PLoS ONE: microRNA analyse i Human Colon Cancer Cells løbet 5-fluorouracil-induceret Autophagy

Abstrakt

Autophagy modulation er nu anerkendt som en potentiel terapeutisk tilgang til kræft (herunder tyktarmskræft), men de molekylære mekanismer, der regulerer autofagi som reaktion på cellulært stress stadig ikke godt forstået. MikroRNA’er (miRNA) har vist sig at spille en vigtig rolle i at kontrollere mange cellulære funktioner, herunder vækst, metabolisme og stressrespons. Den fysiologiske betydning af miRNA-autofagi sammenkobling er kun lige begyndt at blive belyst. Mirna microarray teknologi letter analyse af den globale miRNA udtryk i visse situationer. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsprofilen af ​​miRNA under responset af humane coloncancer-celler (HT29s) til 5-FU behandling og næringsstofudsultning hjælp miRNA microarray analyse. Ændringen af ​​miRNA udtryk viste det samme mønster under begge betingelser blev yderligere vidnede ved QRT-PCR i tre menneskelige kolon cancer cellelinjer. Desuden blev bioinformatik forudsigelse af target gener, pathway analyse og gen-netværk analyse udført for bedre at forstå de roller disse miRNA i reguleringen af ​​autofagi. Vi identificerede og udvalgte fire nedreguleret miRNA herunder HSA-miR-302a-3p og 27 opreguleres miRNA under disse to betingelser som har potentiale til at målrette gener involveret i reguleringen af ​​autophagy i humane colon cancerceller. De har potentialet til at modulere autofagi i 5-FU-baseret kemoterapi i kolorektal cancer

Henvisning:. Hou N, Han J, Li J, Liu Y, Qin Y, Ni L, et al. (2014) microRNA analyse i Human Colon Cancer Cells løbet 5-fluorouracil-induceret Autophagy. PLoS ONE 9 (12): e114779. doi: 10,1371 /journal.pone.0114779

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 31 Juli 2014; Accepteret: November 13, 2014; Udgivet: December 19, 2014

Copyright: © 2014 Hou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr 31.100.969) og Den Videnskabelige Research Institut til Returnerede Overseas Kinesisk Scholars, Statens Uddannelsesstøtte Ministeriet (2013-09) til Dr. Hou. Det blev også støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr 81.172.358) til Dr. Li. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer

Introduktion

5-fluorouracil (5-FU) -baseret adjuvant kemoterapi har været meget anvendt som mainstream til behandling af colorektal cancer (CRC). Men på grund af den modstand mod 5-FU i mange patienter, hidtil ukendte terapeutiske strategier udforskes [1]. Autophagy er en evolutionært bevaret eukaryot proces der opretholder intracellulær homeostase ved at fjerne unødvendige proteiner og beskadigede eller ældede organeller [2]. I de seneste årtier har akkumulerende beviser vist, at autophagy udførligt er associeret med cancer [3]. Ved at opretholde cellulær homeostase i raske celler, autofagi forhindrer tumoral transformation. Autophagy er også vigtigt for tumor progression, så tumorceller til at overleve metabolisk stress eller anoikis, opretholde deres tilpasning til omprogrammeret stofskifte, støtte tumor udvikling ved at inducere hviletilstand og vedligeholdelse af overlevelse og selv-fornyelse af cancer stamceller. Desuden fordi autofagi spiller væsentlige roller i at bestemme, hvor tumorceller reagerer på behandlingen, er autophagy modulation anerkendt som en potentiel terapeutisk tilgang i kræft [4], [5]. Autophagy synes at repræsentere en gyldig mekanisme af resistens over for radio- og kemoterapi. Vores tidligere undersøgelser viste, at inhibering af autofagi med 3-methyladenin (3-MA) ​​eller lille interferens RNA målretning Atg7 (Atg7 siRNA) augmented effektiviteten af ​​5-FU ved at øge apoptose i human coloncancer [6], [7]. Autophagy er stærkt bevaret og stramt reguleret. Men de molekylære mekanismer, der regulerer autofagi som reaktion på cellulært stress stadig ikke godt forstået.

