PLoS ONE: immunsuppressive Effekt af Cinnamaldehyd grund af hæmning af spredning og induktion af apoptose i immunceller: Konsekvenser i kræft

Abstrakt

Baggrund

Udover sine anti-inflammatoriske virkninger, er cinnamaldehyd blevet rapporteret at have anti-kræftfremkaldende aktivitet. Her undersøgte vi dens indvirkning på immunceller.

Metoder

Aktivering af nuklear faktor-KB ved cinnamaldehyd (0-10 pg /ml) alene eller i kombination med lipopolysaccharid blev vurderet i THP1XBlue menneske monocytisk cellelinje og i humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er). Proliferation og sekretion af cytokiner (IL10 og TNFa) blev bestemt i primære immunceller og de humane cellelinier (THP1, Jurkat E6-1 og Raji cellelinjer) stimuleret med cinnamaldehyd alene eller i forbindelse med lipopolysaccharid. Nitrogenoxid blev bestemt i mus RAW264.7-celler. Desuden blev forskellige behandlet PBMCer farvet for CD3, CD20 og AnnexinV.

Resultater

Lave koncentrationer (op til 1 pg /ml) af kanelaldehyd resulterede i en svag stigning i nuclar faktor-kB-aktivering , mens højere koncentrationer førte til en dosisafhængig reduktion af nuklear faktor-kB-aktivering (op til 50%) i lipopolysachharide-stimulerede THP1-celler og PBMC’er. Følgelig nitrogenoxid, interleukin 10 sekretion samt celleproliferation blev reduceret i lipopolysachharide-stimulerede RAW264.7-celler, PBMC’er og THP1, Raji og Jurkat-E6 immunceller i nærvær af kanelsyrealdehyd i en koncentrationsafhængig måde. Flowcytometrisk analyse af PBMC’er afslørede, at CD3 + var mere påvirket end CD20 + celler til apopotosis med cinnamaldehyd.

Konklusion

Vi tilskriver de anti-inflammatoriske egenskaber af kanelaldehyd til dens evne til at blokere nuklear faktor-KB aktivering i immunceller. Behandling med cinnamaldehyd førte til inhibering af cellelevedygtighed, proliferation og apoptose på en dosis-afhængig måde i primær og immortaliserede immunceller. På trods dens beskrevet kræfthæmmende ejendom, behandling med cinnamaldehyd hos cancerpatienter kunne blive kontraindiceret på grund af dets evne til at inhibere immun celleaktivering

Henvisning:. Roth-Walter F, Moskovskich A, Gomez-Casado C, Diaz-Perales A, Oida K, Singer, J., et al. (2014) immunsuppressive Effekt af Cinnamaldehyd grund af hæmning af spredning og induktion af apoptose i immunceller: Konsekvenser i Cancer. PLoS ONE 9 (10): e108402. doi: 10,1371 /journal.pone.0108402

Redaktør: Stephen J. Polyak, University of Washington, USA

Modtaget: Marts 21, 2014 Accepteret: August 28, 2014; Udgivet: 1 okt 2014

Copyright: © 2014 Roth-Walter et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er tilgængelige her for figur 1: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1159002, her for figur 2: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1162655 , her for figur 3: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1162660, og her, for figur 4:. https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1162666

Finansiering: undersøgelsen blev støttet af den østrigske Science Fund (FWF) tilskud P 23.398-B11, og give W1205-B09 til JS. CGC blev understøttet af en uddannelse bevilling fra den spanske regering (FPI-programmet, MICINN-MINECO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kanel er meget udbredt i industrien som et krydderi og aromastof, men det er også en vigtig forbindelse i traditionel urtemedicin. Den æteriske olie af kanel bark udgøres af 80% af cinnamaldehyd [1], og den vandige ekstrakt af kanel krydderi er blevet tilskrevet med antioxidant egenskaber [2], [3]. Cinnamaldehyd (CA) er en bioaktiv forbindelse, der er blevet identificeret til at have antibakteriel [4], [5], antiinflammatoriske [6], [7], hypoglykæmisk [8], anti-mutagene [9], [10 ] og anti-tumorigen aktivitet. Derudover blev det påvist at være anti-proliferative og pro-apoptotisk på forskellige cancercellelinier

in vitro

[11] – [15]. Den anti-kræftfremkaldende egenskab af CA opnås ved mitochondrial depolarisering [16] fører til forhøjede reaktive oxygenarter, aktivering af pro-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner, caspase-3 og mitogenaktiverede proteinkinaser [16], [17] samt inhibering af NF-KB og AP-1-aktivitet [15], [18].

