PLoS ONE: tumorsuppressorfunktion af SEMA3B Gene i Human Lung og Nyrer Kræft

Abstrakt

SEMA3B

gen er placeret i 3p21.3 LUCA region, som ofte påvirkes i forskellige typer af kræft. Formålet med vores undersøgelse var at udvide vores viden om

SEMA3B

gen som en tumor suppressor og mekanismerne i dens inaktivering. I denne undersøgelse blev adskillige eksperimentelle fremgangsmåder anvendt: tumorvækst analyser og apoptoseassays

in vitro

i SCID-mus, udtryk og methylering assays og andre. Med brugen af ​​småcellet lungecancer-cellelinie U2020 bekræftede vi funktionen af ​​

SEMA3B

som en tumorsuppressor, og viste, at suppression kan realiseres gennem induktion af apoptose og eventuelt forbundet med inhiberingen af angiogenese. Hertil kommer, for første gang, høje methylering frekvenser er blevet observeret i både intron (32-39%) og promotor (44-52%) CpG-øer i 38 ikke-småcellet karcinom, herunder 16 planocellulært karcinom (SCC ) og 22 adenocarcinomer (ADC), og i 83 clear cell nyrecellecancere (ccRCC). Korrelationer mellem methylering frekvenser af promotoren og intron CpG-øer

SEMA3B

med tumor scenen og kvalitet er blevet åbenbaret for SCC, ADC og ccRCC. Sammenhængen mellem faldet i

SEMA3B

mRNA-niveau og hypermethylering af promotoren og intron-CpG-øer er blevet anslået i nyre primære tumorer (

P

0,01). Ved hjælp af qPCR, vi observerede i gennemsnit 10- og 14-fold fald i

SEMA3B

mRNA niveau i SCC og ADC henholdsvis og en 4-fold fald i ccRCC. Hyppigheden af ​​denne effekt var høj i både lunge (92-95%) og nyre (84%) tumor prøver. Desuden viste vi en klar forskel (

P

0,05) i

SEMA3B

relative mRNA-niveauer i ADC med og uden lymfeknudemetastaser. Vi konkluderer, at afvigende udtryk og methylering af

SEMA3B

kunne blive foreslået som markører for lunge- og nyrekræft progression

Henvisning:. Loginov VI, Dmitriev AA, Senchenko VN, Pronina IV, Khodyrev DS, Kudryavtseva AV, et al. (2015) tumorsuppressorfunktion af

SEMA3B

Gene i Human Lung og Nyrer Kræft. PLoS ONE 10 (5): e0123369. doi: 10,1371 /journal.pone.0123369

Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: 16. juli 2014 Accepteret: 5 februar 2015; Udgivet: Maj 11, 2015

Copyright: © 2015 Loginov et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud 13-04-00828a, 13-04-02072a, og 14-04-32084 mol_a fra den russiske Foundation for Basic Research ; give 28.12.07-6888 fra Istituto Toscano Tumori; en bevilling fra CNR-RAS fælles projekter 2008-2010; tilskuddet fra RAS præsidium Program “Molecular and Cellular Biology”; kontrakter 14.604.21.0117 (projektets entydigt id RFMEFI60414X0117) og 14.621.21.0001 (projektets entydigt id RFMEFI62114X0001) fra Ministeriet for Undervisning og Videnskab i Den Russiske Føderation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne bekræfte fravær af konkurrerende interesser, men erklære tilhørsforhold med Affina Biotechnologies. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Semaphorins er negative mediatorer af axonal vejledning i centralnervesystemet [1]. Semaphorins omfatter en stor familie af glycoproteiner (8 klasser, herunder 5 hvirveldyr klasser, af mere end 30 medlemmer), men kun klasse 3 (SEMA3) repræsenterer udskilles opløselige molekyler. Medlemmer af SEMA familien udtrykkes forskelligt i cancer og enten fremme eller undertrykke celleproliferation, migration og angiogenese, og fremkaldelse af lægemiddelresistens. Således kan roller separate medlemmer af semaphorin familie være helt anderledes [2-9].

Klasse 3 semaphorins (SEMA3s, også kendt som collapsins) omfatter en af ​​fem hvirveldyr familier af semaphorins og spiller en vigtig rolle i tumor biologi, herunder regulering cellulære processer, såsom endotelcelleproliferation, apoptose, migration og angiogenese [10]. For nylig, inddragelse af dette protein klasse i carcinogenese er blevet intensivt undersøgt. SEMA3s udskilles af celler af multiple afstamninger, herunder epitelceller, neuroner, og specifikke tumorceller [10]. Neuropilins (NRP) repræsenterer de primære receptorer SEMA3s. Bindingen af ​​SEMA3s til NRP1 /2 initierer deres nedstrøms signalering men forhindrer interaktionen mellem NRP1 /2 og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og den efterfølgende induktion af et pro-angiogen transkriptionel program. Imidlertid er det ikke klart, om SEMA3s inhibere tumorvækst ved at konkurrere med VEGF for neuropilins ligandbindende sites, ved at virke uafhængigt af VEGF, eller ved en kombination af disse virkninger [10-13].

