PLoS ONE: AF1q: A Novel Mediator af Basal og 4-HPR-induceret apoptose i kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Baggrund

Fenretinid (4-HPR) er et syntetisk retinoid, som udstiller potent antitumor og kemoforebyggende aktiviteter mod forskellige maligniteter, herunder ovarietumorer. Vi har tidligere vist, at i æggestokkene cancerceller, 4-HPR inducerer apoptose gennem en signaleringskaskade startende fra reaktive ilt arter (ROS) generation og inddrage endoplasmatiske reticulum (ER) stress respons, jun N-terminal kinase (JNK) aktivering og induktion af den proapoptotiske placentalt knoglemorfogenetisk protein (PLAB). Da de seneste undersøgelser har vist, at onkogenet ALL1-kondenseret fra kromosom 1q (AF1q), en retinsyre målgen, er impliceret i apoptose induktion af flere terapeutiske midler, undersøgte vi dens mulige involvering i apoptose induceret af 4-HPR i ovariecancer celler.

Metode /vigtigste resultater

Proteinekspression analyse, udført i æggestokkene cancerceller og udvides til andre histotypes (bryst, neuroblastom, og livmoderhalskræft), viste, at 4-HPR forbedret AF1q udtryk i cancerceller følsomme for retinoidet men ikke i resistente celler. Gennem gene silencing, blev AF1q fundet funktionelt involveret i 4-HPR-induceret apoptose i A2780, en ovariecancer cellelinie meget følsomme retinoid vækstinhiberende og apoptotiske effekter. Hæmning af signal- mellemprodukter på det 4-HPR apoptotiske kaskade viste, at AF1q opregulering blev afhang af forudgående generation af ROS, induktion af ER stress respons, JNK-aktivering, og PLAB upmodulation. Endelig fandt vi, at direkte overekspression af AF1q, i mangel af eksterne stimuli, øget apoptose i æggestokkene kræftceller.

Konklusioner /Betydning

Undersøgelsen udvider kendskabet til 4-HPR virkningsmekanisme, som endnu ikke er blevet fuldstændigt belyst, identificere AF1q som en ny mediator af retinoid anticanceraktivitet. Derudover viser vi, for første gang, at AF1q spiller en rolle i indtræden af ​​basal apoptose i ovariecancerceller, hvilket giver ny information om aktiviteten af ​​dette protein, hvis biologiske funktioner er hovedsagelig ukendt.

Henvisning: Tiberio P, Cavadini E, Callari M, Daidone MG, Appierto V (2012) AF1q: A Novel Mediator af Basal og 4-HPR-induceret apoptose i æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 7 (6): e39968. doi: 10,1371 /journal.pone.0039968

Redaktør: Maurizio D’Incalci, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Italien

Modtaget: Marts 5, 2012; Accepteret: 5 Jun 2012; Udgivet: 26 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Tiberio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af midler fra italienske borgere, der er tildelt den 5 × 1000 andel af deres skattebetaling til støtte for Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori ifølge italienske love (INT-Institutionelle strategiske projekter “5 × 1000«; www.lavoro.gov. det/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Retinoider, en stor familie af naturlige og syntetiske forbindelser strukturelt beslægtet med vitamin a (retinol), er vigtige signaleringsmolekyler, der regulerer en lang række biologiske processer, såsom embryonisk udvikling, differentiering, opretholdelse af epitelvæv, reproduktion , vision, proliferation og apoptose [1], [2]. N- (4-hydroxyphenyl) retinamid (4-HPR), også kendt som fenretinid, er en syntetisk vitamin A-derivat veltolereret hos mennesker, der har vist sig som en af ​​de mest lovende retinoider i klinikken til forebyggelse og behandling af talrige maligniteter [ ,,,0],3] – [7]. 4-HPR har vist sig at muligvis reducere forekomsten af ​​kræft i æggestokkene og til at bestemme, i præmenopausale kvinder, en signifikant reduktion i risikoen for en anden brystkræft, der varer i mindst 15 år [3], [6]. Selvom 4-HPR virkningsmekanismer har været en vigtig fokus for forskningen i det seneste årti, de molekylære begivenheder medieret af retinoid synes facetter og har ikke været helt belyst [8]. I modsætning klassiske retinoider (såsom hel-trans-retinsyre), som ofte inducerer differentiering og /eller cytostase ved at aktivere familien af ​​nukleare retinsyrereceptorer (RAR), har 4-HPR blevet vist at fremkalde forskellige biologiske virkninger gennem både retinoid receptor afhængige og -uafhængige mekanismer [9].