MikroRNA’er (miRNA), 18-25 nukleotider lange, er endogene små, ikke-kodende RNA, der regulerer ekspressionen af ​​deres målgener ved at inhibere translation eller spaltning messenger RNA (mRNA), hovedsagelig gennem interaktion ved 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) af mål-mRNA’er [8]. MiRNA kan samtidig regulere en lang række mål og biologiske netværk. Omvendt kan flere forskellige miRNA binde sig til og kooperativt styre en enkelt mRNA mål. MiRNA har vist sig at spille en vigtig rolle i at kontrollere mange cellulære funktioner, herunder vækst, differentiering, metabolisme og stressrespons og var en klar fordel fra et klinisk synspunkt [9] – [11]. I de senere år har nogle miRNA blevet undersøgt som mediatorer af autophagy regulering. MiRNA-30a kan sensibilisere hepatomaceller til cisplatin ved at målrette beclin-1-medieret autophagy [12]. MiRNA-101 har vist sig at være som en potent inhibitor af autofagi induceret af etoposid eller rapamycin i brystcancerceller [13]. Jegga et al. foreslog også, at miRNA-130, miRNA-98, miRNA-124, miRNA-204 og miRNA-142 har potentielle regulerende funktioner i autophagic proces baseret på beregningsmæssige analyse [14]. Den fysiologiske betydning af miRNA-autofagi sammenkobling er kun lige begyndt at blive belyst.

På grund af det store antal miRNA har miRNA microarray teknologi blevet anvendt i udstrakt grad for at bestemme den globale miRNA ekspression i visse situationer [15]. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsprofilen af ​​miRNA i responset af humane coloncancer-celler (HT29s) til 5-FU behandling, der bruger miRNA microarray analyse. For at prioritere de miRNA, der korrelerede med autophagy blev autofagi også induceret af et andet middel (næringsstof sult), og miRNA ekspression blev også observeret i denne sammenhæng. Den ændrede miRNA udtryk viste et samme mønster under begge betingelser blev yderligere vidnede ved QRT-PCR i tre menneskelige kolon cancer cellelinjer. Desuden blev bioinformatik forudsigelse af target gener, pathway analyse og gen-ontologi netværksanalyse også udført for bedre at forstå de roller disse miRNA i reguleringen af ​​autofagi. Vi identificerede og udvalgte fire nedreguleret miRNA og 27 opreguleret miRNA upon 5-FU behandling og sult i humane colon cancerceller. Disse 31 miRNA har de forudsagte målgener af reguleringen af ​​autofagi, herunder autophagy core gener og autofagi regulatorer og har potentiale til at modulere autofagi i 5-FU-baseret kemoterapi i CRC.

Materialer og metoder

Materialer

5-FU blev købt fra Sigma (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). LC3 polyklonalt antistof blev indkøbt fra MBL (MBL, Nagoya, Japan). Anti-P62 og anti-β-actin-antistoffer blev opnået fra Sigma, og mTOR antistof var fra Cell Signaling Technology (cellesignalering teknologi, Danvers, MA).

Cellekultur og behandling

HT29, HCT116 og DLD1 humane colorektale carcinomaceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection, venligst stillet til rådighed af Prof. Kuwano og dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2/95% luft med medium skifter hver to dage. Celler i midten af ​​log-fase blev anvendt i denne undersøgelse. For 5-FU-behandling blev HT29s behandlet med 5 pM af 5-FU i 24 timer. For næringsstofudsultning blev HT29s inkuberet i Krebs-Ringer-puffer [16] (120 mM NaCI, 5 mM KCI, 24 mM NaHCO

3, 5,6 mM glucose, 2 mM CaCl

2, pH 7,6) ved 37 ° C i 7 timer.

Måling af cellernes levedygtighed og apoptose

Cell levedygtighed blev bestemt ved anvendelse af Cell Counting Kit 8 (CCK-8). Celler blev podet i 96-brønds fladbundede mikrotiterplader ved en densitet på 1 x 10

3 celler pr. Efter behandling blev 10 pi af CCK-8-opløsning tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Absorbansen af ​​opløsningen blev aflæst spektrofotometrisk ved 450 nm med en reference ved 650 nm ved anvendelse af en mikrotiterpladelæser (BIO-TEK ELX800). Cellelevedygtighed blev beregnet ifølge følgende formel: cellelevedygtighed (%) = A450 (prøve) /A450 (kontrol) x 100

celle apoptose blev analyseret under anvendelse af Apoptose Detection kit.. Kort fortalt blev cellerne høstet og farvet med Annexin V-FITC (Annexin V) og propidiumiodid (PI). Apoptose blev defineret af Annexin V

