PLoS ONE: Kræft Testikel Antigen Vaccination giver langsigtet beskyttelse i en murin model af æggestokkene Cancer

Abstrakt

Sperm protein (SP17) er et attraktivt mål for kræft i æggestokkene (OC) vacciner på grund af sin over- udtryk i primære såvel som i metastatiske læsioner, på alle stadier af sygdommen. Vores undersøgelser tyder på, at en SP17-baseret vaccine kan fremkalde en varig forsvar mod OC udvikling i C57BL /6 mus med ID8 celler, efter profylaktiske og terapeutiske behandlinger. Det er første gang, at en mus modstykke til en cancer testis antigen (SP17) blev vist at blive udtrykt i en OC musemodel, og at vaccination mod dette antigen kontrolleret tumorvækst. Vores undersøgelse viser, at CpG-adjuvans-SP17-vaccine overvinder problemet med immunologisk tolerance, den største hindring for udviklingen af ​​en effektiv immunterapi til OC. Desuden er denne undersøgelse giver en bedre forståelse af OC biologi ved at vise, at aktivering Th-17 celler og moderne immunosuppressiv T-reg celler hæmning er nødvendig for vaccinens effekt. Tilsammen indikerer disse resultater, at profylaktiske og terapeutiske vaccinationer kan fremkalde mangeårige beskyttelse mod OC og forsinkelse tumorvækst, hvilket tyder på, at denne strategi kan give yderligere behandlinger af menneskelig OC og forebyggelse af sygdomme debut hos kvinder med en familie historie af OC.

Henvisning: Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. (2010) Cancer Testikel Antigen Vaccination Giver langsigtet beskyttelse i en murin model af kræft i æggestokkene. PLoS ONE 5 (5): e10471. doi: 10,1371 /journal.pone.0010471

Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children Research Foundation, USA

Modtaget: Februar 21, 2010; Accepteret: April 12, 2010; Udgivet: 12. maj 2010

Copyright: © 2010 Chiriva-Internati et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af Billy og Ruby Power Endowment for Cancer Research og Laura W. Bush institut for kvinders sundhed og center for kvinders sundhed og kønsbaseret Medicine. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene (OC) er den sjette mest almindelige kræftform og den syvende hyppigste årsag til kræft død hos kvinder [1], [2]. Blandt OC, er 90% af tilfældene er repræsenteret ved epitelial ovariecancer (EOC), som følge af epitel foring, æggestokkene overflade eller fra inklusion cyster [3], [4]. Den dødelighed af OC stammer fra den manglende evne til at opdage sygdommen på et tidligt orgel-begrænset scenen og fra manglen på effektive behandlinger for fremskreden-stadie sygdom [4]. Den sene diagnose og den høje resistens mod kemoterapi begrænse de behandlingsmuligheder til rådighed. OC patienter med en familie historie af OC udgør 10% af alle tilfælde [5]. Kliniske muligheder for disse patienter er kirurgisk indgreb, der fører til infertilitet, eller chemoprevention med orale præventionsmidler, ofte forbundet med alvorlige bivirkninger [6], [7]. Immunterapi strategier, herunder cancervacciner betragtes som mindre giftige og mere specifik end de nuværende behandlinger [8], og derfor holde potentiale til at give fordele for OC patienter med tydelig sygdom og for OC højrisikopatienter. På grund af deres specificitet handling, potent og varige virkninger og anvendelighed til stort set alle typer af tumor, er anti-cancer-vacciner kørsel interesse kliniske onkologer. Et vigtigt skridt i udviklingen af ​​basale cancervacciner er gennemførelsen af ​​vaccinationsprogrammer strategier giver mulighed for konsekvent induktion af immunrespons på tumorantigener. I denne henseende er valget af passende antigener, baseret på både hyppigheden og specificiteten af ​​deres ekspression i cancervæv, er af afgørende betydning. Kræft /testis-antigener (CTA) [9], [10], [11], [12], som omfatter SP17 antigenet [9], [13], [14], [15], [16], er ved at opstå som lovende kandidater til specifikke immunterapeutiske mål. CTA repræsenterer en underklasse af tumor-associerede antigener (TAA), som er ikke-muterede selv-antigener udtrykt eller over-udtrykkes i tumorer, og anerkendt af CD8 T-celler [12], [14], [17], [18], [19], [20]. Det immunogene SP17 protein er blevet grundigt karakteriseret [10], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Human SP17 er stærkt bevaret, idet 70% homologi med kanin og mus, og 97% homologi med bavian [25]. SP17 har en molekylvægt på 17,4 kDa, kodes af et gen lokaliseret på kromosom 11, og udtrykkes afvigende i cancere i ubeslægtet histologisk oprindelse [25], herunder myelomatose (MM) og OC [21], [22]. SP17-specifik CTL, der genereres fra normale donorer, MM og OC patienter, har vist sig at dræbe HLA-matchede tumorcellelinier og friske tumorceller frembyder SP17 epitoper bundet til HLA klasse I molekyler [13], [14], [21] . Disse observationer understøtter nyere undersøgelser tyder på, at SP17 kan være en egnet antigen til immunterapi i OC [13], [25]. Rekombinante proteiner er almindeligt anvendt i udviklingen af ​​antivirale vacciner og kan udgøre attraktiv kandidat antitumor-vacciner [11], [26], [27], [28], [29]. Professionelle antigenpræsenterende celler (APC’er) detektere patogener gennem en række receptorer, såsom de Toll-lignende receptorer (TLR), som genkender patogen-associeret molekylære mønstre, herunder CpG-oligodeoxynukleotider (CpG ODN) i definerede flankerende sekvenser [27], [ ,,,0],29], [30], [31]. CpG-motiver, som udtrykkes ofte i bakteriens genom men genomisk undertrykt hos hvirveldyr, anses fremmed af immunsystemet og som følge heraf, stimulere værtens forsvarsmekanismer [11], [27], [29], [32], [33], [34]. CpG-ODN udviser stort potentiale i den terapeutiske behandling af kræft på grund af deres evne til at aktivere medfødte og adaptive immunitet [15], [26], [27], [28]. Den TLR9-bindende CpG inducerer sekretion af Th1 cytokiner, herunder IFN-γ og TNFa, og produktion af antigenspecifikt IgG2a af B-celler [11], [12], [32], [33], [34]. I denne undersøgelse vurderede vi den profylaktiske og terapeutiske immunresponset fremkaldt af gentagen vaccination med SP17 rekombinant protein administreres med CpG. Vi anvendte det murine ID8 OC cellelinie, afledt af en spontan