i dyrkede celler, 4-HPR er blevet vist at inhibere celleproliferation og fremme apoptose medieret, i det mindste delvis, ved genereringen af ​​reaktive oxygenspecies (ROS) og deraf følgende oxidativ stress [8] – [11]. Vi har tidligere dokumenteret, at, i æggestokkene cancerceller, 4-HPR induceret apoptose gennem en signaleringskaskade startende fra ROS produktion og involverer endoplasmatiske reticulum (ER) stress respons, Jun N-terminal kinase (JNK) aktivering og induktion af proapoptotiske placenta knoglemorfogenetisk protein (PLAB, også kendt som NAG-1, GDF15, MIC-1, PDF, og PTGFB) (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [11], [12].

ALL1 -kondenseret fra kromosomet 1q (AF1q, også kendt som MLLT11) genet, placeret i kromosom 1, band 21, koder for et lille protein på 9 kDa uden veldefinerede funktionelle domæner og ingen lighed med andre kendte proteiner [13]. De mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af ​​AF1q udtryk er blevet undersøgt på mRNA og protein niveauer. En stigning i AF1q mRNA-niveauer er blevet vist i retinsyre (RA) responsivt neuroblastomceller efter eksponering for retinoid, således identificere AF1q som RA-målgen [14]. For nylig er det blevet påvist, at AF1q mRNA-ekspression er direkte reguleret af microRNA29b [15], hvorimod proteinet underkastes ubiquitinmedieret nedbrydning af proteasomet i centrosomal område [16]. AF1q blev oprindeligt defineret som en onkogen faktor impliceret i en translokation t (1; 11) (q21; q23) ansvarlig for tilfælde af leukæmi [13]. Desuden blev en høj ekspression af genet rapporteret at være associeret med en dårligt resultat i pædiatrisk akut myeloid leukæmi (AML), adult normal cytogenetiske AML, og voksen myelodysplastisk syndrom [17] – [19]. Selvom de biologiske funktioner af AF1q er stort set ukendte, har en potentiel onkogen funktionen af ​​proteinet også blevet foreslået i faste tumorer såsom brystcancer og thyreoidea oncocytic og testikulære kimcelletumorer [20] – [23]. Ud over den foreslåede onkogene rolle AF1q, er det blevet rapporteret, at proteinet kan regulere BAD-medierede apoptotiske vej via NF-kB, dermed spiller en rolle i reguleringen af ​​apoptose og i lægemiddelresistens [24], [25] . Et fald i AF1q ekspression i sammenhæng med reduceret doxorubicin følsomhed er blevet observeret i humane skællede carcinomceller, og knockdown af proteinet har vist sig at nedsætte apoptotisk celledød induceret af flere terapeutiske midler, såsom doxorubicin og γ-stråling [24], [ ,,,0],25].

den foreliggende undersøgelse undersøgte inddragelse af AF1q i 4-HPR-induceret apoptose i æggestokkene tumorceller. Vi dokumenterer, at 4-HPR behandling forøger AF1q ekspressionsniveauer i cancerceller følsomme over for retinoid og at en sådan opregulering er en vigtig begivenhed i den 4-HPR signalering kaskade, der fører til apoptose gennem ROS-generering, ER stress respons, JNK-aktivering, og PLAB opregulering. Endelig ved AF1q overekspression, demonstrerede vi en rolle AF1q i starten af ​​basal apoptose i æggestokkene cancerceller.