forbindelser, der har både anti-cancer samt anti-inflammatoriske egenskaber som CA kan derfor tilvejebringe et attraktivt terapeutisk værktøj til cancerterapi. Det er velkendt, at kronisk inflammation er en udløser for kræft fremme. Men i en etableret tumor allerede findes, en immun-undertrykkende miljø og længere immun-suppression fører til tumorpromotion [19] – [23]. I denne henseende, død eller akkumulering af dysfunktionelle dendritiske celler [24], [25], nedregulering af HLA klasse I molekyler [26], [27] og et øget antal regulatoriske T-celler [28] inden tumorer har fået opmærksomhed. Immunsuppression i tumoren miljø fører til reduceret proliferation af perifere T-celler

in vitro

, som korrelerer med en mere negativ resultat i kræftpatienter [29]. Følgelig har vellykket stimulering af immunsystemet som følge af cancerterapi vist sig at reducere sygdomstilstande tilbagefald og forbedre overlevelse [30].

Derfor har forskellige strategier i cancerimmunterapi opstået i de senere år til bekæmpelse af immunosuppressiv faktorer og for at skabe en anti-tumor miljø. Tilgange i aktiv anti-cancer immunterapi omfatter en) indførelse af tumor-associerede antigener eller derivater deraf som vacciner i en immunogen sammenhæng at bryde tumor tolerance; [31] 2) isolering af immunceller fra kræftpatienter, efterfulgt af antigen pulserende og /eller stimulering

ex vivo

inden en ny infusion i patienten [32] samt 3) at blokere immunosuppressive molekyler som cytotoksiske T lymfocyt-associeret antigen 4 (CTLA4), og programmeret celledød protein 1 (PD1) med monoklonale antistoffer [33].

anti-tumorgene egenskaber, som hidtil er blevet tilskrevet kanelaldehyd, blev udledt fra modeller koncentrere sig om cancerceller. Men overvejer betydningen af ​​tumor-infiltrerende immunceller, vi sigter i denne undersøgelse til kritisk at vurdere dens virkninger på primær og udødeliggjort immunceller.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af institutionelle etiske komité af det medicinske universitet i Wien (EK-Nr. 949/2011) og informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle fag, før deres deltagelse i undersøgelsen. Raske frivillige uden rapporterede allergi over for kanel doneret 15 ml blod.

PBMC isolation og cellelinjer

Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) af 6 raske frivillige uden rapporterede allergi over for kanel blev isoleret fra fuldblod anvendelse af Ficoll-paque densitetsgradientcentrifugering som tidligere beskrevet [34], [35].

THP1-XBlue human monocytisk cellelinie, opnået fra InvivoGen (San Diego, CA, USA) samt THP1 , Jurkat E6-1, Raji (alle fra ATCC, Rockville, MD, USA) cellelinier og perifert blod humane mononukleære celler (PBMC’er) blev holdt i suspension i RPMI-1640 (Gibco Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) indeholdende varmeinaktiveret 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin /streptomycin og 1% L-glutamin. Ifølge producenten protokol, blev 200 pg /ml Zeocin tilføjes efter formering til THP1-XBlue celler. Murine RAW264.7 makrofager, indkøbt fra ATCC blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium. (DMEM; Gibco Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) suppleret med 10% FCS plus 1% penicillin /streptomycin

cellestimulering

Alle celler blev stimuleret med CA (SAFC kemikalier levering /Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) i et koncentrationsområde fra 0 op til 10 ug /ml med eller uden 5 pg /ml (15 000 EU /ml) af LPS fra

E. coli

055: B5 (Sigma, St. Louis, MO, USA)

udvinding Nuclear

PBMC’er (1 × 10

6 celler /brønd) blev podet i en. 48-brønds plade og stimuleret med CA (fra 0 til 10 ug /ml) alene eller i kombination med LPS (5 ug /ml, 15 000 EU) i 24 timer. Efterfølgende blev kerneekstrakter ved anvendelse af en kommerciel tilgængelig udvinding nukleare reagenser og i overensstemmelse med producentens protokol (Thermo Scientific, Pierce, Rockford, IL). Kort fortalt blev cellerne vasket i PBS og lyseret i cytoplasmatisk ekstraktion reagens I og II. Efter at have fjernet cytoplasmatisk fraktion, blev nukleare proteiner udvundet ved hjælp af nuklear ekstrakt reagens og opbevaret ved -80 ° C.

