PLoS ONE: p120ctn og P-Cadherin men ikke E-Cadherin Reguler Cell motilitet og Invasion af DU145 Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

adherensovergange består af transmembrane cadheriner, som interagerer intracellulært med p120ctn, ß-catenin og α-catenin. p120ctn er kendt for at regulere celle-celle adhæsion ved at øge cadherin stabilitet, men virkningerne af andre adherens junction komponenter på celle-celle adhæsion er ikke blevet sammenlignet med p120ctn.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi viser, at udtømning af p120ctn af små interfererende RNA (siRNA) i DU145 prostatacancer og MCF10A breast epitelceller reducerer ekspressionsniveauerne af den adherens junction-proteiner, E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin, og inducerer tab af celle-celle-adhæsion. p120ctn-udtømte celler har også øget migration hastighed og invasion, som korrelerer med øgede Rap1 men ikke Rac1 eller RhoA aktivitet. Nedregulering af P-cadherin, β-catenin og α-catenin, men ikke E-cadherin inducerer et tab af celle-celleadhæsion, forøget migration og forbedret invasion ligner p120ctn udtynding. Det er dog kun p120ctn udtynding fører til et fald i niveauerne af andre adherens junction proteiner.

Konklusioner /Signifikans

Vores data viser, at P-cadherin, men ikke E-cadherin er vigtig for opretholdelse adherens kryds i DU145 og MCF10A celler, og at udtømning af enhver af cadherin-associerede proteiner, p120ctn, ß-catenin eller α-catenin, er tilstrækkelig til at afbryde adherensovergange i DU145-celler og øge migration og cancercelleinvasion.

Henvisning: Kümper S, Ridley AJ (2010) p120ctn og P-Cadherin men ikke E-Cadherin Reguler Cell motilitet og invasion af DU145 prostatacancerceller. PLoS ONE 5 (7): e11801. doi: 10,1371 /journal.pone.0011801

Redaktør: Robin Charles May, University of Birmingham, England

Modtaget: Februar 2, 2010; Accepteret: 29 juni 2010; Publiceret: 27 juli, 2010

Copyright: © 2010 Kuemper, Ridley. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Cancer Research UK, Bettencourt-Schueller Foundation, og en Europa-Kommissionen Framework 6 kontrakt (LSHG-CT-2003 til 502.935, MAIN). SK blev understøttet af en ph.d. studentship fra Kings College London School of Biomedical og Sundhedsvidenskabelige Fakultet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Under metastase, kræftceller ofte få mulighed for at migrere og invadere væv ved at regulere deres interaktion med andre celler og deres ekstracellulære miljø. Mange undersøgelser viser, at ændringer i celle-celle adhæsion korrelerer med epitelial tumorprogression og metastase [1]. Kræftceller kan invadere enten som enkelte celler eller kollektivt som grupper af celler [2], [3], [4]. Begge typer af invasion involverer forstyrrelser af epitelet der normalt kræver en svækkelse af celle-celle-kontakter og en ændring i celleform. Cadheriner og catenins danner adherensovergange, som er centrale mediatorer af celle-celle-adhæsion. Angivelse af adherens junction proteiner er ofte faldet i tumorer, og rekonstituering af funktionelle adherensovergange kan vende den invasive fænotype af cancerceller [5], [6], [7].

De klassiske cadheriner (E-, VELUX, N- og P-cadherin) er de centrale transmembrane proteiner af adherens junction kompleks og mediere Ca

2 + -afhængig homofil intercellulære interaktioner. β-catenin og plakoglobin /γ-catenin binder til cadherin intracellulære domæner i en gensidigt udelukkende måde og α-catenin gengæld binder til p-catenin [8]. p120-catenin (p120ctn) på den anden side binder til en anden region i cadheriner at p-catenin [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Sammensætningen af ​​proteiner af adherens junction kompleks afhænger af celletypen og cadherinekspression. α-catenin et vigtigt bindeled mellem adherensovergange og actincytoskelettet. Dens interaktion med actinfilamenter synes imidlertid at være gensidigt udelukkende dets binding til p-catenin antyder en indirekte forbindelse mellem kryds og actincytoskelettet [15], [16].

p120ctn har vist sig at regulere adherens krydset stabilitet

in vitro

[17], [18], [19] og

in vivo

[20], [21], [22]. Dens udtømning af RNAi fører til et fald i adherens junction proteiner og afskaffer celle-celle adhæsion [17], dels ved at øge cadherin endocytose og nedbrydning [19], [23]. p120ctn påvirker også aktiviteten af ​​de små GTPaser RhoA, Rac1 og cdc42 i nogle celletyper [24], [25], [26], [27], som spiller en central rolle i reguleringen af ​​cytoskeletale dynamik, dannelsen og vedligeholdelse af adherens kryds og celle migration [28], [29]. p120ctn kan derfor knytte adherensovergange og Rho GTPaser.

