM,] i 15 minutter ved stuetemperatur. Blodplader blev specifikt farvet med phycoerythrin mærket anti-humant CD42a-antistof [1,25 ug /ml] i 2 timer ved 37 ° C. Objektglassene blev monteret og afbildes ved fluorescensmikroskopi.

Blodpladeaktivering

evne ovariecancerceller at inducere blodpladeaktivering (P-selektinekspression) blev bedømt ved en flowcytometri baseret assay modificeret fra Nylander et al [19]. I et totalt reaktionsvolumen på 100 pi blev 10 pi af PRP inkuberet med ovariecancerceller [0 – 1,5 gange 10

6 /ml,] i nærvær af en PE-mærket anti human P-selectin antistof [1,25 ug /ml] eller en passende isotypekontrol [1,25 ug /ml]. Alle inkubationer blev udført ved stuetemperatur i 15 minutter. Reaktionen blev derefter afsluttet med 1 ml JNL puffer inden analyse ved flowcytometri. Prøver blev analyseret under anvendelse af en BD FACS Calibur [Becton Dickinson, Palo Alto, CA, USA] inden for 1 time. Instrumentet blev sat til at måle størrelse [forward scatter, FSC], granularitet [sidespredning, SSC] og celle fluorescens. Ved hjælp af en log FSC- versus log SSC punktdiagram blev en todimensionel analyse gate trukket omkring trombocyt befolkning, og en fluorescens histogram [log FL2 vs. count] blev opnået for 10000 blodplade begivenheder for hver prøve. Dataene blev analyseret ved anvendelse CellQuest Pro software og udtrykt som procentdel af blodplader, der var P-selectin positiv i forhold til isotypekontrol.

Isolering af blodplade releasat

Vaskede blodplader [2,5 × 10

8 /ml] blev stimuleret med både TRAP [trombinreceptoraktiveringspeptid, 20 uM] og kollagen [190 ug /ml] og omrørt i en BioData PAP-4 lystransmission aggregometer [Horsham, PA, USA] ved 37 ° C i 15 minutter. Blodplade aggregat blev centrifugeret ved 720 g i 10 minutter. Supernatanten blev derpå aspireret og filtreret gennem et sprøjtefilter med et 0,22 um PVDF-membran for at fjerne blodplademikropartiklerne.

MTT assay

For at optimere koncentrationen af ​​blodplade frigjorte materiale for tumorcelle eksponering, en serie af MTT celleproliferationsanalyser [Roche Diagnostics Ltd, det Forenede Kongerige] blev udført ifølge producentens instruktioner for at bestemme den maksimale koncentration, der kan anvendes på celler uden negativ indvirkning på cellevækst eller overlevelse. Celler blev podet i 96-brønds celledyrkningsplader på 2 × 10

4 celler /brønd og dyrket i 24 timer for at tillade cellevedhæftning. Når fastgjort til pladerne, vækstmedier blev opsuget, og cellerne blev kortvarigt vasket med 200 pi præ opvarmet PBS. Celler blev derefter udsat for seriefortyndinger af blodplade releasat fra 1:10 til 1:10,000 i fuld medier, serumfrie medier eller JNL buffer at give en optimal koncentration, der skal anvendes i efterfølgende genekspression baserede eksempler.

Washed blodplader /blodplader frigjort eksponering for genekspression analyse

Den optimale koncentration af blodplader frigjorte [bestemt af MTT] blev anvendt på cellelinjer og niveauerne af apoptose blev sammenlignet mod celler dyrket i fuld medier kun ved hjælp af en Roche Apodirect TUNEL /Propidiumiodid kit. Som det blev observeret 1:1000 fortynding af blodplade frigjorte materiale i fuld vækst medier for at være den højeste koncentration af blodplade frigjorte materiale i fuld medie, der ikke indflydelse på cellevækst /levedygtighed for alle cellelinier og blev efterfølgende vist at resultere i ingen signifikant forskel i apoptose sammenlignet med celler dyrket i fuld medier alene blev det fastslået, at det var egnet til at gå videre med denne koncentration. Eftersom blodplade frigjort blev fremstillet ud fra identiske vasket blodpladepræparater, den 1:1000 fortynding af blodplade frigjorte materiale direkte informerer anvendelsen af ​​en 1:1000 fortynding af vaskede blodplader til sammenlignende undersøgelse. Optimale koncentrationer af blodplade releasat og vaskede blodplader [1:1000] suspenderet helt dyrkningsmedier og anvendes til dyrkede celler i 75 cm

2 kolber i tre eksemplarer. Celler blev udsat for det frigjorte materiale eller vaskes blodplader i 6 timer, hvorefter totalt RNA blev ekstraheret fra cellerne. Transkriptom analyse blev udført ved anvendelse af Affymetrix Humane Exon Arrays.