in vitro

malign transformation af C57BL /6 mus æggestokkene overflade epitelceller at inducere tumorvækst i mus [34]. Vores resultater viser for første gang, at priming med SP17 protein og CpG er en effektiv strategi til at fremkalde varigt OC terapi.

Resultater Karakterisering af SP17 og MHC-I-ekspression i ID8 celler

SP17 mRNA (figur 1a) og SP17-proteinet (figur 1b) blev påvist i ID8 cellelinie. Yderligere karakterisering af immuncytokemi (ICC) og immunofluorescens (IF) afslørede cytoplasmatisk og overflade farvning af disse celler (fig 1c). Den cytospin af ID8 permeabiliserede (P) celler udviser en positiv cytoplasmatisk farvning for SP17, hvilket blev bekræftet ved IF. Derudover de ikke permeabiliserede (NP) celler viser også klart udtryk gennem IF (figur 1c, lavere kvadranter), selv om mindre ved ICC (figur 1c, øvre kvadranter). Vi yderligere analyseret SP17 overflade udtryk gennem flow-cytometrisk analyse, der viste høj frekvens af SP17 positive celler (figur 1d). Tilsvarende viste flowcytometri analyse, at 60% af ID8 celler farvet positive for MHC-I under basale dyrkningsbetingelser, mens tilsætning af 100 IE /ml IFN-γ i 72 timer resulterede i 98% MHC-I-positive celler.