Virkningerne af p120ctn på celle migration og invasion varierer afhængigt af celletype assay betingelser og typer af cadheriner udtryk [30], [31], [32] . Det er ikke klart, i hvilket omfang virkningerne af p120ctn medieres gennem adherensovergange eller Rho GTPaser. For at løse dette, har vi slået ned p120ctn i DU145 prostatacancerceller og MCF10A mammaepitelceller, som begge normalt har adherensovergange indeholder E-cadherin og P-cadherin. I begge celletyper udtømning af p120ctn fører til sprængning af celle-celle-kontakter, nedregulering af adherens junction proteiner og forøget cellemotilitet. Interessant, har knockdown af p120ctn ikke påvirke aktivitetsniveauer af Rho GTPaser Rac1 og RhoA men førte til en stigning i aktiv Rap1. For første gang har vi slået ned cadheriner samt catenins og viser, at P-cadherin, β-catenin og α-catenin, men ikke E-cadherin udtømning efterligner virkningerne af p120ctn undertrykkelse og føre til et tab af celle-celle-kontakter og forbedret invasion.

Resultater

Undertrykkelse af p120ctn udtryk fører til nedregulering af celle-celleadhæsionsproteiner og afbrydelse af celle-celle kontakter

for at undersøge virkningerne af p120ctn på celle -celle adhæsion, sammenlignede vi virkningerne af p120ctn udtømning i to forskellige cellelinier, der har adherensovergange, den humane cellelinie prostatacancer DU145 og human mammae epitelcellelinie MCF10A. DU145 og MCF10A-celler dannede celle-celle-kontakter og udtrykkes både E- og P-cadherin, som er lokaliseret til celle-celle-kontakter (fig. 1A, B). DU145 og MCF10A-celler overvejende udtrykker to p120ctn isoformer, der, baseret på deres molekylvægt, der forventes at være isoformer 1 og 3 [33] med isoform 3 (nederste bånd) er udtrykt ved lidt højere niveauer (fig. 1).

DU145 (A) og MCF10A (B) celler blev transficeret med siRNA’er for p120ctn (p120ctn (1), (2)), styrer siRNA eller med transfektionsreagens alene (mock). Efter 72 timer blev celler fikseret og farvet for F-actin, p120ctn og E-cadherin eller P-cadherin (venstre paneler) eller lyseret og analyseret ved immunoblotting for de angivne celle-celleadhæsionsmolekyler og p120ctn knockdown effektivitet (højre paneler) . Scale barer = 25 um. ERK blev anvendt som en loading kontrol for immunoblots.

Knockdown af p120ctn med to forskellige siRNA’er i DU145 og MCF10A celler induceret afbrydelse af celle-celle adhæsion resulterer i en “spredt” fænotype (Fig. 1, fig. 2). Desuden har DU145 celler stabilt forarmet af p120ctn ikke stabil adherens krydset (fig. S1). Denne fænotype var på grund af specifik p120ctn udtømning, eftersom ekspression af shRNA-resistente muse p120ctn (GFP-fusion) reddet junction dannelse, som bestemt ved lokalisering af p120ctn og E-cadherin (fig. S1).