Resultater

4-HPR inducerer AF1q Opregulering i ovariecancerceller Følsomme til retinoid men ikke i resistente celler Salg

Siden AF1q blev vist at spille en rolle i apoptose induceret af flere terapeutiske midler og at være reguleret af RA [14], [24], [25], søgte vi at undersøge potentielle bidrag af proteinet i den apoptotiske aktivitet af det syntetiske retinoid 4-HPR. Vi analyserede virkningen af ​​4-HPR behandling på AF1q ekspression i den humane ovariecancer-cellelinje A2780, som er yderst følsom over for antiproliferative og apoptotiske virkninger af retinoidet [26], [27], og i sin modpart A2780 /HPR, som har induceret resistens mod 4-HPR [28]. Proteinekspression analyse viste, at A2780-celler udtrykte konstitutivt AF1q protein og at behandling med 5 og 10 uM 4-HPR i 24 timer forøgede dets ekspression i en dosisafhængig måde (figur 1A). I modsætning hertil 4-HPR behandling ikke forårsage nogen stigning i AF1q proteinekspression i A2780 /HPR-celler, selv om cellerne konstitutivt udtrykte det (figur 1B). Sådanne data antydede en associering mellem AF1q induktion med 4-HPR behandling og celle følsomhed over for retinoidet.

Western blot-analyse for AF1q ekspression i A2780 (A) og A2780 /HPR (B) celler behandlet i 24 timer med 5 og 10 uM 4-HPR. Som en kontrol for lastning blev blots inkuberet med actin antistof.

4-HPR Forbedrer AF1q ytringsfrihed i andre ovariecancerceller og i kræftceller i forskellige Histotypes

For at vurdere om 4-HPR-induceret AF1q opregulering var begrænset til A2780 celler eller repræsenterede en karakteristisk virkningsmekanisme af retinoid, vi udvidet analysen af ​​AF1q udtryk for andre humane cancerceller med forskellige følsomheder til antiproliferativ virkning af 4-HPR. Behandling med 5 uM 4-HPR i 24 timer inducerede AF1q opregulering i de følsomme ovariecancer cellelinier OVCA432 og SKOV-3 [27] (figur 2A), samt i reagerende celler i forskellige histotypes, dvs., brystadenocarcinom T47D og neuroblastom SK-N-BE [27] (figur 2B). I modsætning hertil i celler naturligt resistente over for 4-HPR vækstinhiberende aktivitet såsom ovariecancer cellelinien OVCAR-3 [27] og de cervikale carcinomcellelinjer HeLa (IC

50 10 pM, ved 72 timer, data ikke vist), hverken 5 uM (data ikke vist) eller 10 pM 4-HPR behandling i 24 timer medførte upmodulation af AF1q ekspression (figur 2C). Resultaterne antydede, at 4-HPR-induceret AF1q opregulering ikke kun forekommer i A2780 celler, men var en egenskab ved cancerceller reagerer på retinoid.

Western blot-analyse for AF1q ekspression i OVCA432 og SKOV-3 (A ) celler, i T47D og SK-N-BE (B) celler og i OVCAR-3 og HeLa (C) celler behandlet i 24 timer med 4-HPR i de angivne doser. Som en kontrol for lastning blev blots inkuberet med actin antistof.

AF1q Opregulering i A2780 celler er associeret til retinoid evne til at hæmme cellevækst og inducere apoptose

Analyse af foreningen mellem AF1q ekspression og tumorvækst inhibitoriske og apoptotiske effekter blev udvidet til andre naturlige og syntetiske retinoider, dvs., RA, og N- (4-methoxyphenyl) retinamid (4-MPR) og 4-oxo-N- (4-hydroxyphenyl) retinamid (4-oxo-4-HPR), to 4-HPR metabolitter. Vi har tidligere vist, at 4-oxo-4-HPR har en vækstinhiberende virkning (IC

50 = 0,6 uM, 72 timer) og inducerer apoptose i A2780 celler, hvorimod 4-MPR og RA ikke påvirker en sådan vækst (IC

50 10 uM, ved 72 timer for begge retinoider) [27] – [29]. Som vist i figur 3, i A2780-celler behandlingen med RA, samt med 4-MPR, ikke påvirkede hverken AF1q ekspression eller caspase-3-aktivering, hvorimod 4-oxo-4-HPR behandling førte til en stigning i AF1q ekspression og til caspase-3-spaltning (figur 3). Dataene viste, at retinoid-induceret AF1q opregulering var forbundet med evnen hos forbindelsen til at inhibere cellevækst og at inducere apoptose.

Western blot analysiso for AF1q ekspression og caspase-3-spaltning i A2780-celler behandlet i 24 timer med 10 pM RA eller 4-MPR, eller 3 pM 4-oxo-4-HPR. Som en kontrol for lastning, blev blottet inkuberet med actin antistof.