RNA-ekstraktion

Celler blev vasket kortvarigt i PBS, trypsiniseret og centrifugeret for at fjerne supernatanten. RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy mini kit [Qiagen Ltd., West Sussex, UK] i henhold til fabrikantens protokol. RNA mængde blev vurderet ved hjælp af et Nano-Drop ND-1000 spektrofotometer [Wilmington, USA], og kvaliteten af ​​en Agilent Bioanalyser 2100 og RNA 6000 Nano mikrofluid chip assay [Santa Clara, USA]. RNA blev opbevaret ved -80 ° C.

Affymetrix matrix

100 ng totalt RNA ekstraheret fra kontrolceller og celler udsat for vaskede blodplader /blodplade frigjort blev mærket under anvendelse af Ambion WT Expression kit [ ,,,0],Ambion /Life Technologies, Austin, TX, USA] inklusive kontrolgruppen mærkning fra Affymetrix Gene Chip Poly-A RNA kontrol Kit. Som foreslået af Affymetrix /Ambion, på hvert trin af prøven forberedelse protokol blev fremskridt overvåges ved hjælp både Agilent 2100 Bioanalyzer og NanoDrop spektrofotometer. Kvalitetskontrol [QC] kræves en vurdering efter den første cyklus RNA oprydning, efter den anden cyklus single-cDNA oprydning og efter ssDNA fragmentering. Forberedt fragmenteret ssDNA blev hybridiseret til Affymetrix Humant Exon 1.0 ST Array ved 45 ° C i 16 timer efter Affymetrix protokoller for deres GeneChip WT Terminal Mærkning, GeneChip Hybridisering Kontrol og GeneChip Hybridisering, Wash, og Stain kits [Affymetrix, Santa Clara, USA] . Efter hybridisering blev chips vasket og farvet under anvendelse af Affymetrix GeneChip Fluidik Station med passende 64 format assay-protokol. Efter farvning og vask trin Affymetrix GeneChip Scanner 3000 og Affymetrix GeneChip Operating Software blev anvendt til forvaltning og indledende behandling af udtrykket data. Data fra 45 exon arrays var genstand for matrix kvalitetskontrol udføres ved hjælp af Affymetrix Expression Console. Alle kontroller var inden for parametrene foreslået af Affymetrix. Efter en vellykket kvalitetskontrol standarder vurdering blev chip data derefter analyseret i dybden ved hjælp Biotique Systems XRAY analyse software. Hver cellelinje blev undersøgt under tre forskellige betingelser; hvilende celler, celler udsat for blodplade releasat og celler udsat for vaskede blodplader. Hver cellelinie og tilstand blev analyseret tre gange. Softwaren blev anvendt til at sammenligne de to eksponering kohorter mod den hvilende kontrol og gener, der udviser en positiv eller negativ gange ændring på mere end 1,5 og en signifikans på p ≤ 0,05 undersøgt.

Fluidigm validering

genekspression blev valideret ved hjælp Fluidigm s high throughput qPCR 48,48 dynamisk array system. Gener, der viser de væsentligste fold ændringer i tillæg til gener involveret i biologisk relevante veje blev udvalgt til validering. TaqMan® real-time PCR ekspressionsassays blev brugt i forbindelse med Fluidigm s mikrofluid Biomark system. Prøver blev analyseret i tre eksemplarer og resultaterne blev sammenlignet med Affymetrix udtryk data. RNA blev revers transkriberet til enkeltstrenget cDNA ved anvendelse af en høj kapacitet cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] i 100 pi reaktioner. Reaktioner indeholdt 10 pi puffer [10 ×], 4 pi deoxynukleotidtriphosphat [25 ×], 10 pi vilkårlige primere [10 ×], 5 pi multiscribe RT-enzym [50 U /pl], 21 pi nuclease-free vand og 50 pi ekstraheret total RNA [20 ng /pl]. Før Fluidigm, high throughput qPCR, en præ-amplifikation blev udført efter Fluidigm protokoller; 1 ml TaqMan assay for hvert af generne af interesse identificeres ved XRAY analyse og endogene kontroller blev samlet og gjort til et endeligt volumen på 100 ml i 1 × TE Buffer, pH 8,0. 1,25 ml af hver prøve blev tilsat til 2,5 ml Preamp Master Mix [AB] og 1,25 ml pooled assay mix til opnåelse af en 5 ml reaktionsvolumen. Denne blanding blev derefter underkastet 14 amplifikationscykler ved 95 ° C, 15 sekunder og 60 ° C 4 minutter, før den blev fortyndet 1:05 med DNAse og RNase-frit H