DU145 ( A, C, D) og MCF10A (B, C) -celler blev transficeret med siRNA’er for p120ctn (p120ctn (1), (2)), siRNA for E-cadherin (E-cadherin), kontrol siRNA (kontrol) eller med transfektion reagens kun (mock). Efter 56 timer blev celler monitoreret ved time-lapse mikroskopi, indlæser et billede hver 10 min over et tidsrum på 16 timer. Repræsentative eksempler på fase-kontrast billeder af celler fra filmene (venstre paneler) og migration spor (højre paneler; startpunktet af hver celle er afbildet ved skæringspunktet mellem x- og y-akserne) er vist for kontrol-transficerede og p120ctn-udtømte DU145 (A) og MCF10A (B) celler. Scale barer = 50 um. (C, D) migration hastigheder er afbildet som boks og knurhår plots viser median, interkvartile interval (kasser) og højeste og laveste værdier (whiskers). (C) Migration hastigheder på DU145 og MCF10A celler. (D) Migration hastigheder på DU145 kontrol celler i kolonier sammenlignet med enkelte celler. Dataene er fra tre forskellige eksperimenter, hver udført in duplo, analyse 15 celler pr (-90 celler i alt). *** P 0,001, sammenlignet med kontrol og bestemt af t-test

Både E-cadherin og P-cadherin samt β- og α-catenin blev nedreguleret i p120ctn-udtømte. celler. Nedregulering af cadheriner korrelerede med omfanget af p120ctn udtømning: ved 72 timer efter transfektion med siRNA’er målretning p120ctn, p120ctn niveauerne var lavere end ved 48 h, og E-cadherin var lavere ved 72 timer end 48 timer (data ikke vist)

p120ctn-depleterede celler blev imidlertid ikke sandsynligt, at have undergået epitelial til mesenkymale overgang (EMT) som niveauer af EMT markørproteiner såsom vimentin ikke blev forøget sammenlignet med kontrol-transficerede DU145 celler (data ikke vist).

p120ctn regulerer migration af DU145 og MCF10A celler

for at teste, om cellemigration var påvirket af p120ctn udtømning blev celler overvåget af time-lapse mikroskopi over 16 h (fig. 2A, B) og spores til bestemme deres migration hastighed. p120ctn-depleteret DU145 og MCF10A celler begge migrerede hurtigere end kontrolceller (fig. 2, Film S1, S2, S3 og S4). Derimod havde depletering af E-cadherin ikke ændre cellemigration hastighed (fig. 2C), selv om dens ekspressionsniveauet blev reduceret med p120ctn knockdown (Fig. 1). Migrationen hastighed kontrolceller blev bestemt ud fra celler lokaliseret i cellekolonier (fig. 2C), men nogle celler i populationen vandrede som enkeltceller (film S1 og S3). Der var imidlertid ingen forskel i migration hastighed DU145 celler i kolonier eller enkelte celler (fig. 2D), udelukker muligheden for, at p120ctn-udtømte celler migrerede hurtigere, fordi de var overvejende enkelte celler i stedet for i kolonier.

Cell migration blev også analyseret i scratch-sår assays på sammenflydende monolag af DU145 celler. De fleste p120ctn-udtømte celler vandrede som individuelle celler i såret, hvorimod kontrolceller vandrede som et ark, opretholdelse celle-celle-kontakter (Fig. 3A, film S5, S6). p120ctn-udtømte celler migrerede hurtigere end kontrolceller (fig. 3B). Imidlertid viste p120ctn-udtømte celler en formindskelse i persistens (fig. 3B), hvilket indikerer, at de skifter retning oftere. På trods af den forøgede migration hastighed, sårlukning tid var ligner styre-transficerede celler (fig. 3C).

DU145 celler blev transficeret med siRNA’er for p120ctn (p120ctn (2)) og kontrol siRNA (kontrol) . Efter 56 timer blev et konfluent monolag såret ved anvendelse af en pipettespids og celler overvåget af time-lapse mikroskopi, indlæser et billede hver 10 min over et tidsrum på 16 timer. (A) Fase kontrast billeder af celler fra det første billede af hver film vises uden eller med repræsentative spor celler (7 /billede, spores i 16 timer) overlejret (top billeder). Derudover er scratch sår kontrolceller og p120ctn-udtømte celler vist ved 0 timer og 16 timer efter sårdannelse (bundpaneler). Scale barer = 50 um. (B) Migration hastighed (til venstre) og vedholdenhed (højre; forskydning /spor længde) blev bestemt. Migration hastigheder er afbildet som boks og knurhår plots viser median, interkvartile interval (kasser) og højeste og laveste værdier (whiskers). (C) Område besat af celler i scratch sår blev bestemt ud fra fase-kontrast billeder taget på forskellige tidspunkter fra film. Dataene er fra tre forskellige eksperimenter, hvert udført i dubletter, analyse 15 celler pr (-90 celler i alt). * P 0,05; *** P. 0,001, sammenlignet med kontrol og bestemt af t-test