+ /PI

-. (Tidlig apoptose) og Annexin V

+ /PI

+ (sent apoptose), som bestemt ved FACScan (Becton Dickinson)

Analyse af autophagy

Analyse af autofagi udførtes hovedsagelig ved immunofluorescens og immunoblotting for mikrotubulus-associeret protein 1B-let kæde 3 (LC3) som beskrevet tidligere [7], [16]. For at bestemme immunfluorescens af LC3 blev celler på kammeret slide fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,05% Triton X-100. Efter blokering blev cellerne inkuberet med et anti-LC3 antistof (1:500 fortynding) ved 4 ° C natten over og, inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret anti-kanin-antistof efter vask. Objektglas blev monteret og undersøgt ved anvendelse af et fluorescensmikroskop (ECLIPSE TE2000-U, Nikon). Farvning med 0,1 ug /ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) blev udført til identifikation kerne. For immunoblotting af LC3 blev 20 ug cellelysat separeres på en 5-20% Tris-Tricine Ready Gel SDS-PAGE (Bio-Rad) til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran blotting. Den blottede membran blev blokeret og inkuberet med anti-LC3 (1:1000 fortynding). De immunreaktive bånd blev visualiseret ved avanceret kemiluminescens under anvendelse peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-antistof (1:5000 fortynding). P62 og mTOR immunblotting (1:1000 fortyndinger begge) blev også udført for at evaluere autophagy tilstand.

RNA isolering og miRNA microarray

Totalt cellulært RNA blev høstet ved hjælp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ) og en miRNeasy mini kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Exiqon LNA MicroRNA Menneskelig Array herunder alle menneskelige modne miRNA (Database 18.0) blev anvendt til at profilere miRNA-ekspression og udført af Kangcheng Bio-Tech Inc. (Shanghai, Kina). Vi gjorde indsendelse af vores microarray data til Gene Expression Omnibus, og tiltrædelsen nummer er GSE61943. Kort fortalt blev RNA-prøver (1 ug) mærket ved anvendelse af et miRCURY Hy3 mærkning kit og hybridiseret på miRCURY LNA Array (v.18.0). Efter vask blev objektglassene scannet under anvendelse af en Axon GenePix 4000B microarray scanner, og den rå intensitet af billedet blev læst og analyseret under anvendelse GenePix Pro 6.0 software (Axon). Fire replikerede pletter af hver probe på samme dias blev midlet. Udtrykt miRNA-data blev normaliseret ved hjælp af Median normalisering. Efter normalisering blev differentielt udtrykte miRNA identificeret gennem Fold Skift filtrering ( = 2)

Real-time QRT-PCR-analyse for miRNA-ekspression

Kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (qRT-. PCR) blev udført for at validere miRNA array-data. Modne miRNA blev revers transkriberet til cDNA ved hårnåle-revers transkription under anvendelse af PrimeScript RT reagenskittet (Takara Bio, Shiga, Japan) og specifikke hårnåle-primere som vist i tabel 1. QRT-PCR for hver miRNA blev udført under anvendelse FastStart Essential DNA Green Master (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) på en lightcycle96 maskine (Roche) ifølge producentens instruktioner. De anvendte primere er anført i tabel 1. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer. MiRNA ekspressionsniveauer blev normaliseret til og kvantificeres ved U6 RNA. Relativ kvantificering blev beregnet ved anvendelse af 2

(- ΔΔCt). Metode

Target forudsigelse og funktionsanalyse

De målgener af miRNA blev forudsagt ved hjælp skæringspunktet mellem to store online miRNA target forudsigelse algoritmer, Targetscan (https://www.targetscan.org) [17] og PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de) [18], eller Targetscan og miRDB (http: //mirdb .org) [19], hvis der ikke var nogen data for nogle miRNA i PicTar.

DIANA-miRPath v2.0 (https://www.microrna.gr/miRPathv2) blev anvendt til at analysere de vigtigste funktioner på miRNA [20]. Generelt blev miRNA og sti-relaterede oplysninger fra miRBase og Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) v58.1 hhv. En ensidet Fishers eksakte test blev anvendt til at identificere de berigede Kegg veje med mål for specifikke miRNA, og den falske opdagelse sats (FDR) blev beregnet til at korrigere p-værdi. Enrichment tilvejebringer et mål for betydningen af ​​funktionen; som berigelse stiger, den tilsvarende funktion er mere markant.