20 for at give et endeligt volumen på 25 ml præ- amplificeret cDNA. Fluidigm data blev analyseret ved hjælp Fluidigm Real-Time PCR Analysis software [ver3.02] for at give relative kvantificering værdier kalibreret til normale [HIO-80] celler. Fold ændringer vendt tilbage fra Affymetrix analyse blev plottet mod dem, der beregnes fra Fluidigm data og sammenhængen mellem værdierne blev beregnet ved hjælp af Graph Pad Prism [ver 5.02].

Epithelial mesenkymal overgang [EMT] ekspressionsanalyse i blodplade sløret /frigjorte behandlede celler

processen med EMT er kritisk i den metastatiske kaskade, ved at lette indtrængen af ​​celler i det vaskulære system. RNA blev revers transkriberet til enkeltstrenget cDNA ved anvendelse af en høj kapacitet cDNA RT Kit [Applied Biosystems, CA, USA] i 100 pi reaktioner som ovenfor. En kombination af de primære aktører i EMT-processen [20] og yderligere gener identificeret i vores laboratorium, som en integreret del af EMT-processen [data ikke vist] blev undersøgt som led i profilering for EMT i æggestokkene cancerceller: Akt-1, ALDH1 A1, CDH1, PIK3CA, SNAIL1, SNEGLEN 2, TWIST 1, vimentin, ZEB1, ZEB 2, TLR 4, MyD88 hjælp TaqMan primer og sonder [Life Technologies /Applied Biosystems: genekspression assays] i henhold til fabrikantens anvisninger. Ekspression blev undersøgt i blodplader og blodplader frigjort behandlede celler og sammenlignet med hvilende ovariecancerceller for alle cellelinjer [HIO-80, 59m, SK-OV-3, A2780 og A2780cis]. Resultater blev afbildet som en vulkan plot af p-værdi versus gange ændring. De tiltrædelse assay tal for de undersøgte gener er vist nedenfor:

GAPDH – Hs99999905_m1

Akt1 – Hs00178289_m1

ALDH1A1 – Hs00167445_m1

PIK3CA – Hs00180679_m1

SNAIL1 – Hs00195591_m1

SNAIL2 – Hs00950344_m1

ZEB1 – Hs01566407_m1

ZEB2 – Hs00207691_m1

TWIST – Hs00361186_m1

vimentin – Hs00958116_m1

CDH1 – Hs01023895_m1

MyD88 – Hs00182082_m1

TLR4 – Hs00152939_m1

Statistik

data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 5.0-software [GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA]. Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien.

Resultater

Adhæsion af blodplader til kræft i æggestokkene celler under statiske forhold

Blodpladeadhæsion til æggestokkene kræft cellelinjer under statisk betingelser blev kvantificeret på grundlag af den fluorescerende detektion af mærkede blodplader [Figur 1A]. Blodpladeadhæsion til A2780 [2,4 ± 0,2%, n = 8], A2780cis [3,0 ± 0,2%, n = 8] og 59 [3,4 ± 0,3%, n = 8] celler var signifikant sammenlignet med den negative kontrol BSA [1,0 ± 0,1%, n = 8]. Blodpladeadhæsion til HIO-80 [1,8 ± 0,2%, n = 8] og SK-OV-3 [1,3 ± 0,2%, n = 8] celler var ikke signifikant sammenlignet med BSA. Adhæsion til alle 5 ovariecancerceller var lavere end den positive kontrol fibrinogen [5,9 ± 0,4%, n = 8]. Fluorescens mikroskopi billeder viser tydeligt blodpladeadhæsion til de ovarian cancer cellelinjer A2780 og 59m [Figur 1B og C]. Overensstemmelse med blodpladeadhæsion assay figur S1 viser den minimale blodpladeadhæsion til HIO-80 cellelinien.