Undertrykkelse af p120ctn udtryk fører til øget Rap1 aktivitet

Regulering af Rho GTPase aktiviteter p120ctn har tidligere blevet korreleret med forøget cellemotilitet [25], [26]. Der blev dog ikke observeret nogen forskel i niveauerne af aktiv RhoA, Rac1 eller Cdc42 mellem p120ctn-udtømte og kontrol-transficerede DU145 celler (Fig 4A, B;. Data for Cdc42 ikke vist). Da p120ctn knockdown induceret tab af celle-celle-kontakter og GTPase Rap1 har tidligere været forbundet med stabilisering af E-cadherin på plasmamembranen og skal aktiveres efter E-cadherin frigørelse [34], niveauer af aktive Rap1 blev analyseret. p120ctn-depleteret DU145 celler viste øget niveauer af Rap1 aktivitet (fig. 4A, B).

DU145 celler blev transficeret med siRNA’er for p120ctn (p120ctn (1), (2)), styrer siRNA (kontrol) eller med transfektionsreagens alene (mock). Efter 72 h celler blev lyseret og inkuberet med GST-Rhotekin-RBD, GST-PAK1-PBD eller GST-RalGDS-RBD på glutathionperler at trække ned aktiv RhoA, Rac1 og Rap1 hhv. Lysater af mocktransfekterede celler inkuberet med GTPyS forudindlæser GTPaser blev anvendt som en positiv kontrol for pulldown assays. (A) Eksempel immunoblots til GTPase aktivitetsassays. ERK niveauer på immunoblots blev anvendt som en loading kontrol. Ponceau-farvning af immunblots viser niveauerne af GST-fusionsproteiner. (B) Grafer viser data fra tre (RhoA, Rac1) eller 4 (Rap1) uafhængige forsøg og resultater er i forhold til den samlede RhoA, Rac1, Cdc42 og normaliseret til kontrol. Fejl- søjler repræsenterer SEM. * P 0,05, sammenlignet med kontrol og bestemt af t-test

Nedbrydning af cadheriner, ß-catenin eller α-catenin påvirker ikke ekspressionsniveauerne af andre adherens junction proteiner

Da p120ctn udtømning reducerede niveauet for adherens junction proteiner E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin (fig. 1), undersøgte vi virkningen af ​​depletering hvert af disse proteiner på adherensovergange. DU145-celler blev transficeret med 2 eller 3 forskellige siRNA oligoer for E-cadherin, P-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn (fig. 5A). Salg

DU145 celler blev transficeret med de anførte siRNA’er for E-cadherin, P-cadherin, α-catenin og β-catenin, eller med kontrol-siRNA (kontrol) eller transfektionsreagens alene (mock). (A) Efter 72 h blev cellerne lyseret, og proteinniveauer af de angivet proteiner analyseret ved immunblotting. Total ERK eller GAPDH proteinniveauer blev anvendt som en loading kontrol. (B) Grafer viser proteinniveauer af P-cadherin, E-cadherin, α-catenin og p120ctn efter knockdown af de angivne proteiner, kvantificeret ved Odyssey scanning af immunoblots (venstre) eller β-catenin knockdown, kvantificeret ved densitometri (til højre), fra 4 uafhængige eksperimenter. Resultater normaliseres til kontrolværdier. Søjler repræsenterer SEM. *** P 0,001, ** p 0,01, * p. 0,05, sammenlignet med kontrol og bestemmes ved t-test

Ekspressionsniveauer af hver af disse proteiner blev derefter bestemt ved kvantificering af immunblots. Niveauer af P-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn proteiner blev ikke påvirket af E-cadherin depletion (fig. 5A, B). Knockdown af P-cadherin lidt reducerede niveauer af E-cadherin, ß-catenin og α-catenin men ikke p120ctn, men dette blev kun observeret for siRNA oligo (1), der gav den stærkeste ( 80%) udtømning af P-cadherin . To andre oligoer der reducerede P-cadherin niveauet -50% påvirkede ikke niveauerne af andre synaptiske proteiner. ß-catenin eller α-catenin udtømning ændrede ikke niveauerne af andre adherens junction proteiner betydeligt (Fig. 5). Det er således kun p120ctn udtømning, som resulterer i et fald i niveauerne af alle de andre celle-celle-adhæsionsmolekyler (fig. 5B).