SP17 mRNA i de murine ID8 tumorceller og i muse testis (positiv kontrol). MRNA-niveauerne blev analyseret ved RT-PCR for SP17-ekspression. En cellulær housekeeping-gen, B-actin, blev inkluderet som en kontrol. Et PCR-only kontrol (ingen RT trin) ikke at generere et produkt, hvilket indikerer, at der ikke var nogen DNA-kontaminering i prøverne. Ud over den RT-PCR (se figur 1 a), blev Western blot udført og figur 1b viser ekspressionen af ​​SP17 på proteinniveauet. Den ID8 cellelinjen blev yderligere karakteriseret ved en immuncytokemi (ICC) og immunofluorescens (IF). Denne figur viser en cytospin af ID8 celler permeabiliseret (P) og en positiv farvning for SP17 på cytoplasmaet niveau. Desuden blev SP17 bekræftet af IF i cytoplasmaet. Derudover er der i figur 1c, non permeabiliserede (NP) -celler viser klart udtryk via IF og derunder ICC. Panel D viser ID8 karakterisering for overfladeekspression af SP17 og MHC-I; Isot. ctrl, isotypekontrol antistof; procentdel indikerer positive-farvning af celler. MHC-I-ekspression blev vurderet med eller uden IFN-g stimulation.

In vivo

vækst ID8 celler efter intraperitoneal injektion

Fire forskellige doser af ID8 celler (10

5, 5 × 10

5, 10

6 og 2 × 10

6) injiceret i fire grupper af mus (fem pr gruppe) at bestemme den optimale dosis til induktion af tumor /ascites formation. Hvert sæt af eksperimentelle podninger med forskellige doser af ID8 celler blev udført mindst tre gange. Dyr fra hver tumor titrering gruppe blev aflivet på forskellige tidspunkter, ved hvilken en obduktion blev udført på hele dyr og dissekerede organer (ikke vist). Optimal tumorvækst (baseret på tid og dimension) blev observeret med 1 af de 4 betingelser (2 × 10

6 ID8 celler) testet. Figur 2a viser, at en i.p. injektion af 10

5 ID8 celler genereret en tumorvækst efter 120 dage, mens 5 × 10

5 ID8 celler genereret en tumormasse /ascites i 90 dage (figur 2b). En dosis på 106 celler viste en signifikant tumormasse /ascites vækst ved ca. 60 dage (figur 2c), og når 2 × 106 ID8 celler blev injiceret, blev de optimale tumormasse /ascites opnået i 40 til 45 dage (figur 2d), og de fleste dødsfald mellem 50-65 dage, enten på grund af tumor masse eller offer at undgå overdreven ubehag for musene. Figur 3a afbilder en mus injiceret med den optimale dosis (2 x 10

6) af ID8 celler til at generere tumormasse /ascites (44 mm i bredden) i mindre end 45 dage, og en kontrol mus (20 mm i bredden) som ikke blev injiceret med ID8 celler. Figur 3b viser frembringelsen af ​​ascites fra en ip injektion af 2 × 10

6 ID8 celler i mindre end 40 dage, og viser også et detaljeret billede af bughulen på en mus efter opsugning 22 ml af ascites, afslører flere metastatisk knudepunkter og tumormasser. Endvidere figur 3 bekræfter, at cellerne i bughinden af ​​mus injiceret med ID8 celler udtrykker SP17 ved immunhistokemi (IHC), mens celler fra en mus uden tumor injektion var negative for SP17 (tallene 3e, f og g). Disse resultater viser, at SP17 udtrykkes i ID8 cellelinje,

in vivo

. For at bekræfte tumormassen /ascites stammede fra ID8 celler blev enheder af peritoneal, tumormasse /knudepunkter, lunge, lever, ascites, milt og æggestokke undersøgt ved RT-PCR. Resultaterne vises i figur 3d, (repræsentativt billede af 5 mus pr eksperiment, gentaget tre gange) for ID8-injicerede mus (figur 3d-1) og kontrolmus (figur 3d-2). Endvidere blev en fluorescens-baseret lokalisering assay udført for at afsløre GFP-positive ID8 celler

in vivo

, og bekræftede peritoneal lokalisering af ID8 celler (figur 3h).