[A] blodpladeadhæsion til ovariecancerceller blev kvantificeret baseret på fluorescens detektion af mærkede blodplader. Blodpladeadhæsion til fibrinogen og BSA blev anvendt som ± kontroller [n = 8 + SEM, * = p lt; 0,05 over BSA]. Fluorescens mikroskopi billeder af blodplader klæber til A2780 [B] og 59 [C] celler under statiske betingelser [repræsentant for n = 3]. Æggestokkene cancerceller og blodplader blev farvet for actin [grøn] blev blodplader farvet specielt til CD42a [rød /gul].

æggestokkene kræftceller fremkalde blodpladeaktivering på en dosisafhængig måde

evne ovariecancerceller at inducere blodpladeaktivering blev kvantificeret ved flowcytometri. Stigende koncentrationer af kræft i æggestokkene celler [0-1,5 × 10

6 celler /ml] blev sat til PRP og blodpladeaktivering blev vurderet på grundlag af P-selektinekspression. Ovariecancerceller inducerede en dosisafhængig stigning i blodpladeaktivering [Figur 2]. De to metastatiske æggestokkene cancercellelinier; SK-OV-3 [1,5 × 10

6 celler /ml, 47 ± 10,2% af blodplader P-selectin positivitet, n = 3] og 59 [1,5 × 10

6 celler /ml, 51 ± 18% P-selectin positivitet n = 6] inducerede den mest betydningsfulde blodpladeaktivering. Den laveste blodpladeaktivering blev set i respons på den ikke-metastatisk ovariecancer cellelinie A2780 [1,5 × 10

6 celler /ml, 16,1 ± 5,2% P-selectin positivitet, n = 6]. A2780cis [a cisplatin resistent datter cellelinje til A2780] demonstrerede højere blodpladeaktivering end dens forælder cellelinjen [1,5 × 10

6 celler /ml, 28,1 ± 12,2% P-selectin positivitet, n = 3]. De immortaliserede normale ovarieepitelceller linje HIO-80 også blodpladeaktivering [1,5 × 10

6 celler /ml, 32,5 ± 7,8% af blodplader P-selectin positivitet, n = 3], men i mindre grad end 59 og SK-OV-3-celler.

Blodpladeaktivering [P-selektinekspression] induceret af en række æggestokkene cellelinjer over et stort koncentrationsområde [0,1-1,5 × 10

6 /ml] blev målt ved flowcytometri, baseret på blodplade P-selectin overfladeekspression. Den mest markante blodpladeaktivering blev set som reaktion på de metastatiske kræft i æggestokkene cellelinjer SK-OV-3 og 59 mio.

P2Y12 /P2Y1-receptoren og ADP /ATP-antagonister hæmmer trombocytaktivering induceret af 59 ovariecancer celler

Siden 59 celler forårsagede den mest betydningsfulde blodpladeaktivering, blev de brugt til at teste virkningen af ​​en række blodplade-inhibitorer på ovariecancercelle induceret blodpladeaktivering. 59m ovariecancerceller [1,5 × 10

6 celler /ml, respons normaliseret til 100% aktivering] blev tilsat til PRP forbehandlet med inhibitorer og blodpladeaktivering blev målt ved flowcytometri [P-selektinekspression]. Koncentrationerne af inhibitorer blev valgt baseret på foreløbige flowcytometri og blodplade aggregometry resultater, der viste, at de antagonistiske (data ikke vist). Antagonister mod Thrombin [hirudin], integrin αIIbβ3 [ReoPro og RGDS peptid], Cox-1 [aspirin], og calcium [EDTA], havde ingen effekt på 59 mio celle blodpladeaktivering [Figur 3]. Efter behandling med P2Y12-antagonisten [cangrelor, 1 pM], det P2Y1-antagonisten [MRS2179, 10 uM] eller ADP /ATPase (apyrase, 10 enheder /ml), blodpladeaktivering i nærvær af 59 ovariecancerceller blev signifikant formindsket [ ,,,0],1 uM Cangrelor – 92,4 ± 0,64% hæmning, s 0,001; 10 uM MRS2179 – 71,4 ± 10,52% inhibering, p = 0,01; 10 enheder /ml apyrase, 91,8 ± 3,7% hæmning, s 0,001]. Dette antyder en ADP afhængig mekanisme af blodpladeaktivering ved 59m celler, potentielt medieret af frigivelse af ADP af cellerne i deres supernatant [Figur 3].

Dette tyder på en mekanisme af blodpladeaktivering afhængig af blodpladereceptorerne P2Y12 og P2Y1, og ADP frigivet af 59m-celler i deres supernatant. Andre blodplade-antagonister såsom hirudin, EDTA, abciximab, RGDS, og aspirin havde ingen effekt på 59 mio celle blodpladeaktivering.