Suppression af p120ctn, P-cadherin, β-catenin og α-catenin men ikke E-cadherin fører til sprængning af celle-celle-kontakter og fremmer cancercelleinvasion

Da nedregulering af p120ctn førte til et tab af celle-celle kryds og en stigning i cellemigrering hastighed, virkningerne af nedbrydende anden adherens junction proteiner på celle-celle-adhæsion og cellemotilitet blev undersøgt. Knockdown af E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin af RNAi var meget effektiv både inden kolonier og i enkelte celler, som observeret ved immunfluorescens, men ikke discernibly påvirke p120ctn niveauer (fig. 6).

(A) DU145 celler blev transficeret med de anførte siRNA’er for E-cadherin, P-cadherin, β-catenin, α-catenin, kontrol siRNA (kontrol) eller med transfektionsreagens alene (mock). Efter 72 timer blev celler fikseret og farvet for P-cadherin, E-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn at korrelere knockdown fænotyper med ekspression af bankede-down proteiner. Scale barer = 25 um.

knockdown af P-cadherin, β-catenin og α-catenin af hver af 2 forskellige siRNAs (eller 3 for P-cadherin) førte til afbrydelse af celle-celle kontakter, der ligner p120ctn depletion (fig. 6, fig. S2, fig. S3). Især alle tre siRNAs 1, 2 og 3 er målrettet mod P-cadherin induceret tab af celle-celle-kontakter, selv om de reducerede P-cadherin niveauer ved forskellige mængder (fig. 5, fig. 6, fig. S3). Derimod har knockdown af E-cadherin i DU145-celler inducerede ikke et tab af celle-celle-kontakter (Fig. 2C, fig. 6, fig. 7).

DU145 celler blev transficeret med de anførte siRNA’er for E-cadherin, P-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn, med kontrol siRNA (kontrol) eller transfektionsreagens alene (mock). 56 timer efter transfektion blev celler overvåget af time-lapse mikroskopi, erhverve en fase-kontrast billede hver 10 min over en periode på 16 timer. Repræsentative eksempler på fase kontrast billeder på start- og migration spor efter 16 timer, er vist. Scale barer = 25 um. (B) Migration hastighed blev bestemt ved hjælp ImageJ software. Analyse af migration hastighed er afbildet som boks og knurhår plots viser median, interkvartile interval (kasser) og højeste og laveste værdier (whiskers). Data er fra mindst 50 celler fra tre forskellige eksperimenter. *** P. 0,001, sammenlignet med kontrol og bestemt af t-test

Celler forarmet af hver adherens junction protein blev sporet fra timelapse film at bestemme deres migration hastighed (fig. 7). Ligesom p120ctn udtømning, knockdown af P-cadherin, β-catenin og α-catenin ført til en stigning i celle migration hastighed, svarende til resultater opnået med p120ctn udtynding, hvorimod E-cadherin udtømning ikke ændrede migration hastighed (fig. 7). Tilsvarende P-cadherin, men ikke E-cadherin udtømning i MCF10A celler førte til afbrydelse af celle-celle kontakter og øget migration hastighed (fig. 8).

(A) MCF10A celler blev transficeret med de angivne siRNA’er for E -cadherin, P-cadherin eller med kontrol siRNA (kontrol). Efter 72 timer blev celler fikseret og farvet for F-actin og p120ctn. Scale barer = 25 um. (B) 56 timer efter transfektion, cellerne blev overvåget ved time-lapse mikroskopi, erhvervelse af et fase-kontrast billede hver 10 min over et tidsrum på 16 timer. Migration hastighed blev bestemt ved hjælp ImageJ software. Analyse af migration hastighed er afbildet som boks og knurhår plots viser median, interkvartile interval (kasser) og højeste og laveste værdier (whiskers). Data er fra mindst 50 celler fra tre forskellige eksperimenter. *** P. 0,001, sammenlignet med kontrol og bestemmes ved t-test