AF1q Opregulering er Funktionelt involveret i apoptose induceret af 4-HPR i A2780 Celler

For at undersøge potentielle rolle AF1q i 4-HPR-medieret apoptose, udførte vi AF1q silencing ved transiente transfektioner af A2780 celler med et plasmid, der udtrykker en AF1q siRNA eller en kodet nonsilencing siRNA anvendt som kontrol. Transfektion med AF1q siRNA reducerede både basal og 4-HPR-induceret AF1q ekspression og klart faldt 4-HPR-induceret apoptose, som det er vist ved spaltning af caspase-3 (figur 4), hvilket viser, at AF1q spillet en rolle i apoptoseinduktion ved 4- HPR i A2780-celler. Under de samme eksperimentelle betingelser, vi ikke observere modulation af proapoptotiske protein BAD (figur 4), tidligere vist at være reguleret af AF1q i humane skællede carcinomceller [24], [25].

Western blot analysiso for AF1q ekspression, caspase-3-spaltning, og Bad ekspression i A2780-celler transient transficeret med et plasmid indeholdende et AF1q siRNA eller en kodet nonsilencing siRNA efter tilsætning af 5 pM 4-HPR i 24 timer. Som en kontrol for lastning, blev blottet inkuberet med actin antistof.

AF1q er involveret i de apoptotiske signaleringskaskade induceret af 4-HPR i A2780 Celler

Vi har tidligere rapporteret, at 4 -HPR-induceret apoptose forekommer gennem en signaleringskaskade involverer ROS-generering, ER stress induktion, JNK-aktivering og PLAB opregulering (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [11], [12]. Vi derfor vurderet om AF1q var involveret i den førnævnte apoptosecyklus ved at teste virkningerne af hæmning af disse signaler mellemprodukter den 4.-HPR-induceret AF1q upmodulation. Til dette formål A2780 celler blev co-behandlet med 4-HPR og igen med antioxidanten vitamin C, ER stress inhibitor salubrinal, og den farmakologiske JNK inhibitor SP600125, der er blevet demonstreret at forhindre ROS-generering, eIF2α dephosphorylering, og JNK-aktivering, og over for kraftigt reducere 4-HPR-induceret apoptose i samme cellelinje [11]. Tilsætning af 100 pM vitamin C til A2780 celler behandlet med 5 pM 4-HPR i 24 timer modvirkede 4-HPR-induceret opregulering af AF1q (figur 5A). Tilsvarende tilsætning af 10 uM salubrinal eller 10 uM SP600125 stærkt reduceret 4-HPR-induceret AF1q opregulering (figur 5B og 5C). For at undersøge om opregulering af AF1q var en nedstrøms begivenhed også af PLAB opregulering induceret af 4-HPR har PLAB blevet slået ned med en syntetisk siRNA targeting PLAB mRNA. Som vist i figur 5D, behandling af A2780 celler med PLAB-specifikke siRNA var i stand til kraftigt at reducere 4-HPR-induceret PLAB samt AF1q upmodulation sammenlignet med cellerne transficeret med en kontrol siRNA. Omvendt oplyste AF1q lyddæmpning ikke påvirke 4-HPR-induceret PLAB opregulering (figur 5E). De førnævnte data viste, at AF1q opregulering i A2780 celler var afhængig af forudgående aktivering af 4-HPR-induceret-ROS-relateret signaleringskaskade, og at dens upmodulation forekom nedstrøms for PLAB induktion (figur 6).

Western blot analyse for AF1q ekspression i A2780-celler behandlet i 24 timer med 5 uM 4-HPR, med eller uden 100 C pM vitamin (A), 10 uM salubrinal (B), eller 10 uM SP600125 (C). (D) Western blot-analyse for AF1q ekspression i A2780-celler stabilt transficeret med et plasmid indeholdende et PLAB siRNA eller en kodet nonsilencing siRNA efter tilsætning af 5 pM 4-HPR i 24 timer. Som en kontrol for lastning, blev blottene inkuberet med actin antistof.

4-HPR inducerer apoptose gennem en signaleringskaskade involverer oxidativ stress, ER stress respons, JNK-aktivering, overekspression af proapoptotiske protein PLAB, og AF1q opregulering.