æggestokkene cancerceller potenserer TRAP [trombinreceptoraktiveringspeptid], PAR 4-agonist, og arachidonsyre-induceret trombocyt aktivering i en dosisafhængig måde

Da trombose er en kompleks proces, der involverer flere agonister

in vivo

, vi næste spurgte, om æggestokkene cancerceller moduleret agonist [TRAP, PAR 4 agonist, arachidonsyre, ADP, adrenalin, og kollagen] induceret trombocyt aktivering. For at afgøre dette, vi vurderet aktivering i blodplader co-inkuberes med lave æggestokkene kræft celle koncentrationer og lave agonist koncentrationer. Blodplade agonist koncentrationer, der gav ≤20% blodpladeaktivering [P-selektinekspression] blev anvendt. Ved lave cellulære koncentrationer [0,5-1 × 10

5 celler /ml], 59 ovariecancer celler forstærkes PAR-1 [TRAP], PAR-4 [PAR4 agonist] og TxA2 receptor [arachidonsyre] blodpladeaktivering [P -selectin ekspression], men havde ingen virkning på ADP, epinephrin, collagen eller induceret aktivering [Figur 4]. For eksempel, som respons på 1 uM TRAP og 1 x 10

5 59m celler /ml, blodpladeaktivering blev 44 ± 12.16% P-selectin positivitet [n = 3, figur 3] sammenlignet med 4,4 ± 1,6% P-selectin positivitet [1 × 10

5 59m celler /ml alene, n = 3] og 5,1 ± 1,3% P-selectin positivitet [1 pM TRAP alene, n = 3]. Omvendt reaktion på 1 pM ADP og 1 x 10

5 59m celler /ml, blodpladeaktivering blev 17,3 ± 6,2% P-selectin positivitet [n = 3, figur 4] sammenlignet med 2,4 ± 1,4% [1 × 10

5 59m celler /ml alene, n = 3] og 14,73 ± 5,3% [1 pM ADP alene, n = 3]. Lignende resultater ses også som reaktion på A2780 celler [1 – 5 × 10

5 celler /ml], men højere koncentrationer A2780 celle skulle fremkalde en lignende effekt til 59 celler [data ikke vist]. Dataene tyder på en synergistisk forhold mellem PAR-1, PAR4, og TxA2 receptor blodpladeaktivering og A2780 /59-induceret trombocyt aktivering. Denne synergistiske vekselvirkning hæmmes også ved P2Y12 antagonisten cangrelor [data ikke vist].

Aktivering sker på en dosisafhængig måde [n = 3, + SEM]. Ved lave koncentrationer, 59m [0,5-1 × 10

5 /ml], celler signifikant potenseret TRAP, PAR4 agonist, og arachidonsyre blodpladeaktivering [P-selektinekspression]. Dette tyder på en synergistisk forhold mellem PAR-1, PAR-4, og TxA2 receptor blodpladeaktivering og 59m blodpladeaktivering. Lignende resultater ses for A2780 celler [1-5 × 10

5 celler /ml, data ikke vist]

Expression array analyse af ovariecancerceller behandlet med vaskede blodplader eller blodplade frigjorte materiale ved hjælp Affymetrix exon arrays

Alle arrays bestået QC hjælp Affymetrix QC-software. Biotiques X-Ray software plug-in til Microsoft Excel blev brugt til at afhøre genekspression ændringer mellem behandlinger og celletyper [Fold forandring 1,5 og p 0,05]. Analytisk stringens blev lempet at folde ændringer i 1,5 til rumme subtil, men meningsfuld biologisk variation [p 0,05], der var betinget af behandling. Tabel 1, 2, 3, 4 skildrer genekspressionen variationer observeret i celler behandlet med blodplade frigjort /vaskede blodplader. Vejviser

I Hio-80 celler, efter behandling med vaskede blodplader eller blodplade releasat, syv gener var signifikant opreguleret, med den største forskel ses som reaktion på vaskede blodplader. De opreguleres gener koder for proteiner, der er forbundet med kræft i æggestokkene metastase [SERPINB2 /PAI2], metaboliske aktiviteter [IDI1, PMM2] og genekspression /transskription [PCGF6, ZNF267].

59 celler også udstillet genekspression skifter efter behandling med blodplade releasat og vaskede blodplader. De biologiske processer påvirket involveret anti-autofagi, anti-apoptotiske og pro-angiogene signaleringsveje [TRAF2, CCL2, TNFAIP2, PDGFb].