Gene Ontology (GO) netværksanalyse blev også brugt til at analysere den vigtigste funktion af de forudsagte målgener og afdække miRNA-genet regulatoriske netværk på grundlag af biologiske processer og molekylære funktioner. Den CyTargetLinker plugin i Cytoscape (https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker) blev anvendt til at konstruere en integrativ netværk af miRNA-target interaktioner for de seks miRNA identificeret i vores undersøgelse [21], [22]. De validerede mål for hver miRNA blev opnået fra mirTarBase, og de forudsete mål blev opnået fra Targetscan.

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS-version 17.0 software. p. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

5-FU faldt levedygtighed HT29 humane kolon kræftceller,

Effekten af ​​de vigtigste CRC kemoterapi, 5-FU, i HT29 human colon cancerceller blev bekræftet ved en CCK-8 assay. 5-FU (0~500 uM) producerede en dosis- og tidsafhængig inhibering af cellelevedygtighed der nåede 64,20% og 42,20% efter 5 uM 5-FU behandling i 24 og 48 timer, (fig. 1). 5-FU kan have mange virkninger på HT29-celler. Flowcytometri af Annexin V og PI farvning blev anvendt til at detektere apoptose i vores eksperiment. Der har ringe apoptose i HT29-celler ved 5 uM 5-FU behandling i 24 timer (S1 Fig.).

HT29-celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer (5 uM og 25 uM) af 5-FU til 12, 24, og 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved CCK-8 assay. Data er vist som middelværdi ± SD.

5-FU inducerede aktivering af autofagi i HT29-celler

Aktivering af autophagy med 5-FU i HT29-celler blev detekteret ved LC3 immunofluorescens . I kontrolcellerne, fordelingen af ​​LC3 viste et diffust mønster (cytoplasma, LC3- I). 5-FU behandling ændret LC3 distribution til mange grove prikker og punktformig farvning (fig. 2A), og som tiden forøges, prikkerne blev mere intens. LC3-positive punctuates (LC3-II) repræsenterer autophagosomes. LC3 immunoblotting blev også anvendt til at observere autofagi (fig. 2C). LC3-II (16 kDa) blev induceret ved 5 uM 5-FU behandling i 24 timer. Som karakteristisk mekanisme til at inducere autophagy induktion, blev næringsstofudsultning også udført (fig. 2B). Sult gjort LC3 farvning mere intens, og i 7 timer, var der nogle punktformig farvning. Desuden blev intensiteten af ​​LC3 steg med sult i 7 timer. Som indikator for autophagy flux, blev P62 faldet både med 5-FU behandling og sult (fig. 2C). Efter 5 uM 5-FU behandling i 24 timer blev cellelevedygtighed af HT29-celler inhiberes, autophagy blev aktiveret, og der var næsten ingen apoptose. Derefter udførte vi globale udtryk profilering af miRNA microarray assays på begge HT29-celler sultet i 7 timer og HT29-celler behandlet med 5 pM 5-FU i 24 timer.

HT29 celler blev behandlet med 5 pM af 5-FU eller ikke. Aktivering af autophagy blev observeret ved LC3 immunofluorescens (A). HT29-celler blev udsultet i Krebs-Ringer puffer eller ej. Aktivering af autophagy blev observeret ved LC3 immunofluorescens (B). DAPI-farvning blev udført til identifikation kerne. LC3, P62 og mTOR immunoblotting blev udført under anvendelse af lysater af HT29-celler behandlet med 5 pM af 5-FU i 24 timer eller ej, og sultet i 7 timer eller ej (C). Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Bar, 20 pm.