AF1q spiller en rolle i induktion af Basal apoptose i ovariecancerceller

for at undersøge sammenhængen mellem AF1q induktion og apoptose debut, vi analyseret, om direkte overekspression af AF1q, i mangel af eksterne stimuli, kan forårsage apoptose. Til dette formål blev A2780 celler transient transficeret med en grønt fluorescerende protein (GFP) -mærket AF1q vektor. Celler transficeret med en vektor, der koder for GFP blev anvendt som kontrol. 48 timer efter transfektion blev nuklear fragmentering og chromatinkondensation overvåges i grønne fluorescerende celler ved farvning cellekerner med Hoechst 33342 (figur 7A). Som vist i figur 7B (venstre panel) viste GFP-AF1q-overudtrykkende celler en markant stigning i apoptotiske kerner i forhold til kontrol celler transficeret med GFP alene. En lignende virkning blev observeret, når analysen blev udført i OVCAR-3 celler, en anden ovariecancer cellelinie, som til forskel fra A2780 celler, var resistent over for 4-HPR antiproliferativ virkning og ikke konstitutivt udtrykker AF1q. Transfektion med GFP-AF1q inducerede også i OVCAR-3 en stigning i basal apoptose forhold til transfektion med GFP (figur 7B, højre panel). Disse resultater viste en rolle for AF1q i indtræden af ​​apoptose i ovariecancerceller.

(A) Immunofluorescensanalyse af A2780 celler transient transficeret med GFP alene (øverste paneler) eller GFP-mærkede AF1q vektor (AF1q-GFP ) (nedre paneler). Efter 48 timer blev GFP og AF1q-GFP-celler farvet med Hoechst 33342 og nuklear morfologi blev undersøgt med et fluorescensmikroskop. Celler af interesse er markeret med pile. Celler med kondenseret og fragmenterede kerner blev identificeret og scoret som apoptotiske celler. Et eksperiment repræsentativt for tre er vist. Skalaen søjle repræsenterer 10 um. (B) Apoptose blev repræsenteret som en procentdel af apoptotiske celler pr 100 grønne fluorescerende celler (mindst 200 celler per prøve) i A2780 (venstre panel) og OVCAR-3 (højre panel) celler transficeret som i (A). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. Stjerner angiver signifikant forskel (P 0,05)

Diskussion

De seneste resultater, at AF1q genet, ved siden af ​​sin dokumenterede onkogene funktion [17] – [23], spiller en rolle. i apoptose regulering i cancerceller [24], [25] og det faktum, at det er blevet beskrevet som en RA-target-genet [14], fik os til at undersøge dens mulige involvering i apoptose induceret af det syntetiske nonclassic retinoid 4-HPR. Den foreliggende undersøgelse identificerede AF1q som en ny mediator af apoptose induceret af 4-HPR og fremlagde beviser for en rolle af proteinet i indtræden af ​​basal apoptose i ovariecancerceller. Vi viste, at i A2780, en human ovariecarcinom cellelinie meget følsomme til vækstinhiberende og apoptotiske virkninger af retinoidet [26], [27], 4-HPR-induceret apoptose blev ledsaget af en stigning i AF1q proteinekspression. I modsætning hertil blev upmodulation af AF1q ikke observeret, når A2780 /HPR-celler, en 4-HPR resistent variant afledt fra A2780-celler [28], blev behandlet med retinoidet. Analyse af AF1q ekspression, udvidet til et panel af humane cancercellelinier (ovarie-, bryst-, hals-, og neuroblastom) med forskellige følsomheder til 4-HPR antiproliferativ virkning [27], bekræftede, at upmodulation af proteinet efter 4-HPR eksponering var et fælles træk ved 4-HPR responsive celler, men forekom ikke i cancerceller resistente over for retinoid.