Tidligere undersøgelser, herunder vores, af den menneskelige kromosom 3 i nyre-, lunge-, bryst- og livmoderhalskræft karcinomer afslørede hyppige allele tab (op til 40%) i LUCA-regionen (3p21.3), der huser to semaphorins-SEMA3B og SEMA3F. Denne region (hg38 /CHR3: 50.0-50.5Mb) består af 445 Kb indeholder omkring 20 tumorsuppressorer (GTS) og TSG-kandidater:

RASSF1

,

NPRL2

,

TUSC2

,

CACNA2D2

og andre. Overraskende er disse gener spiller roller i cellulære processer og udøver tumor undertrykkelse af flere forskellige måder (cellecyklus blok, hæmning af angiogenese, induktion af apoptose etc.) ligger i den kompakte region [14-18].

vigtig dokumentation for tumor suppressor aktivitet omfatter identifikation af celle regulatoriske veje og andre mekanismer, der er berørt af SEMA3B. Brug af MDA-MB435 (brystcarcinoma) og A549 (lungeadenocarcinom) celler blev tidligere vist, at SEMA3B undertrykte tumorvækst men udløste en pro-metastatisk program ved at frigive interleukin 8 [19, 20]. Endvidere blev det konstateret, at induktionen af ​​apoptose ved SEMA3B i tumorceller var medieret ved inaktivering af Akt signalvejen [21]. Derfor var det vigtigt at yderligere at belyse særlige aspekter af SEMA3B tumor undertrykkelse.

Methylering er en vigtig mekanisme af

SEMA3B

gen inaktivering [17, 22]. Men de fleste af tidligere forskning fokuseret på methylering studier af introniske CpG-ø, der fejlagtigt blev anset som ligger i promotor-regionen.

Formålet med vores undersøgelse var at belyse forskellige roller SEMA3B i tumor suppression, især i apoptose og angiogenese. Derudover sigter vi til at vurdere frekvenser af promotor (hg38 /CHR3: 50,267,308-50,267,797) og intron (hg38 /CHR3: 50,268,972-50,269,271) CpG-ø hypermethyleringsassocierede korrelationer med

SEMA3B

udtryk, og tumor progression i lunge og nyre kræftformer

Materialer og metoder

cellelinjer

Genomisk DNA blev isoleret fra 14 cancer cellelinjer:. 3 skællede celle lungekræft (SCLC: ACC-LC5, NCI-N417 , U2020), 2 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC: NCI-H157, NCI-H647) og 9 renale celle kræft (RCC: A498, ACHN, Caki-1, Caki-2, HN-51, KH-39, KRC /Y, TK-10, TK-164). Cellelinien U2020 blev beskrevet tidligere [23]. ACC-LC5 cellelinie, der bærer en deletion i 3p21.3 [24] blev venligt stillet til rådighed af Dr. Yusuke Nakamura (University of Tokyo, Tokyo, Japan). A498 blev Caki1, og Caki2 og lunge NCI-N417, NCI-H157, og NCI-H647-cellelinjer indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellelinier KRC /Y, ACHN, TK-164, HN-51, TK-10, og KH-39 blev opnået fra Karolinska Institute (Stockholm, Sverige) cellelinie samling [25]. Alle humane cellelinier blev dyrket som monolagskulturer i IMDM /RPMI eller DMEM (med 4,5 g /l glucose) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS).

Vævsprøver

I alt , 70 parrede tumorvæv /normalt prøver af NSCLC (29 ADC og 41 SCC) og 133 clear cell RCC (ccRCC) blev opnået fra NN Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences (Moskva, Rusland). Sættet af 38 NSCLC (16 ADC og 22 SCC) og 83 ccRCC blev anvendt i methylering undersøgelser og udtrykket eller kopi nummer studier ved semikvantitativ RT-PCR. Den ekstra sæt af 32 NSCLC (13 ADC og 19 SCC) og 50 ccRCC blev brugt til validering af qPCR udtryk undersøgelser. Prøven oplysninger fremgår af tabel 1 og S1 tabel. Prøverne blev indsamlet i overensstemmelse med de retningslinjer, der er udstedt af den etiske komité i N.N. Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences (Moskva, Rusland). Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke (kan rekvireres). Den etiske komité for N.N. Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, godkendt specifikt denne undersøgelse. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Tumorvæv og parret morfologisk normale væv opnåedes fra patienter efter kirurgisk resektion inden stråling eller kemoterapi og blev opbevaret i flydende nitrogen. Diagnosen blev bekræftet ved histopatologi, og kun prøver med 70-80% eller flere tumorceller blev anvendt i undersøgelsen. “Normal” kontroller blev opnået ved mindst 2 cm fra tumoren og blev bekræftet histologisk som normale epitelceller. Tumor-prøver blev karakteriseret ved den internationale system for klassificering af tumorer, baseret på tumor-node-metastaser (TNM) og iscenesættelse klassificering af Union for International Cancer Control (UICC, udgave 2002) [26] og World Health Organization (WHO ) kriterier klassificering [27, 28]. Blodprøver fra 15 raske donorer blev også anvendt i undersøgelsen.