Viser den gradvise dannelse af ascites /tumorer, når ip injiceret med ID8 celler. ID8 injicerede mus er vist som m1-m5. Kontrolmus blev injiceret med PBS alene. 1a viser mus injiceret med 10

5 ID8 celler. Tumorerne nåede ikke en væsentlig størrelse, indtil efter 150 dage. 2b viser den gradvise dannelse af ascites /tumorer, når de i.p. injiceret med 5 × 10

5 ID8 celler. Tumorerne nåede ikke en væsentlig størrelse, indtil efter 120 dage. 2c viser den gradvise dannelse af ascites /tumorer når i.p. injiceret med 10

6 ID8 celler. De tumorer nået en betydelig størrelse i 90-120 dage. 2d viser den gradvise dannelse af ascites /tumorer når i.p. injiceret med 2 × 10

6 ID8 celler. De tumorer nået en betydelig størrelse i 35-60 dage (p 0,0001); en synlig udvidelse af musene blev bemærket på 30 dage.

en viser på venstre side en kontrol mus (bredde mus 20 mm) ikke injiceret med ID8 celler og på højre side en mus injiceret med 2 x 106 ID8 celler efter 40 dage (bredde mus 44 mm). Disse mus repræsenterer eksperimenter med lignende resultater. b viser den fulde bughulen af ​​ascites induceret fra en ip injektion af 2 × 106 ID8 i 40 dage (til venstre) og en åben udsigt over hulrummet med flere metastatiske noder og tumorer (midten og til højre, efter opsugning 22 ml af ascites) . c viser en bughinden negativ for SP17 fra en kontrol mus ikke injiceret med ID8 celler. f viser et positivt udtryk for SP17 på peritoneum af en mus injiceret med 2 x 106 ID8 cellen efter 40 dage. Testis er den positive kontrol for SP17 af ICH (g). Figur d viser PCR for SP17-DNA (og B-actin kontrol): et væv panel afledt af (1) organer under et 2 × 106 ID8 injiceret mus var positiv for SP17 og et panel af væv hidrørende fra organer fra en sund mus afslørede ingen ekspression af SP17. Positive kontroller (ID8 og testis) til SP17 er også vist. Panel h viser in vivo fluorescens billeder af en kontrol (til venstre) og ID8-injicerede (til højre) musen til lokalisering af GFP-positive ID8 celler.

Vaccination regimer og måling af tumorvækst

musene blev vaccineret med forskellige formuleringer: SP17 kun; CpG kun; og SP17 + CpG, co-administreret. I alt 22 mus blev immuniseret med hver vaccine formulering. Musene blev immuniseret (i.m.) intramuskulært med 50 ug SP17 protein og 20 ug CpG på forskellige tidspunkter, som beskrevet ovenfor. Evaluering af tumorvækst og /eller ascites blev overvåget hver tredje uge ved hjælp ingeniør calipre. Overlevelse blev fulgt indtil tumorer nåede indhold på mere end 1000 mm

3, i overensstemmelse med vores retningslinjer for Institutional Animal Care og Brug Udvalg.

Evaluering af overlevelsesrater efter profylaktiske og terapeutiske SP17 /CPG vaccinationer

Tumorceller blev injiceret 30 dage efter 3

rd vaccination af den profylaktiske regimen, eller 21 dage før den første terapeutisk vaccination. Alle SP17 + CpG vaccinerede mus (100%) var tumor-fri 91 dage efter tumor injektion med ID8 celler (2 x 10

6), hvorimod ingen af ​​de ikke-vaccinerede dyr (ID8 kun) var i live. Figur 4a viser overlevelsesrater af mus, der fik profylaktiske vaccinationer: 12,5% af SP17 + CpG vaccinerede mus udviklede små tumor masser og ascites efter 91 dage og døde 180 dage efter med heavy-load tumorer. Desuden 8% af de vaccinerede mus udviklede tumorer og ascites, og døde efter 200 dage. Men de tumorer var signifikant mindre end de ovarietumorer af kontrolmusene, der blev vaccineret med PBS alene. Den samlede overlevelse SP17 + CpG vaccineret mus var 79% i over 300 dage. Analyse udført af en Log-rank (Mantel-Cox) Test viste, at de overordnede overlevelseskurver var statistisk signifikante (p 0,0001) for gruppen vaccineret med SP17 + CpG sammenlignet med de andre vaccine titreringer. Figur 4b viser overlevelsesrater af mus, som modtog terapeutiske vaccinationer. Mindre end 11% af SP17 + CpG vaccinerede mus udviklede små tumor masser og ascites efter 150 dage og døde efter 210 dage heavy-load tumorer. Desuden mindre end 10% af de vaccinerede mus udviklede tumorer og ascites, og døde efter 280 dage. Den samlede overlevelse SP17 + CpG vaccineret mus var 80% i over 300 dage. Analyse blev udført af en Log-rank (Mantel-Cox) Test og viste, at de overordnede overlevelseskurver var statistisk signifikante (p 0,0001) for gruppen vaccineret med SP17 + CpG sammenlignet med de andre vaccine titreringer. Endelig kontrolgrupper vaccineret med SP17 alene og alene CpG viste nogle til ingen beskyttelse, der var ikke statistisk signifikant (figur 4a og 4b).