Sammenhængen mellem celle følsomhed over for 4-HPR anticancer effekter og AF1q opregulering foreslået en rolle for AF1q som en formodet mediator af 4-HPR-aktivitet. Hypotesen blev også understøttet af, at AF1q udtryk selektivt blev opreguleret med 4-HPR og ved dets aktive metabolit 4-oxo-4-HPR, men ikke af RA eller 4-MPR, der har undladt at inducere celledød i A2780 celler [ ,,,0],27] – [29]. Manglen på induktion af AF1q og apoptose efter at udfordre cellerne med RA er i overensstemmelse med det spørgsmål, som 4-HPR biologiske virkninger og mekanismerne bag sine anticancer aktiviteter i høj grad adskiller sig fra de klassiske retinoider [9], og er i stedet mere tæt på dem, der er beskrevet for atypiske retinoider [30]. En direkte forbindelse mellem AF1q opregulering og apoptose induceret af 4-HPR blev påvist ved AF1q lyddæmpning, som førte til en reduktion i 4-HPR-induceret apoptose, hvilket således indikerer, at AF1q er, i det mindste delvis, er ansvarlig for de apoptotiske virkninger forårsaget af retinoidet i ovariecancerceller.

Vi har tidligere vist, at 4-HPR kunne forårsage apoptose i ovariecancerceller gennem aktivering af ROS → eR stress → JNK → PLAB signaleringskaskade [11], [12 ]. Induktion af en sådan kaskade var karakteristisk kun for cancerceller reagerer på 4-HPR og blev ikke aktiveret i 4-HPR-resistente celler [12]. Vores hypotese således at 4-HPR-induceret opregulering af AF1q, som kun forekom i celler er følsomme for retinoidet, kunne være et mellemprodukt med den førnævnte apoptotiske vej. I overensstemmelse med denne hypotese, fandt vi, at opregulering af AF1q forekom nedstrøms for ROS-generering, ER stress respons, JNK-aktivering, og PLAB opregulering induceret af 4-HPR. Faktisk ved at inhibere pathway på forskellige niveauer under anvendelse af in dreje antioxidant vitamin C, den selektive inhibitor af eIF2α dephosphorylering salubrinal, og JNK-inhibitor SP600125 (alle tidligere vist sig at beskytte A2780 celler fra 4-HPR-induceret apoptose [12]) viste vi, at 4-HPR-induceret AF1q opregulering var stærkt reduceret. Endvidere silencing af den proapoptotiske protein PLAB (tidligere vist sig at reducere 4-HPR-induceret apoptose [11]) forårsagede en nedsat evne retinoidet at øge AF1q ekspression. Omvendt oplyste AF1q inaktivering ikke påvirke evnen af ​​4-HPR at inducere PLAB opregulering De førnævnte resultater viste, at AF1q var et mellemprodukt med ROS-relaterede signaleringskaskade aktiveres af 4-HPR til at inducere apoptose, og at AF1q upmodulation forekom nedstrøms PLAB induktion (figur 6). Dog kan bidraget fra andre ROS-afhængige signaler til 4-HPR-induceret AF1q upmodulation ikke udelukkes. Ikke overraskende fandt vi, at AF1q også blev opreguleret efter behandling med 4-oxo-4-HPR, en 4-HPR polær metabolit stand til at aktivere den førnævnte apoptotiske kaskade (fra ROS generation til PLAB induktion) [31].

Efter aftale med vore observationer, analyse af en offentligt tilgængelig microarray eksperiment datasæt den 4.-HPR-behandlede og ubehandlede CD34 + celler fra fire kronisk myeloid leukæmi patienter (GEO tiltrædelsespartnerskaber: GSE17480) viste, at retinoid inducerede en seks-dobling i AF1q mRNA-ekspression (P 0,01) (Figur S1). I de samme celler, 4-HPR var i stand til at inducere apoptose – foreslået at være medieret af induktion af oxidativt stress, hvilket bekræfter forholdet mellem ROS-medieret-apoptose induceret af 4-HPR og AF1q overekspression