Identifikation af ændret miRNA udtryk med 5-FU og sult i HT29-celler

Efter microarray scanning og normalisering, 124 ud af 1900 modne menneskelige miRNA blev identificeret som opreguleres af sult i 7 h i HT29-celler, og 56 miRNA blev nedreguleret. Med 5 uM 5-FU behandling i 24 timer, var der 302 opreguleres miRNA og 86 nedreguleret miRNA i HT29-celler. At prioritere de miRNA korreleret med ændringer i autofagi, de miRNA viser samme ændrede mønster under 5-FU behandling og sult (et andet standard middel til autophagy induktion) blev anset for mere tilbøjelige til at blive involveret i reguleringen af ​​autofagi. De miRNA viser samme ændrede mønster under disse to betingelser var 94 opreguleret miRNA og 22 nedreguleret miRNA (S1 tabel). Forudsigelsen af ​​miRNA-regulerede gen mål er et nødvendigt skridt for at forstå de funktioner i en given miRNA. Skæringspunktet mellem to forskellige programmer (algoritmer) blev rapporteret øget følsomhed forudsigelse. Targetscan identificerer mål med bevaret komplementaritet til frø (nukleotider 2-7) af miRNA [23]. Vi brugte skæringspunktet mellem Targetscan og PicTar at forudsige målgener af de ændrede miRNA. Hvis der ikke var nogen data i PicTar blev miRDB anvendes i stedet for PicTar. Samlet set vi identificeret og udvalgt fire nedreguleret miRNA, HSA-miR-302a-3P, HSA-miR-548ah-5p, HSA-miR-133b og HSA-miR-323a-3P, og 27 opreguleres miRNA, HSA-miR-203a , HSA-miR-99b-5p, HSA-miR-195-5p, HSA-lad-7c-5p, HSA-miR-320d, HSA-miR-301a-3p, vmiR-30e-5p, HSA-miR-374c -5p, HSA-miR-181a-5p, HSA-lad-7 g-5p, HSA-miR-513b-5p, HSA-miR-30b-5p, HSA-miR-19b-3p, HSA-miR-19a-3p , HSA-mIR-15a-5p, HSA-mIR-106b-5p, HSA-mIR-330-3p, HSA-mIR-582-5p, HSA-mIR-16-5p, HSA-mIR-30a-5p, HSA -miR-23a-3p, HSA-mIR-26b-5p, HSA-mIR-98-5p, HSA-mIR-186-5p, HSA-mIR-30d-5p, HSA-mIR-93-5p og HSA-miR -320c, som havende de forudsagte target gener involveret i reguleringen af ​​autofagi, som omfatter autophagy core gener og autofagi regulatorer (tabel 2).

Validering af microarray data ved hjælp af QRT-PCR i HT29, HCT11 og DLD1 celler

for at validere microarray data, vi udførte QRT-PCR på to nedreguleret (HSA-miR-302a-3p og har-miR-548ah-5 p) og fire opreguleret miRNA (HSA-miR- 30a-5p, HSA-miR-23a-3p, HSA-miR-195-5p og HSA-lad-7c-5p) i 5-FU behandlede eller udsultede HT29-celler. Fordi tyktarmskræft er heterogen, blev ændret ekspression af disse miRNA også bestemt i andre to human coloncancer-afledte cellelinier, HCT116 og DLD1. Vi fandt, at ekspressionen af ​​disse miRNA i overensstemmelse med resultaterne fra miRNA microarray analyse ændret betydeligt baseret på deres QRT-PCR aflæsninger (fig. 3).

Tre slags humane coloncancer-cellelinjer, HT29 (A ), DLD1 (B) og HCT116 (C), blev behandlet som beskrevet i fig. 2. QRT-PCR blev udført for at validere ændringen af ​​ekspressionen af ​​HSA-MIR-302a-3p, HSA-MIR-548ah-5p, HSA-MIR-30a-5p, HSA-MIR-23-3p, HSA-miR -195a-5p og HSA-lad-7c-5p under 5-FU-behandling (5-FU) og sult. Data er vist som middelværdi ± SD. * P 0,05. Forsøgene blev gentaget tre gange med reproducerbare resultater.

Pathway analyse og GO netværksanalyse afslørede miRNA-autophagy sammenkobling

For at få indblik i de funktioner af disse miRNA, DIANA-miRPath var anvendt til analyse Kegg pathways påvirket af disse 31 miRNA (fig. 4). Som følge heraf er de høje væsentlige berigning veje for de fire nedreguleret miRNA inkluderet MAPK signalvejen, som er rapporteret at positivt at deltage i reguleringen af ​​autofagi [24] (fig. 4A). Mere interessant, blandt de høje væsentlige berigning veje for de 27 opreguleres miRNA, mTOR-signalvejen blev signifikant identificeret ved disse miRNA (fig. 4B, 4C og 4D). Konsekvent blev proteinet niveau af mTOR faldt under disse to betingelser (fig. 2C). Derudover miRNA-mRNA gen netværksanalyse integreret disse miRNA og GOs ved at skitsere de interaktioner af miRNA og GO-relaterede gener ved hjælp Cytoscape software (fig. 5).