Samlet overlevelse af mus fra de fire profylakse (a) eller terapeutisk (B ) grupper, som er beskrevet i teksten (tumor gratis, SP17 + CpG vaccineret, uvaccinerede, SP17 eller CpG vaccineret). Tumorbærende mus var i.p. injiceret med 10

6 ID8 celler til både profylaktiske og terapeutiske regimer. Tumorceller blev injiceret 30 dage efter 3

rd vaccination af den profylaktiske regimen, eller 21 dage før den første terapeutisk vaccination. I den terapeutiske gruppe, den gennemsnitlige forskel i vægt mellem tumor-udfordret og tumor-fri dyr var 10 gram i begyndelsen af ​​vaccination regime. Vandret akse viser tid udtrykt som dage fra behandlingens start. Log-rank test angivet statistisk signifikant forskel mellem uvaccinerede og SP17 + CpG vaccineret versus uvaccinerede eller CpG behandlede gruppe (p 0,0001). For begge regimer

Måling af SP17-specifikt antistofrespons og cytokin udtryk ved ELISA-assay

Analyse af SP17-specifik antistofrespons genereret i det vaccinerede mus er vist i figur 5. repræsentanten ELISA-assay blev udført for at analysere immunresponset fra 3 forskellige vaccineformuleringer: SP17 + CpG; CpG kun; og kun SP17. Efterfølgende vaccinationer øget specifikke anti-SP17 antistof respons sammenlignet med den første vaccination. I figur 5b viste vi en høj mængde specifikke anti-SP17-antistoffer fra begge SP17 formuleringer ved 3

rd vaccination. Vi udforsket den gentagne vaccinationsprogram, for i et klinisk miljø, patienter, der er i remission ofte fortsat skal vaccineres, så der ikke er nogen tilbagevenden af ​​tumoren. Men der var et lille fald i mængden af ​​immunrespons sammenlignet med 3

rd vaccination analyser i alle tre formuleringer på 9

th vaccination (figur 5c), men anti-SP17 IgG niveauer i SP17 + CpG vaccineret gruppe var stadig statistisk højere sammenlignet med de andre vaccineformuleringer (p 0,001). I det terapeutiske regimen gruppen, SP17 + CpG vaccinerede mus udviste en signifikant højere (p 0,01) produktion af IgG-anti-SP17 efter 270 dage, sammenlignet med mus behandlet med de andre formuleringer (figur 5D). I figur 6 viste vi ekspressionen af ​​cytokiner på dag 270 (ved 9

th vaccination) i både profylaktisk (6a) og terapeutiske (6b) regimer. Serum blev opsamlet og analyseret ved ELISA-assay (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF) fra mus vaccineret med SP17 + CpG og sammenlignet med serum fra mus vaccineret med SP17 alene, CpG alene eller PBS alene. Interessant IFN-γ fra SP17 + CpG vaccinerede mus var forøget med næsten to folder i forhold til de SP17 vaccinerede dyr eller omkring tre folder sammenlignet med CpG vaccinerede dyr (figur 6a og b). I profylaktisk vaccinerede mus blev TNF-α fra SP17 + CpG formulering steget mere end tre folder, sammenlignet med CpG vaccinerede mus og kun to folder i forhold til SP17 vaccinerede mus (figur 6a). intervaller GM-CSF var tre folder højere end i CpG vaccinerede mus og mindre end to folder højere versus SP17 vaccinerede mus (figur 6a). I terapeutisk vaccinerede dyr, TNF-a fra SP17 + CpG formulering blev forøget to folder i forhold til CPG og med SP17 alene formuleringer (figur 6b). GM-CSF vist to gange og mere end én gange forøgelse i forhold til CPG og SP17 formuleringer alene, (figur 6b). Hvad angår de andre cytokiner, der var ingen signifikant ekspression af IL-2, IL-4, IL-5 eller IL-10 (figur 6a og b).