phospho-NFkB p65 assay

Phospho-NFkB p65 blev bestemt af nukleare fraktioner ved hjælp af en phospho -NFkB p65 ELISA (InstantOne ELISA, eBioscience, San Diego, CA) ifølge producentens protokol. Kort beskrevet til kerneekstrakter blev et antistof cocktail mix tilsat i en time før vask plade og tilsætning påvisningsreagens i 30 minutter, standsning af reaktionen og måling af optisk densitet ved 450 nm.

NF-KB-aktivering assay

NF-KB-aktivering assays blev udført under anvendelse af THP1-XBlue reporter celler, der stabilt udtrykker en NF-KB /AP-1-inducerbare secerneret alkalisk phosphatase reporter (SEAP), ifølge virksomhedens protokol. Kort fortalt, 1 x 10

5 celler /brønd blev podet i en 96-brønds plade og stimuleret med CA (fra 0 til 10 ug /ml) alene eller i kombination med LPS (5 ug /ml, 15 000 EU /ml ) i 24 timer. NF-KB-aktivitet blev bestemt tilsætning Quanti-Blå som substrat af udskilt alkalisk phosphatase i supernatanterne og yderligere inkubation i 8 timer ved 37 ° C og 5% CO

2. Efterfølgende blev optiske densitet (OD) målt ved 625 nm med et spektrofotometer Tecan InfiniteM200 PRO (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz).

Nitrogenoxid beslutsomhed

Nitrogenoxid (NO) koncentrationer af supernatanter blev bestemt ved anvendelse Griess-reagens (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA). RAW264.7-celler (1 x 10

6 celler /ml) blev inkuberet med CA (fra 0 til 10 ug /ml) i nærvær eller fravær af LPS (5 ug /ml) i 24 timer. Efterfølgende blev tilsvarende volumen Griess-reagens sat til supernatanter. Efter 10 minutters inkubation blev OD målt ved 550 nm. Nul til 100 uM af natriumnitrit (nano

2; Sigma) blev anvendt som standard til beregning af NO-niveauer Salg

Cytokine analyse

RAW264.7 celler og humane PBMC’er (1 ×. 10

6 og 2 × 10

5 celler /ml) blev inkuberet med CA (0-10 ug /ml) i fravær eller nærvær af LPS (5 ug /ml, 15 000 EU /ml) . Cellefrie supernatanter blev udvundet og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Koncentrationerne af IL10 og TNF-α i supernatanterne blev bestemt ved ELISA i overensstemmelse med producentens protokol (eBioscience, San Diego, CA).

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev bestemt med EZ4U ( Biomedica, Østrig) ifølge producentens protokol. To hundrede mikroliter af den cellesuspensioner (THP1, 1 × 10

4 celler /brønd, Raji, 2 × 10

4 celler /brønd, Jurkat E6-1, 3 × 10

4 celler /brønd; og humane PBMC’er, 1 x 10

5 celler /brønd) blev inkuberet i 96-brønds plader med CA (0-10 ug /ml) i fravær eller nærvær af LPS (5 ug /ml, 15 000 EU /ml ) i 24 timer. Kort beskrevet blev 20 pi substratopløsning tilsat til hver brønd og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C, 5% CO

2, før måle OD ved 465 nm med en referencebølgelængde på 620 nm.

flowcytometrisk analyse

Celler blev farvet for Annexin V som en markør for tidlig apoptose og analyseret ved FACS. Kort fortalt, frisk isolerede humane PBMC’er (2 × 10

5-celler) blev inkuberet med CA (0-10 ug /ml) i fravær eller nærvær af LPS (5 ug /ml, 15 000 EU /ml) i 24 timer før farvning med anti-CD3-APC (klon SK7) og anti-CD20-PE (klon 2H7) i 30 minutter ved 4 ° C (begge antistoffer var fra eBioscience og anvendt i en koncentration på 1 ul /50 pi farvning buffer). Efterfølgende AnnexinV-FITC (1 pl /prøve, eBioscience, San Diego, CA, USA) i bindingspuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaOH, 2,5 mM CaCI

2, pH 7,4) blev tilsat til cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur. Erhvervelse og yderligere analyse blev udført på FACSCantoII (BD Biosciences).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism version 6 softwarepakke. Værdier blev analyseret under anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Duncan test Multiple Range. P-værdier for 0,05 blev anset for signifikante. Alle resultater blev udtrykt som middelværdi ± SD.