DIANA-miRPath v2.0 blev anvendt til at analysere vigtigste funktioner i de udvalgte 31 miRNA (A, de fire nedreguleret miRNA, B, miRNA opreguleret mere end fire gange under 5-FU behandling og sult, C, miRNA opreguleres mellem to- og fire gange under to forhold; D, miRNA opreguleres mere end fire gange og mellem to- og fire-fold). Den lodrette akse er Kegg pathway kategori, og den vandrette akse er den negative logaritme af

s Drømmeholdet værdi (-log

s

), som repræsenterer betydningen af ​​veje.

De integrative netværk blev oprettet ved hjælp Cytoscape software. Hvert netværk omfatter to typer af knuder, individuelle miRNA (røde cirkler) og deres forudsagte mRNA mål (lyserød sekskant), hidrører fra to forskellige offentlige databaser (miRTarBase og Targetscan). Grafen viser, at mRNA mål vises i to databaser, der er identificeret ved farven på de forbindende pile, miRTarBase (rød) og Targetscan (sort).

Diskussion

5 -FU kemoterapi er mainstream af adjuverende behandling af CRC. Autophagy modulation er blevet betragtet som en potentiel strategi til at gennemføre kemoterapi i tumorterapi [4]. MiRNA spiller en vigtig rolle i at kontrollere cellulære funktioner og er blevet rapporteret at være involveret i reguleringen af ​​autophagy i de senere år [25]. I vores forsøg blev induktion af autofagi bekræftet i HT29-celler af både 5-FU behandling og næringsstofudsultning. Brug miRNA microarray analyse, QRT-PCR, og bioinformatik, vi identificeret og udvalgt fire nedreguleret miRNA herunder HSA-miR-302a-3p og 27 opreguleres miRNA herunder HSA-miR-30a-5p, HSA-miR-23a-3p, hsa- miR-195a-5p, HSA-miR-99b-5p og HSA-lad-7c-5p under disse to betingelser for at have potentiale til at målrette gener involveret i reguleringen af ​​autophagy (tabel 2). Yderligere funktionelle analyser af disse miRNA skal udføres.

akkumulerende beviser tyder på, at autofagi spiller vigtige roller i tumorigenese og tumorterapi [3]. Det kan enten hæmme eller fremme tumorigenese afhængigt af den fase af tumor. Som til tumorterapi, vises autofagi at mediere virkningerne af anticancermidler som inhibering af autofagi undertrykker deres terapeutiske effektivitet. Autophagy kan også aktiveres som en pro-overlevelse respons på fremme terapeutisk imod cytotoksisk terapi. Og inhiberingen af ​​autofagi forbedrer lægemiddel- eller stråleinduceret celledød, som vi har rapporteret [6], [7]. Molekyler, der er involveret i reguleringen af ​​den autophagic proces er dukket op som lovende mål for innovative anticancer behandlinger [4].

Autophagy (hovedsagelig macroautophagy) er en stramt reguleret, bevaret kataboliske proces. Efter induktion er dele af cytoplasmaet sekvestreret i karakteristiske dobbelt-membranvesikler kendt som autophagosomes (vesikel nukleering, vesikel forlængelse og hentning). Efterfølgende autophagosomes fuse med sene endosomer eller lysosomer, danner autolysosome (fusion). Eksponering af det indre rum til lysosomale hydrolaser forårsager nedbrydning af cytoplasmatiske fragt, og de resulterende nedbrydningsprodukter udsættes derefter i cytosolen til genbrug. Stram styring af autofagi er afgørende for cellehomeostase og respons på cellulært stress. En stor familie af centrale autophagy regulatorer, at autophagy (ATG) -relaterede gener, tjener til koordineret regulere den trinvise progression af autophagy fra autophagy induktion til vesikel kernedannelse, vesikel forlængelse, hentning og fusion [26]. Derudover et mangfoldigt og komplekst netværk af upstream signalveje bidrager til autophagy regulering herunder phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), RAS-proto-onkogen og AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) baner, hvoraf mange konvergerer ved den mammalian target of rapamycin kompleks en (mTORC1), en vigtig negativ regulator af autofagi signalering [27].