Serum fra mus gennemgået forskellige behandlinger blev opsamlet og analyseret ved ELISA for niveauerne af cirkulerende anti-SP17 IgG. X-aksen viser serielle fortyndinger af serum. a, b og c viser resultater opnået i de profylaktiske ordninger vaccination, mens d viser svaret fra mus fra det terapeutiske regime. På dag 7 (a) immunresponset var lav for SP17. På dag 97 (b), immunresponset var højere end på dag 7. På dag 270 (c), svaret for SP17 var lidt mindre end på dag 97.

På dag 300, serum blev opsamlet og analyseret ved ELISA til måling af de anførte cytokinniveauer i profylaktisk (a) eller terapeutisk (b) vaccinerede mus. For begge regimer, IFN-gamma, TNF-alfa og GM-CSF statistisk blev påvist signifikante stigninger kun i SP17 + CpG vaccinerede mus sammenlignet med kontroller (PBS). Ingen signifikante forskelle blev påvist for IL-2, IL-4, IL-5 eller IL-10 niveauer.

Evaluering af CTL antitumor-responser Salg

I figur 7a, ELISPOT IFN -γ assay blev udført på dag 270 (9

th vaccination) under anvendelse miltceller fra SP17 + CpG profylaktisk immuniserede mus. Strategien med gentagne vaccinationer i denne dyremodel er at afspejle de aktuelle humane kliniske forsøg. Disse resultater antyder, at hyppigheden af ​​SP17-specifik CTL steg i den optimale gruppe (SP17 + CpG vaccinerede mus) og viste 220 ± 30 positive pletter i miltcellerne versus SP17 vaccineret (184 ± 18) og versus CpG-vaccinerede mus der var så lav som 9 ± 2. I figur 7b, blev ELISPOT TNF-α-assay udført på dag 270 (9

th vaccination af profylaktisk skema) under anvendelse miltceller fra SP17 + CpG-immuniserede mus (der var den bedste formulering til et stærkt immunrespons). Disse resultater antyder, at hyppigheden af ​​SP17-specifik CTL steg i den optimale gruppe (SP17 + CpG vaccinerede mus), der viser 240 ± 35 positive pletter i miltcellerne versus SP17 kun vaccineret (200 ± 31) og versus CpG vaccinerede mus der var så lav som 12 ± 2. Analogt, i terapeutisk vaccination regimen, hyppigheden af ​​SP17-specifik CTL forøget i SP17 + CpG gruppe med 259 ± 20 IFN-γ og 159 ± 30 TNF-a-positive pletter, versus 100 ± 20 IFN-γ og 70 ± 10 TNF-a positive pletter i SP17 og CpG kun formuleringer, henholdsvis (figur 6c og d). Disse resultater generelt foreslå en høj og specifik immunreaktion fremkaldt af SP17, når det gives samtidig med CpG, uanset den vedtagne vaccinationsprogram Til cytotoksicitetsassayet af

måling 51Cr-release, splenocytter blev indsamlet på tidspunktet for den 1

st, 3

rd og 9

th vaccinationer fra SP17 vaccinerede mus, CpG vaccinerede mus, og SP17 + CpG vaccinerede mus. CTL assay viste stærkere CTL-responser i SP17 + CpG vaccinerede mus sammenlignet med mus immuniseret med SP17 eller CpG kun, både ved profylaktisk (figur 8) og terapeutisk (figur 9) regimer. Fordi der i normale ID8 dyrkningsbetingelser

in vitro

, der er en lav ekspression af MHC klasse I-molekyler ID8 celler blev behandlet

in vitro

med IFNy (100 IU /ml i 72 timer) for at inducere højere ekspressionsniveauer, som tidligere rapporteret (figur 1d, nedre panel). ID8 celler aktiveret med IFN-γ blev brugt som bedre mål for cytotoksicitet analysen.

På dag 270 (9

th vaccine) splenocytter fra forskellige formuleringer af vaccinerede mus og kontroller blev indsamlet og analyseret af ELISPOT assay. a, b) hyppigheden af ​​IFN-gamma og TNF-alfa-positive celler i profylaktiske vaccinationer; c, d) hyppigheden af ​​IFN-gamma og TNF-alfa-positive celler i terapeutiske vaccinationer. Disse resultater er præsenteret som pletdannende celler pr 10

6 splenocytter. Pletnumrene repræsenterer middelværdien af ​​ti mus i hver vaccinerede gruppe; barer, SE.