Baseret på ændringer i celle-celle-adhæsion og migration hastighed observeres, virkningen af ​​p120ctn, E-cadherin, P-cadherin, β- og α-catenin på invasion gennem Matrigel blev undersøgt. Knockdown af p120ctn med to forskellige siRNAs øget invasion gennem Matrigel henviser E-cadherin udtømning ikke påvirkede invasion (fig. 9A, B). Knockdown af P-cadherin på den anden side ført til en stigning i invasion ligner p120ctn depletion (Fig. 9). Udtømningen af ​​β-catenin samt α-catenin inducerede en forøgelse af invasion ligner p120ctn og P-cadherin. For at udelukke den mulighed, at forskelle i antallet af celler på bunden af ​​Matrigelcoatede Transwells skyldtes ændret celleproliferation blev celler talt 48 timer efter at de var blevet transficeret med siRNA’er. Ingen ændringer i celleantal sammenlignet med kontrol siRNA-transficerede celler blev observeret (fig. 9C). Afslutningsvis knockdown af P-cadherin, β-catenin og α-catenin, men ikke E-cadherin inducerede en afbrydelse af celle-celle-kontakter og en stigning i kræft cellemigration og invasion ligner knockdown af p120ctn.

DU145 celler blev transficeret med de anførte siRNA’er for p120ctn, P-cadherin, E-cadherin, α-catenin og β-catenin, med kontrol siRNA (kontrol) eller transfektionsreagens alene (mock). Efter 55 h celler podedes på Transwell membran inserter indeholdende et lag af Matrigel. FCS blev anvendt som en kemoattraktant i bundkammeret. Assays blev standset efter 17 timer ved fastsættelse celler på bunden af ​​membranen indsatse ved hjælp af krystal violet. Billeder af otte forskellige synsfelter anskaffet og celler i alle billeder tælles og analyseres. (A) Grafer viser data fra tre uafhængige forsøg, der hver udført in triplo. Resultater normaliseres til kontrolværdier. Søjler repræsenterer SEM. ** P 0,01, * p 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen, bestemt ved t-test. (B) Repræsentative billeder af celler på bunden af ​​Transwell membraner. Scale barer = 50 um. (C) 48 timer efter transfektion blev celler talt og sammenlignet med sicontrol. Grafer viser data fra mindst tre uafhængige forsøg. Resultater normaliseres til kontrolværdier. Søjler repræsenterer SEM.

Diskussion

p120ctn udtryk ofte tabt eller nedreguleret i en lang række menneskelige kræftformer [35], og faldt p120ctn niveauer korrelerer med tumoren klasse [36], [37], [38], [39]. Vi har her vist, at nedbrydningen af ​​p120ctn i E-cadherin og P-cadherin-udtrykkende DU145 og MCF10A celler forstyrrer celle-celle kontakter, og øger migration og invasion af DU145 celler, støtter en model, hvor p120ctn fungerer som en invasion eller metastase suppressor [48]. Disse virkninger korrelerede med reduceret ekspression af adherens junction proteiner E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin. Det er imidlertid kun nedregulering af P-cadherin og ikke E-cadherin var i stand til at inducere en lignende fænotype til p120ctn udtømning, hvilket indikerer, at E-cadherin ikke er nødvendig for at opretholde celle-celle-adhæsion i DU145 eller MCF10A celler.

i modsætning til vores resultater, er p120ctn blevet rapporteret at være påkrævet for invasion af E-cadherin-deficiente celler delvist ved at stabilisere mesenkymale cadheriner N-cadherin eller cadherin-11, som er kendt for at fremme invasion [32]. På den anden side den kollektive invasion af E- og P-cadherin-udtrykkende A431-celler blev inhiberet ved celle-celle-kontakter blev afbrudt enten ved p120ctn knockdown eller samtidig knockdown af E-cadherin og P-cadherin [35]. I disse undersøgelser HGF eller EGF henholdsvis blev brugt som kemoattraktanter i invasion og migration analyser, mens vi brugte serum. En mulighed er, at p120ctn kunne specifikt bidrage til HGF /EGF-induceret migration eller invasion, som det tidligere har været knyttet til HGF- eller EGF-induceret celle spredning [40].

p120ctn har vist sig at stimulere Rac og /eller Cdc42 aktivitet og /eller inhibere RhoA-aktivitet i celler, der mangler E-cadherin, herunder fibroblaster og cancercellelinier [32], [41]. I modsætning hertil fandt vi, at i DU145 celler, som udtrykker P- og E-cadherin, men ikke N-cadherin, har udtømningen af ​​p120ctn ikke påvirke aktiviteten af ​​RhoA og Rac1. Tilsvarende i E-cadherin /P-cadherin-udtrykkende A431-celler, p120ctn udtømning ændrede ikke RhoA /Rac1 aktivitet [31].