Resultater

Effekten af ​​cinnamaldehyd på NF-KB /AP-1-aktivering er koncentrationsafhængig

Vi vurderede først bidraget af cinnamaldehyd på NF-KB-aktivering. CA er blevet rapporteret at dæmpe NF-KB-aktivering efter LPS-stimulering, dermed virkende antiinflammatorisk [36], [37]. Ligeledes vi også observeret inhibering af NF-KB /AP-1 op til 65% efter LPS-stimulering i THP1-XBlue reporter celler, når højere koncentrationer end 1 ug /ml blev anvendt. Men i modsætning til andre rapporter [36], [38] – [40], vi stimulerede celler også med lavere koncentrationer af kanelaldehyd og observeret en signifikant stigning (op til 40% ved anvendelse af 0,1 ug /ml CA) i NF-KB /AP-1-aktivering sammenlignet med LPS alene (fig. 1A). Derfor lave koncentrationer af CA yderligere aktiveret NF-KB /AP-1-vejen, mens højere koncentrationer hæmmede denne vej.

A. THP1-XBlue celler eller B. PBMC’er blev behandlet med forskellige koncentrationer af CA alene (hvide søjler) eller i kombination med LPS-stimulering (sorte søjler) i 24 timer. Søjler repræsenterer data fra A. tre uafhængige forsøg normaliseret til LPS alene gruppen og B. tre mennesker. Data præsenteret som gennemsnit ± SD, * p. 0,05

Vi også vurderet NF-KB-aktivering i humane immunceller under anvendelse mononukleære celler fra perifert blod (PBMC). Også her meget lav koncentration af CA resulterede i yderligere aktivering af NF-KB som målt ved påvisning af phospho-p65 i de nukleare fraktioner af LPS-stimulerede PBMC’er af rask donor og en stigning i CA-koncentration på over 1 pg /ml resulterede i hæmme NF-KB. Derfor Californien var i stand til at hæmme NF-KB-aktivering, når du bruger udødeliggjort samt primære immunceller af human oprindelse i koncentration over 1 mg /ml.

Cinnamaldehyd påvirker cytokin sekretion og nitrogenoxid i LPS-stimulerede immunceller

Næste analyserede vi aktivering af LPS-stimulerede immunceller ved CA. Når LPS-stimulerede PBMC’er blev inkuberet med CA til målinger cytokinfrigivelse koncentrationer på mere end 1 ug /ml inhiberede cytokinsekretion af immunosuppressive cytokiner som IL10 (Fig. 2A) samt af inflammatoriske cytokiner som TNF-α (Fig. 2B). Koncentrationer på under 1 ug /ml ændrede ikke IL10 niveauer i supernatanterne (data ikke vist). Desuden ingen cytokiner overhovedet blev påvist, når celler blev inkuberet med CA alene.

Humane PBMC’er blev inkuberet med stigende koncentration af CA i nærvær (sorte cirkler) eller fravær (åbne trekanter) af LPS i 24 timer og supernatanter blev analyseret for A. IL10 og B. TNF-a-niveauer. Data præsenteret som middelværdi ± SD fra PBMCer fra tre emner. C. Sekretion af nitrogenoxid blev bestemt i RAW264.7, stimuleret med stigende koncentration af CA i nærvær eller fravær af LPS efter 24 timer. Repræsentative data fra en af ​​tre uafhængige forsøg, udført i triplikater. Data præsenteret som middelværdi ± SD; * P 0,05, i forhold til at kontrollere prøver i hver gruppe

Et lignende mønster som for cytokin sekretion blev oberserved, når man analyserer INGEN udstrømningen i LPS-stimulerede murine makrofag-lignende celler (RAW264.. 7). Også her blev der ikke sekretion svækket (op til 35%), når cellerne blev inkuberet med højere koncentrationer af Ca ( 1 ug /ml). Men ingen yderligere stigning i NO-niveauer blev observeret ved hjælp af lavere koncentrationer. NO sekretion blev ikke påvist i celler uden LPS-stimulation (Fig. 2C).