Ifølge. til den apoptotiske rolle foreslået af vores observationer, er blevet rapporteret AF1q involvering i apoptose regulering og i resistens af en anden forskergruppe [24], [25]. Forfatterne viste, at i humane skællede carcinomceller, blev AF1q nedregulering forbundet med en doxorubicin-resistent celle fænotype og at AF1q upmodulation forårsagede en øget doxorubicin og γ-stråling-induceret apoptose ved transaktivering af den proapoptotiske protein BAD via NF-KB [24], [25]. I modsætning hertil har vi ikke observere opregulering af dårligt i AF1q-medieret apoptose induceret af 4-HPR i A2780 celler. Faktisk gjorde 4-HPR behandling ikke modulere BAD udtryk, heller ikke AF1q lyddæmpende forårsage ændringer i sine protein niveauer. En mulig forklaring kunne være, at AF1q anderledes kan påvirke BAD udtryk i forskellige cancer celletyper og /eller som reaktion kun for bestemte stimuli. Det er imidlertid interessant at bemærke, at, som for 4-HPR og 4-oxo-4-HPR [12], [31], doxorubicin og γ-stråling-induceret apoptose er også rapporteret at være forbundet til ROS-generering [32] – [34]. Derfor er det fristende at spekulere, at AF1q-medieret apoptose kunne være afhængig af forudgående induktion af oxidativt stress, ikke kun for 4-HPR og 4-oxo-4-HPR, men også for andre kemoterapeutiske midler, selv på nuværende tidspunkt ikke tilstrækkelig dokumentation understøtter sådan . en hypotese

et vigtigt resultat af vores undersøgelse er angivelsen af ​​en rolle AF1q i starten af ​​basal apoptose: AF1q upmodulation opnået ved transient transfektion i æggestokkene cancerceller forårsaget, i mangel af eksterne stimuli, en stigning i den apoptotiske sats, hvilket viser en rolle AF1q i aktivt at inducere apoptose i disse celler. En omfattende forståelse af de præcise fysiologiske og patologiske funktioner af AF1q er afgjort i sin vorden. Men de få undersøgelser, der har undersøgt sin rolle afslørede, at det kunne være impliceret i både hæmning og fremme af kræft progression [17] – [25]. Foruden tegn på en rolle som apoptose mediator har AF1q blevet defineret som et onkogent faktor involveret i hæmatologiske maligniteter og i faste tumorer [17] – [23]. Det er bemærkelsesværdigt at konstatere, at i lighed med den rapporteret for AF1q har PLAB også blevet vist at være forsynet med en dobbelt funktion i cancer progression [35]. Faktisk kan dette medlem af den transformerende vækstfaktor-β superfamilien faktisk negativt eller positivt modulerer celleproliferation og apoptose og kan bidrage til kræft migration, invasion, og metastase. Selvom de mekanismer, der regulerer de pleiotrope funktioner af PLAB stadig ikke godt forstået, er det blevet foreslået, at proteinet kan fungere som en tumorsuppressor i de tidlige stadier af malignitet, hvorimod det kan fremme tumorudvikling i fremskredne stadier af cancer [35] . En spændende overvejelse er, at PLAB og AF1q har andre fælles træk: De er både RA-målgener og er i stand til at inducere apoptose i fravær af eksterne stimuli [11], [36]. Selv er nødvendigt at definere de nøjagtige funktioner AF1q og at undersøge den mulige sammenhæng mellem PLAB og AF1q yderligere undersøgelser, de nuværende data viser for første gang en sammenhæng mellem disse to proteiner.

Som konklusion, vores undersøgelse udvider kendskabet til virkningsmekanismer af 4-HPR, at selv om undersøgt i mange år, er endnu ikke blevet fuldstændigt belyst [8]. Identifikation af nye mål for retinoidet er et vigtigt problem, fordi det kan føre til lette fremtidige design af lægemiddel kombination strategier og overvinde og forebygge udviklingen af ​​resistens. Derudover giver vi nye oplysninger om aktiviteten af ​​AF1q, en cancer-relateret protein, hvis biologiske funktioner er stort set ukendt. Specifikt rapporterer vi at AF1q er involveret i 4-HPR apoptotiske og væksthæmmende effekter, og at dens opregulering afhænger af aktivering af ROS-relaterede signaleringskaskade induceret af retinoidet, således at opdage en hidtil ukendt forbindelse mellem oxidativ stress og AF1q. Endelig viser vi for første gang en rolle for AF1q i induktion af basal apoptose i æggestokkene cancerceller, selv om der er behov for yderligere undersøgelser for at definere de molekylære mekanismer bag AF1q-medieret apoptose.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