Taget sammen indikerer disse resultater, at virkningerne af p120ctn på Rho GTPase aktiviteter er celletype-specifik. Dette kan skyldes forskelle i sammensætningen af ​​p120ctn komplekser, f.eks komplekser, der indeholder GEFs der kunne aktivere Rac1 /Cdc42 eller huller at nedregulere RhoA [26], [41]. Interessant nok i MDA-MB-231 brystcancerceller, aktivering af Rac ved p120ctn kræver cadherin bindende [32], hvilket antyder, at mesenkymale cadheriner kan specifikt bidrage til Rac aktivitet. Selvom Rho GTPase aktivitet ikke blev påvirket af p120ctn, fandt vi, at Rap1 aktivitet er forøget i p120ctn-udtømte DU145 celler. Rap1 er en vigtig regulator af celle-celle kryds, og aktiveres af E-cadherin engagement [42], [43]. Afbrydelse af adherensovergange ved ekstracellulært calcium udtømning inducerer også en stigning i Rap1 aktivitet [44]. Vore resultater med p120ctn udtømning er konsistente med den hypotese, at endocytose af E-cadherin forøger Rap1 aktivitet [44].

Overraskende knockdown af P-cadherin, β- og α-catenin, men ikke E-cadherin førte til afbrydelse af celle-celle-kontakter. Antagelig P-cadherin erstatninger for E-cadherin at opretholde celle-celle-kontakter, men ikke E-cadherin for P-cadherin. Denne hypotese understøttes af undersøgelser i MDCK celler, hvor det er blevet vist, at E-cadherin er vigtigt kun for etablering, men ikke vedligeholdelse af celle-celle kontakter, mens α-catenin var forpligtet til at opretholde celle-celle-kontakter [45]. Desuden P-cadherin depletering alene blev rapporteret at inducere tab af celle-celle-kontakter og nedregulering af E-cadherin-niveauer i MCF10A celler [46] og overekspression af P-cadherin i MDA-MB-231 brystcancerceller reduceret cellemigration og invasion [47]. I kræft fleste undersøgelser har koncentreret sig om forbindelsen mellem E-cadherin nedregulering og øget kræft aggressivitet og invasion, men der er også tegn på, at P-cadherin påvirker tumor progression. For eksempel er P-cadherin niveauer nedreguleres under melanom progression [48] og P-cadherin går ofte tabt i prostatacancere [49]. I DU145-celler, fandt vi, at P-cadherin udtømning inducerer tab af celle-celle kryds uden signifikant at påvirke niveauerne af andre adherens junction-proteiner, hvilket indikerer, at det er den største cadherin kræves for celle-celle-adhæsion i disse celler.

knockdown af β- og α-catenin inducerede også sprængning af celle-celle-kontakter og en stigning i invasion men ændrede ikke p-cadherin eller p120ctn proteinniveauer. Det er muligt, at de påvirker lokaliseringen af ​​P-cadherin og /eller p120ctn snarere end niveauer. p- og a-catenins er blevet rapporteret at påvirke cadherin-medieret adhæsion [15], [16], og udtømningen af ​​β-catenin i en E-cadherin-deficient cellelinje førte til et fald i invasion [50], men hidtil lidt er kendt om deres roller i migration og invasion. β-catenin har også en vigtig rolle i Wnt-signalering og cancercelleproliferation som menes at være uafhængig af dens cadherin funktion [51].

Vores resultater viser, at p120ctn regulerer ekspressionsniveauerne af ß-og α catenin samt cadheriner i DU145-celler. Da vi har vist, at P-cadherin niveauer er vigtigere end E-cadherin i at opretholde celle-celle-adhæsion i DU145 og MCF10A celler, postulerer vi, at den øgede migration og invasion Vi observerer følgende p120ctn, ß-catenin eller α-catenin knockdown er enten skyldes nedsat P-cadherin stabilitet eller ændringer i dens lokalisering.