Cinnamaldehyd negativt påvirker levedygtigheden og proliferation af immunceller

Dataene hidtil viste, at uanset cytokiner (pro -eller antiinflammatorisk, TNF-α eller IL10), af signalmolekyler (NO) samt veje (NF-KB /AP-1) undersøgte, et fald i aktivering og produktion blev observeret ved brug højere koncentration af CA end 1 ug /ml (= 8 uM). Derfor vi næste testet, om de observerede resultater, hvor på grund af reduceret levedygtighed i CA-behandlede immunceller.

Som afbildet i fig. 3, lav koncentration af CA ( 1 pg /ml) førte til en betydelig stigning i proliferation af primære humane PBMC’er, svarende til den koncentrationsafhængig NF-KB-profil CA (fig. 1). En tilsvarende tendens blev også observeret, når der anvendes udødeliggjorte celler ligesom de humane monocyt-lignende celler THP1, B-cellelinien Raji og T-cellelinie Jurkat E6-1, selv om dette ikke nåede statistisk signifikans. Imidlertid testede alle immunceller, (THP1, Raji B-celler, Jurkat E6-1 og humane PBMC’er) havde til fælles, at højere koncentration af CA ( 1 pg /ml) signifikant reduceret cellelevedygtighed og proliferation. Derfor vores data påpege, at immunundertrykkende kapacitet beskrevet af CA skyldes dets evne til at reducere viabiltiy af immunceller ved højere koncentrationer end 1 ug /ml.

A. Humane PBMC’er blev B. THP-1, C. Jurkat E6-1 og D. Raji celler inkuberet med stigende koncentration af CA i nærvær (sorte søjler) eller fravær (hvide søjler) af LPS. Levedygtige celler blev påvist under anvendelse af et tetrazolium-baseret assay. Søjler repræsenterer data fra en af ​​tre uafhængige forsøg udført in triplo. Data præsenteret som gennemsnit ± SD, * p. 0,05, i forhold til at kontrollere prøver

Cinnamaldehyd snarere påvirker T-celler end B-celler

I et næste skridt, vi undersøgte modtagelighed af B og T-celler i PBMC-præparater til CA via flowcytometri. PBMC’er blev farvet for CD3 (T celle receptor) som en markør for T-celler, CD20 (B lymfocyt antigen) som markør for B-celler og for tidlig apoptose markør Annexin V. Som afbildet i fig. 4, koncentration over 1 ug /ml CA førte til apoptose af begge T-celler (fig. 4A) og B-celler (fig. 4B) på en dosis-afhængig måde, hvorimod lastning med lavere koncentrationer kunne ikke ændre celletal. Behandling med høje koncentrationer af CA (5 og 10 ug /ml) øgede antallet af apoptotiske T-celler op til 8 gange henviser forøgelse af apoptotiske B celler var 3,5-fold sammenlignet med ubehandlede kontroller.

humane PBMC’er var inkuberet med CA og farvet for CD3, CD20 og AnnexinV og analyseret ved flowcytometri. Data for tre uafhængige forsøg er vist som middelværdi ± SD af AnnexinV positive A. CD3 + celler og B. CD20 + -celler.

Discussion

CA er blevet tilskrevet mange farmakologiske egenskaber, såsom at være anti-inflammatoriske, anti-ulcerogene, antipyretisk, antimikrobielle, antidiabetiske, men også at have antitumoraktivitet [39]. Vi har til formål at undersøge disse proklamerede uhyre gavnlige egenskaber nærmere, især med fokus på at forstå dens indvirkning på immunceller og dermed vurdere dens mulige indirekte bidrag til kræft progression. Kræft er defineret som den uregulerede vækst af maligne celler, som er forårsaget i 90-95% af miljøfaktorer såsom forurenende stoffer, kost, soleksponering, infektioner, fysisk inaktivitet og fedme, og kun i 5-10% kan linkes til genetisk defekter [41]. Sandsynligheden for at udvikle kræft stiger med alderen og er blevet forbundet med en nedsat immunosurveillance hos ældre [42]. Faktisk kræft mikromiljø er meget immunosuppressive og dermed reaktivering og modulering af immunsystemet er det primære mål for cancervacciner [43]. Immun-modulerende regimer tilbyde et attraktivt tilgang, da de ofte har færre bivirkninger end de eksisterende kemoterapeutiske lægemidler. I denne henseende blokering af den inhiberende CTLA4-antigenet på T-celler med anti-CTLA4 antistoffer fører til aktivering af T-celler [44], [45] og har vist sig at medføre betydelige overlevelse fordele i to randomiserede fase III-forsøg med patienter med fremskreden modermærkekræft, understreger betydningen af ​​immun aktivering i kræft [46], [47].