i vores eksperiment, 27 miRNA, der potentielt er målrettet gener, der regulerer autofagi viste sig at være opreguleret efter 5-FU behandling eller sult. Pathway analyse foreslog, at mTOR-signalvejen var signifikant identificeret af disse miRNA. Det blev tidligere påvist i brystcancerceller, som næringsstofudsultning resulterer i en stigning i autophagy gennem hæmning af mTOR [28]. Vores resultater kraftigt støttede også denne effekt i løbet af 5-FU-induceret autophagy i tyktarmen kræftceller. Blandt disse miRNA, de forudsagte målgener af HSA-miR-99b-5p inkluderet mTOR. Og stigningen i denne miRNA på to typer af autophagy induktion (5-FU behandling og sult) var signifikant, 5.624 og 6.243 gange højere end kontrollen. HSA-miR-99b-5P garanterer yderligere undersøgelse i reguleringen af ​​autophagy i 5-FU behandling i human tyktarmskræft. Ud over den mTOR nettet, så er der beclin1 netværk også rapporteret at regulere autofagi i brystcancer [29]. Den Bcl2 familie blokerer sult-induceret autophagy ved at interagere med BH3 domæne Beclin1 og er negative regulatorer af autofagi. I vores eksperiment, HSA-lad-7c-5p, HSA-miR-195-5p, HSA-miR-23a-3p, HSA-miR-15a-5p, HSA-miR-98-5p, og HSA-miR-181a -5p forudsiges at målrette gener i Bcl2 familie og også berettige til yderligere undersøgelse. Selv om disse 27 miRNA viste opreguleret udtryk under disse to metoder til autophagy induktioner, de forventes at målrette autophagy core gener; HSA-miR-30a-5p målretning af BECN1 og ATG5 er påvist i de foregående rapporter [30]. Funktionen af ​​disse miRNA skal undersøges nærmere. Desuden var der kun fire nedreguleret miRNA med forudsagte mål involveret i autophagy regulering, mindre end mængden af ​​opreguleres miRNA. Det viste også vigtigheden af ​​mTOR-signalvejen i reguleringen af ​​autofagi. Endvidere forudsagde målgener inkluderet autofagi core gener; HSA-MIR-302a-3p mål ULK1 og HSA-MIR-548ah-5p målretter ATG16L1, antyder, at disse fire miRNA deltage i autofagi proces i 5-FU behandling og har potentiale til at blive anvendt til at manipulere autofagi i 5-FU baseret kemoterapi i CRC.

roller autophagy i kræft er afhængige af typen af ​​kræft, sammenhæng og sted [4]. I denne undersøgelse fokuserede vi på 5-FU-induceret autophagy i human tyktarmskræft baseret på vores og andre tidligere rapporter. Der havde 4 nedreguleret miRNA herunder HSA-miR-302a-3p og HSA-miR-548ah-5p; og 27 opreguleret miRNA herunder HSA-lad-7c-5p og HSA-miR-30a-5p på 5-FU behandling og sult i humane colon cancerceller. Disse 31 miRNA har de forudsagte målgener af reguleringen af ​​autophagy, herunder autophagy core gener og autofagi regulatorer og er lovende mål for autophagy graduering i 5-FU-baseret kemoterapi i CRC. Disse data kunne også kaste lys over miRNA-autofagi interaktioner i andre typer kræft samt give en mekanisme til potentielt regulere autofagi i klinisk praksis.

Støtte Information

S1 Fig.

5-FU inducerer lidt apoptose i HT29-celler. HT29-celler blev inkuberet med 5-FU i 24 timer. Flowcytometri under anvendelse af Annexin V og PI blev udført for at påvise apoptose i vores eksperiment. Der var lidt apoptose af HT29-celler efter 5-FU behandling i 24 timer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114779.s001

(TIF)

S1 tabel.

Differential miRNA udtryk i sult (Starv) versus kontrol (Ctrl) og 5-FU versus kontrol (DMSO) i HT29

doi:. 10,1371 /journal.pone.0114779.s002

(DOC)

tak

Vi takker Prof. Kuwano H og Prof. Torii S (graduate school of Medicine, Gunma University, Maebashi, Japan) for deres venlige hjælp. Vi takker også Aiying Wang og Lin Yu for deres tekniske support.