Materialer og metoder

siRNA’er

Alle siRNAs anvendt blev opnået fra Dharmacon (Fisher Scientific UK, Loughborough, UK). Følgende ON-TARGET

plus

enkelte oligoer blev brugt målrettet p120ctn (CTNND1 (1) 5′-UAGCUGACCUCCUGACUAA-3 ‘, (2) 5′-GGACCUUACUGAAGUUA-3′), E-cadherin (CDH1 (1 ) 5’-GGCCUGAAGUGACUCGUAAU-3 ‘; (2) 5’GAGAACGCAUUGCCACAUA-3’), P-cadherin (CDH3 (1) 5’GUGACAACGUCUUCUACUA-3 ‘; (2) 5′-GAGGGUGUCUUCGCUGUAG-3’; (3) 5 ‘-GAAAUCGGCAACUUUAUAA-3′), β-catenin (CTNNB1 (1) 5’-GCGUUUGGCUGAACCAUCA-3 ‘) og α-catenin (CTNNA1 (1) 5′-GAUGGUAUCUUGAAGUUGA-3′; (2) 5’-GUGGAUAAGCUGAACAUUA-3 ‘). Ikke-targeting siRNA blev anvendt som en kontrol i alle eksperimenter (ON-TARGET kontrol # 1; 5’-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ‘).

Cell kultur og transfektioner

DU145 prostatacancerceller var dyrket i RPMI suppleret med 10% FCS, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. MCF10A brystepitelceller celler blev dyrket i DMEM /F12 suppleret med 5% hesteserum, 100 IE /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 20 ng /ml EGF, 0,5 ug /ml hydrocortison, 100 ng /ml choleratoxin og 5 ug /ml insulin. Celler blev podet ved 1,8 X 10

5 pr brønd i 24-brønds plader og revers transficeret med siRNA’er (slutkoncentration 20 nM) i antibiotisk medium under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, UK) i overensstemmelse med producentens instruktioner . Efter 6-8 timer blev cellerne genpodedes på 2 × 10

4 celler per brønd (DU145) eller 10

4 celler per brønd (MCF10A) til immunofluorescens og time-lapse mikroskopi og ved 1 x 10

5 pr brønd (plade med 24 brønde) for immunoblotting og ridser viklede assays. For etablering af stabile p120ctn-udtømte DU145 celler blev pSuperior vektor-system (Oligoengine, Seattle, WA), der anvendes. Sekvensen af ​​shRNA oligo targeting human p120ctn designet som beskrevet [52]. En stabil celle pool indeholdende shRNA blev selekteret i medium indeholdende 5 ug /ml puromycin. For redningsforsøg murine p120ctn-GFP [26], hvilket ikke er følsom over for shRNA målretning human p120ctn, blev forbigående transficeret ind i DU145-celler under anvendelse Amaxa nucleofection (Lonza, Köln) ifølge fabrikantens protokol (www.lonzabio.com) .

immunblotting

Celler dyrket til ca. 80% konfluens blev vasket en gang med kold PBS og lyseret i enten kold 2 × SDS-prøvebuffer (Invitrogen) direkte og homogeniseret med en 21G nål eller lysis puffer (50 mM Tris pH 7,5, 1% Triton-X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM Na

3VO

4, 25 mM NaF, komplet mini EDTA-fri proteasehæmmer (Roche, Welwyn Garden City, UK), PhosSTOP phosphatase inhibitor (Roche)) og derefter klaret ved centrifugering. Lysater blev separeret ved SDS-PAGE og underkastet immunoblotanalyse. For Fornyet probing blev PVDF-membraner inkuberet med stripning puffer (50 mM Tris HCI (pH 7,5), 100 mM β-mercaptoethanol, 2% SDS) i 20 minutter ved 65 ° C. Primære antistoffer blev anvendt i en fortynding på 1:1000: p120ctn (# 610.134), E-cadherin (# 610.182) blev indkøbt fra BD Biosciences (Oxford, UK), P-cadherin (# 05-916), Rac1 (# 05 -389) fra Upstate (Millipore, Watford, UK), β-catenin (# C2206), α-catenin (# C2081) fra Sigma-Aldrich (Dorset, UK), ERK (# sc-94), RhoA (# sc -418) fra Santa Cruz Biotechnology (Insight Biotechnology, Wembley, UK) og Rap1A /Rap1B (# 4938) fra Cell Signaling (New England Biolabs, Hitchin, UK).