Splenocytter fra de tre forskellige formuleringer af profylaktisk vaccinerede mus og kontroller blev indsamlet og analyseret af

51Chromium-release assay på dag 7 (første vaccine), 97 (tredje vaccine) og 270 (niende vaccine) ved anvendelse splenocytter som effektorceller og ID8 som målceller. Disse resultater blev opnået fra tre uafhængige forsøg. X-aksen angiver effektor: mål-forhold

Splenocytter fra de tre forskellige formuleringer af terapeutisk vaccinerede mus og kontroller blev indsamlet og analyseret af

51Chromium-release assay.. Disse resultater viser tre uafhængige forsøg efter tredje vaccine (dag 97) og niende vaccine (dag 270), under anvendelse af splenocytter som effektorceller og ID8 som målceller. X-akse indikerer effektor:. Mål-forhold

Evaluering af Th-17 og T-reg cellefrekvens

Figur 10 viser frekvensen af ​​Th-17 eller T-reg-celler i SP17 + CpG vaccineret eller styre mus splenocytter, indsamlet på forskellige tidspunkter (ingen tumor: dag 0; ID8 kun: dage 45; profylaktisk og terapeutisk dag 270).

splenocytter fra mus, som fik profylaktiske eller terapeutiske vaccinationer eller kontroller (mus uden tumor eller tumor-bærende mus uden vaccinationer) blev opsamlet på forskellige tidspunkter (ingen tumor: dag 0, ID8 kun: dage 45; profylaktiske og terapeutiske vacciner: dag 270) analyseret ved flow-cytometri til måling af en ) Th-17 populationen (CD4 /IL-17-dobbelt positiv) eller b) T-reg befolkning (CD4 /Foxp3-double positive) frekvens.

Både profylaktiske og terapeutiske vaccinationer fremkaldte en betydelig stigning i Th-17 og et fald i T-reg-celle gennemsnitlige frekvenser (3-og 1,5-folds henholdsvis fig. 10) sammenlignet med tumor-udfordrede vaccinerede dyr (uparret t-test p 0.001, for vaccinerede versus kontrol ubehandlede mus) . Terapeutiske og profylaktiske vacciner består i SP17 eller CpG alene også inducerede en stigning i Th17 frekvenser; imidlertid sådan virkning var ikke signifikant (uparret t-test p 0,05, for SP17- eller CPG kun vaccineret versus kontrol ubehandlede mus). SP17 eller CpG administreret alene reducerede T-reg population frekvenser ved en højere grad i forhold til kombinerede SP17 + CpG formuleringer i både terapeutiske og profylaktiske regimer; denne reduktion var signifikant sammenlignet med tumor udfordrede uvaccinerede mus (uparret t-test p 0,01), men ikke sammenlignet med SP17 + CpG vaccinationer (uparret t-test p 0,05).

Diskussion

den dødelighed af ovariecancer stammer primært fra den manglende evne af læger til at opdage sygdommen på den tidlige orgel-begrænset og normalt asymptomatisk fase, kombineret med manglen på effektive terapier for fremskreden fase sygdom [14], [33], [35], [36]. Den sene diagnose og den høje kemo-modstand af denne form for kræft viser behov for nye terapeutiske mål og en bedre forståelse af de involverede i spredningen af ​​OC mekanismer.

I den foreliggende undersøgelse, vi vurderede effekten af ​​SP17 rekombinant protein samt CpG i profylaktiske og terapeutiske indstillinger i murine ID8 model. SP17 er blevet vist her for at blive udtrykt kraftigt i cytoplasmaet og overfladeteknologier membraner af ID8 celler (ved ICC, IF og flowcytometri). Vi var i stand til at følge tumorvækst under anvendelse SP17 som biomarkør (figur 1 og 3). Denne musemodel genererer ascites som vist i figur 3a og 3b, og så det synes at afspejle patologi de mest aggressive og hyppige form for human ovariesygdom ved trin III og IV. Frembringelsen af ​​tumor knudepunkter og fusion af peritoneum også ligne den humane proces (se figur 3b), samt den typiske peritoneal lokalisering dokumenteret

in vivo

ved fluorescens billeddannelse (fig 3h). Brugen af ​​denne dyremodel er blevet rapporteret for forskellige undersøgelser i forbindelse med tumortargeting og vaskulær vækstfaktor [23], [37], men det er første gang, at en mus modstykke til et humant tumorassocieret antigen, SP17, er blevet vist at blive udtrykt i en OC musemodel.