Derfor undersøgte vi immun-modulerende kapacitet CA på udødeliggjort og primære immunceller. I vores første fremgangsmåde, undersøgte vi dens indvirkning på NF-KB-aktivering, da NF-KB konstitutivt aktiveret i en række hæmatologiske og solide tumorer og er en af ​​de vigtigste transkriptionsfaktorer associeret med cancer progression [48], inhibering af apoptose, vævsinvasion og metastase [49]. Således er inhibering af NF-KB i maligne celler betragtes gavnlig. Vi var i stand til at reproducere data fra litteraturen, at NF-KB-aktivering af LPS-stimulerede immortaliserede monocytter inhiberes ved tilsætning af CA i koncentrationer over 8 uM [36] – [40], men interessant vi observeret en signifikant stigning i NF- KB-aktivering når lavere koncentrationer af CA blev brugt. Vi dermed hypotese, at en immunosuppressiv tumor mikro-miljøet kunne formes, når CA kunne anvendes i høje nok koncentrationer. På den anden side lave koncentration af CA, hvilket opnås ved moderat forbrug af kanel, aktiverer yderligere immunsystemet, men ikke tilstrækkelig til at bekæmpe hurtigt voksende tumorer. Derfor moderat forbrug af CA-holdige fødevarer synes snarere at være en profylaktisk, snarere end et terapeutisk middel. Vigtigere, indikerer vore data, at høje doser selv kan være kontraindikeret.

angår dets biotilgængelighed cinnamaldehyd og dets alkohol samt syre derivat absorberes hurtigt fra tarmen, metaboliseres og udskilles primært i urinen, som synes at være uafhængig af dosis (op til 250 mg /kg), arter og køn. Blod koncentrationer af cinnamaldehyd efter intravenøs administration af 5,15, eller 25 mg /kg i mandlige og kvindelige F344 rotter faldt bifasisk [50], [51]. Den indledende fase korrelerer med den hurtige forekomst af kanelsyre i blod, ved hvilken anslået 37-60% af kanelaldehyd oxideres til kanelsyre inden for 30 min. Den anden fase med en halveringstid på 1,7 h antages som en frigivelse af cinnamaldehyd fra protein addukter dannet under den indledende fase [52]. I en nylig undersøgelse oral administration af CA resulterede i en biotilgængelighed på 20% [53]. Endvidere i en lignende rapport efter oral indgivelse blev CA koncentration i blodet fundet at være 1 ug /ml [52] og op til 10 ug /ml for kanelsyre [54] og opretholdt i 24 timer på trods af sin forholdsvis korte biologiske halveringstid 1,7 t.

Derfor høj lokal koncentration af cinnamaldehyd og dets derivater er opnåelige

in vivo

ved indtagelse og kunne udøve en vedvarende immun-undertrykkende effekt.

i vores næste tilgang, vi yderligere fokus på immun-undertrykkende kvaliteter cinnamaldehyd ved at undersøge dens indvirkning på cytokin sekretion i primære PBMC’er aktiveret med LPS. I overensstemmelse med undertrykkelse af NF-KB-vejen, observerede vi en koncentrationsafhængig nedregulering af inflammatoriske og lovgivningsmæssige mediatorer TNF-α, idet IL10 og NO impliceret i udviklingen og progressionen af ​​forskellige kræftformer [55], [56]. den fremtrædende fald i mediator sekretion af primære immunceller ved inkubering med CA foreslås imidlertid, at dette kan være på grund af ændringer i stofskiftet. Faktisk vores data viser tydeligt, at CA fører til en udtalt reduktion i cellelevedygtighed udødeliggjort samt primære immunceller. Yderligere analyse af immunsystemet cellepopulation hos mennesker viste, at især T-celler var mere fremtrædende modtagelige for CA-induceret apoptose end B-celler. De opnåede resultater er yderst relevant, da cytotoksiske T-lymfocytter forbliver potente mediatorer for anti-tumor immunitet og tumorinfiltration af T-celler har vist sig at være en god prognostisk faktor i æggestokkene, colon, bryst, nyre-, prostata- og livmoderhalskræft [43] . Desuden er der to