æggestokkene tumorcellelinier A2780 (opnået fra Dr. Ozols, Bethesda, MD, USA) [31], OVCA432 (opnået fra Dr. Knapp, Boston, MA, USA ) [12], OVCAR-3 [12], SKOV-3 [12], og den neuroblastomcellelinje SK-N-BE (alle tre indkøbt fra ATCC, Manassas, VA, USA) [31] blev opretholdt i RPMI 1640 (Lonza, Basel, Schweiz) indeholdende 10% føtalt kalveserum. A2780 /HPR (dvs. A2780 celler gjort resistente over for 4-HPR som tidligere beskrevet [28]) celler blev opretholdt i RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt kalveserum suppleret med 5 uM 4-HPR. Den brysttumorcellelinje T47D (opnået fra Dr. R. Sutherland, Sydney, New South Wales, Australien) [31] blev opretholdt i RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt kalveserum og 0,25 U /ml insulin. Den cervikale carcinomcellelinie HeLa, indkøbt fra ATCC [31], blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Gibco BRL, Paisley, UK) suppleret med 10% føtalt kalveserum. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C under 5% CO2. 4-HPR, 4-MPR (begge venligst stillet til rådighed af Dr. J. Crowell, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA), RA (indkøbt fra Sigma, St. Louis, MO, USA), og 4-oxo-4- HPR (syntetiseret som tidligere beskrevet [29]) blev opløst ved 10 mM i DMSO, før fortynding i dyrkningsmedium og opbevaret ved -80 ° C i mørke. Vitamin C (Sigma) og JNK-inhibitor SP600125 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) blev tilsat til cellerne 60 minutter og 15 minutter før 4-HPR hhv. ER stress respons inhibitor salubrinal (Calbiochem) blev tilsat sammen med 4-HPR.

immunoblotanalyse

Proteiner blev ekstraheret ved at lysere celler i natriumdodecylsulfat (SDS) prøvepuffer (62,5 mM Tris- HCI [pH 6,8], 2% SDS) indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug /ml pepstatin, 12,5 ug /ml leupeptin, 2 ug /ml aprotinin, 1 mM natriumorthovanadat, og 1 mM natriummolybdat. Celleekstrakter blev forarbejdet til western immunoblotting som beskrevet tidligere [37]. Følgende antistoffer anvendes til immunoblotting blev købt fra de angivne leverandører: AF1q fra Abnova (Taipei City, Taiwan, # H00010962-M01); kløvede caspase-3 (Asp175) fra Cell Signaling Biotechnology (Beverly, MA, USA, # 9661); BAD fra Transduktion Laboratories (Lexington, KY, USA, # 610.391); PLAB fra R og actin fra Sigma (# A2066).

immunofluorescensanalyse

Celler, dyrket og transficeret på dækglas objektglas i 24 mm petriskåle, blev fikseret i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 10 minutter , vasket med PBS og derefter farvet med Hoechst 33342 (Sigma) 2 ug /ml i PBS i 2 minutter. Slides blev monteret med 0,1% (v /v) Mowiol (Calbiochem) og ses med en fluorescens mikroskop [billeder blev optaget med en Spot Insight digitalkamera (Delta Sistemi) udstyret med et system af billedanalyse (IAS 2000; Delta Sistemi)] . Apoptotiske celler blev identificeret ved analyse af nukleare morfologi. Grønne fluorescerende celler med kondenseret og fragmenterede kerner blev identificeret og scorede som apoptotiske celler (mindst 200 celler pr prøve).

Konstruktion af GFP-mærkede AF1q Expression Vector

AF1q blev forbigående udtrykt som en fusionsprotein med GFP fusioneret til dets C-terminal. AF1q kodende cDNA-området berøvet stopcodonet blev opnået ved polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation fra et plasmid indeholdende cDNA, der koder humant AF1q opnået fra Integrated Molecular Analyse af genomer og deres ekspression (IMAGE) Consortium (Livermore, CA, USA ) (cDNA klon IMAGE: 305.990). Vi anvendte forward oligonukleotidprimer 5′-ACTCGAGCCACCATGAGGGACCCTGTGAG-3 ‘[som indeholder et Xhol-restriktionssted og en Kozak-sekvens (CCACC)], og den reverse oligonukleotidprimer 5′-ATCCGGATCCAGCAAGTCCAGTTCG 3’ (der indeholder et BamHI-restriktionssite). Amplifikationsreaktionen blev initieret ved inkubering af prøven ved 94 ° C i 2 minutter efterfulgt af 15 cykler bestående af inkubation ved 94 ° C i 30 s, ved 45 ° C i 60 s og 68 ° C i 90 s og med 20