en af ​​de store kriterier at afgøre, hvilken kandidat selv-antigen til at målrette til forebyggelse eller terapeutiske strategier skaber et immunrespons på en sikker måde, og bevis her tyder på, at SP17 kan være sådan en kandidat. Vi har tidligere vist, at adoptivt overførte SP17-specifikke T-celler har anti-tumor aktivitet [13], [14], [21], [22], men SP17-målrettet terapeutisk eller profylaktisk vaccination er ikke testet i en tumormodel. Disse resultater viser tydeligt, at co-administration af SP17 + CpG i.m. injiceret hver 30. dag i i alt ti vaccinationer forhindrede dannelsen af ​​tumorer op til 300 dage, med en overlevelsesrate på 77% til den profylaktiske gruppe og 80% for den terapeutiske gruppe vaccination. Især virkningerne af vaccination i de profylaktiske og terapeutiske regimener var ens. Begge regimer inducerede en stærk immunitet, som forhindrede tumorvækst i-udfordrede mus. De mus, der i sidste ende bukket under for sygdommen viste forsinket udvikling af tumorvækst sammenlignet med de ikke-vaccinerede mus. Vi hypotesen, at vores terapeutiske regime vil være effektiv i at afvise anderledes iscenesat OC, da vores terapeutiske vaccinationer ikke starte, før de ID8 tumorer viste en betydelig vækst, med funktioner, der normalt observeres i human fase III-IV OC, herunder kræft spredt sig ud bækkenet, til foring af maven eller til lymfeknuderne (www.ovariancancer.org) [38]. Tumor-injicerede, uvaccinerede dyr viste tumorspredning til peritoneum, lymfeknuderne, lunger, lever og milt. Faktisk var den gennemsnitlige forskel i vægt mellem tumor-udfordrede og tumor-fri grupper var 10 gram, hvilket svarer til ca. 50% betyder animalsk vægt før tumor injektioner (20 gram).

Aktiveringen af ​​en stærk immunreaktion mod SP17 blev påvist ved ELISA og ELISPOT-analyser, der viser en stigning i anti-SP17-antistoffer i mus serum, ekspression af Th1-associerede cytokiner og tumorspecifikke cytotoksiske responser. Det er bemærkelsesværdigt, at ingen signifikant serologisk reaktivitet til SP17 kunne påvises før vaccination, der angiver vaccinens evne til prime specifikke naive B-celler. Sammenligne resultaterne af Sp-17 specifikke antistoftitre opnået med forskellige terapeutiske vaccine formuleringer, fandt vi kun en lille, men tydelig stigning af anti-SP17 antistof produktion i CpG + SP17 vaccinerede dyr sammenlignet med de andre grupper, især efter 9

th vaccination. Derfor kan vi ikke bedømme, om tumor afstødning efter CpG + SP17 vaccinationer kan tilskrives humorale respons. kun givet, at forskellene i antistoftitre mellem grupper er små, ville vi konkludere, at de tumor antigen-specifikke cellulære immunreaktioner vi detekteret sandsynligvis gøre et større bidrag til tumor afvisning i CpG + SP17-vaccinerede dyr. Interessant, co-administration af SP17 + CpG var bedre end SP17 alene eller CpG alene som en adjuvans. Det er blevet veldokumenteret, at i.m. injektioner af proteiner generelt ikke fremkalde signifikante immunreaktioner, medmindre de er blandet med hjælpestoffer [30], [32], [39]. Effektiv adjuvanser display mindst 2 virkningsmekanismer: en depotvirkning, der fører til langvarig antigeneksponering i værten, og en evne til at udløse det medfødte immunsystem gennem aktivering af dendritiske celler (DC) via toll-lignende receptorer (TLRs) [35 ]. Efter korrekt antigen præsentation, aktiveret DC spiller en central rolle i induktionen af ​​T-celle responser [29], [34], [40], [41], [42].