in vivo

undersøgelser, der anvender kanel ekstrakt som en cancer terapeutisk middel. De rapporterer reduceret tumorvækst i mus melanom, når fodring kanel ekstrakt i store doser (400 mg /g kropsvægt) i løbet af 20 til 30 dage [37], [57] til mus. Men de viste også en alvorlig reduktion af sekundære immune organer som milt og lymfeknuder [28]. I disse undersøgelser anvendes meget høje doser af CA, i betragtning af at CA er kendt for at have en lav toksicitet med en dødelig dosis lav (LDlow) ved parental anvendelse af 200 ug /g legemsvægt [58]. Den observerede reduktion af hurtigt voksende celler som immun- og kræftceller kan dermed være den generelle karakteristik af den beskrevne lave toksicitet af CA.

I modsætning hertil blev der kræftfremkaldende bekymringer steget med Mereto et al [59], der foreslog cinnamaldehyd som en svag promotor af liver carcinogenese grund af dens potentiale til at være clastogent og dets evne til at inducere mikrokerner i rottelever

in vivo

. Der findes også en menneskelig tilfælde rapport, der er forbundet oral carcinoma dannelse efter indtagelse af op til fem pakker med kanel tyggegummi en dag i en 24-årig ikke-ryger [60].

Still, i en 2-årig NTP studie med mus og rotter, hvor op til 200 mg /kg legemsvægt af CA, blev fodret, og som svarer til den maksimale koncentration af ikke-observerede negative effekt-niveau, NOAEL for lang langsigtede effekter, sås ingen tegn på neoplasi [61]. Undersøgelsen fremhæver,, at forbruget af CA ikke kan være kræftfremkaldende, når mængden indtages er moderat.

På et molekylært niveau CA som et aldehyd besidder α, p-umættede olefiniske substituenter er kendt for at danne addukter med cellulære thiol-grupper især med proteinsk sulfhydryler såsom cystein og glutathion via nukleofil addition til β-carbon [62]. Således ved at fratage celler af antioxidanten glutathion cellerne begrænsede i deres evne til at neutralisere frie radikaler og reaktive oxygenforbindelser. Endnu vigtigere er, nedbryder celler glutathion-niveauer har også en alvorlig indvirkning på deres jern-metabolisme, som i sidste ende resultere i cellernes død [63]. Desuden er det kendt at handle på plasmamembranproteiner som forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilien Et medlem 1 (TRPA1) [64], en sensor til miljømæssige irritanter, koldt og strække og på TLR4 ved at hindre deres TLR4 oligomerisering ved LPS-stimulering , men ikke ved at målrette nedstrøms signaleringsmolekyler [40]. Konsekvenserne af at hæmme TLR4-oligomerisering dermed er nedskrivning af NF-KB-aktivering og efterfølgende sekretion af cytokiner. I overensstemmelse med vore data, viser vi her, at ikke kun kræftceller, men i specifikke immunceller er meget modtagelige for CA fører til inhibering af NF-KB ved at stabilisere cellemembranen og forhindre TLR4 oligomerisering samt inhibering yderligere aktivering af immunsystemet celler og frigivelse af cytokiner. Desuden CA induceret apoptotosis i lymfocytter, sandsynligvis ved at fratage celler af glutathion.

Da målet af cancer immunterapi er ikke at undertrykke immunsystemet, men at genaktivere hvilende celler ved modulation, som i øjeblikket held anvendes ved anvendelse af anti-CTLA4 antistoffer, en mere differentieret tilgang til anvendelse af CA skal fortaler for anti-cancer behandling, især da den har en udtalt immun undertrykkende virkning på T-celler, herunder effektor T-celle population.

Vores data indikerer, at moderat indtagelse af CA er gavnligt for immunsystemet i raske organismer, men at CA-behandling i høje doser kan være kun til gavn ved behandlingen af ​​cancer fra hæmatopoietiske celler såsom lymfom og leukæmi, hvor immun- systemet er allerede undertrykt, og som tegner sig for de mest almindelige barndom kræftformer. Imidlertid behandling af andre celletyper med CA, hvortil fornyet aktivering af immunsystemet er stærkt ønsket, fx carcinomer, sarkomer eller kimcelletumorer (æggestokkene og testikelkræft), kan modsige sin ansøgning.

Tak

Vi vil gerne takke Ms Anna Willensdorfer for fremragende teknisk bistand.