SCID-mus

Tolv SCID-mus blev anvendt i eksperimenterne. Musene blev opnået ud fra Scanbur (Sollentuna, Sverige). Animal eutanasi blev udført ved CO

2-kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NRC 2011), den europæiske konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål, Europarådet (ETS 123 ), og retningslinjerne i det nordlige Stockholm Etisk udvalg for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Forsøgene med SCID-mus blev godkendt af North Stockholm Etisk Udvalg.

Transfektion og udvælgelse af stabilt transfekterede

SEMA3B

-U2020 celle kloner

cDNA koder for

SEMA3B

genet blev klonet ind i en episomal tetracyclin-reguleret vektor, Pete. Det resulterende plasmid blev sekventeret. At opnå stabile cellekloner der udtrykker

SEMA3B

, U2020-celler (SCLC) blev transficeret med tom Pete eller PETE /

SEMA3B

plasmid-DNA (0,5 mg DNA pr brønd) i plader med 12 brønde under anvendelse af Lipofectamine og Plus Reagens (Invitrogen, CA, USA) ifølge producentens protokol. Transient transficeret pete /

SEMA3B

-U2020 og Pete-U2020-celler blev dyrket i 2-3 uger i IMDM-medium indeholdende Bsd (5 ug /ml) for at vælge stabile kloner. Udtrykket af

SEMA3B

blev reguleret af doxycyclin.

Colony dannelse assay

forbigående transficerede U2020 celler (med Pete og PETE /

SEMA3B

) blev frataget 24-48 timer efter transfektion og udpladet på 100 mm

2 celle dyrkningsskåle ved en densitet på 500-1000 celler per plade. Efter selektion med Bsd (5 ug /ml), blev Giemsa-farvede kolonier fotograferet og talt under anvendelse Mængde One-software (version 4.4.0, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Cell levedygtighed blev estimeret ved FACS-analyse med propidiumiodid (PI-FACS), i overensstemmelse med producentens retningslinjer (FACSCalibur, BD Bioscience).

tumorvækst i SCID-mus

tumorigenicitet af PETE /

SEMA3B

transficerede U2020 og tomme PETE-transfekterede U2020 celler (kontrol) blev vurderet ved subkutan injektion cellerne i 6-8 uger gamle SCID-mus som beskrevet tidligere [29]. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering ved 800 rpm i 2 min og resuspenderet i serumfrit IMDM-medium i en koncentration på 2-3 x 10

6 celler pr 100 pi injektion. Cellerne blev indlejret i en Matrigel matrix (BD Biosciences, Erembodegem, Belgien) ifølge fabrikantens protokol. Musene blev observeret for tumordannelse to gange om ugen og tumorstørrelsen blev målt ved anvendelse skydelære. Derefter brugte vi den multi-gen inaktivering test (MGIT) i tre gener (

ZMYND10 /BLU

,

TUSC2 /FUS1

SEMA3B

) i SCID-mus. MGIT er baseret på overvågning af tumor suppressor kandidat-gen-inaktivering i celler og tumorer. Det blev opnået i overensstemmelse med en publiceret fremgangsmåde [29, 30]. Kort fortalt blev U2020 celler transficeret enten med PETE /

SEMA3B

, Pete /

ZMYND10

, Pete /

TUSC2

eller tomme PETE plasmider. Blandinger af cellekloner blev injiceret subkutant i SCID-mus. Efterfølgende hvis der dannes en tumor, udtryk for

SEMA3B

,

ZMYND10

og

TUSC2

evalueres. Den knock-down af generne tyder deres betydning for tumor undertrykkelse.

immunhistokemisk analyse af SCLC tumorcellelinie U2020 og tumor angiogenese i SCID-mus

Plasmidet pete /

SEMA3B

blev indført i SCLC cellelinie U2020, som konstitutivt producerede en tetracyclintransaktivatoren (tTA) [29]. Den resulterende sub-linje blev inokuleret subkutant i SCID-mus. Musene fik drikkevand med doxycyclin (+ dox, gen er OFF) eller uden (-dox, gen er ON). Musene blev aflivet efter 1 måned. De tumorer eller steder af celle injektioner blev udskåret og indlejret med paraffin. Sektionerne blev 5 um i tykkelse. Paraffin blev opløst i xylen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og vævssnittene blev behandlet sekventielt med 99, 95, 75 og 30% ethanol. Epitoper blev udvundet ved opvarmning i en mikrobølgeovn i 5 minutter i citratpuffer. Anti-CD31 muse-antistof, sammen med kanin-anti-muse FITC-konjugeret sekundært antistof (Dako, Karlstrup, Danmark), blev anvendt til at farve mikrokar. TUNEL-assayet (in situ Celledød Detection Kit, Boehringer Mannheim, Tyskland) til påvisning af apoptose blev udført ifølge producentens protokol.

DNA og total RNA-isolering, revers transkription-PCR

Nitrogen-frosne væv blev afbrudt under anvendelse af et Mikro-Dismembrator (Sartorius, Tyskland). DNA fra humane væv og cellekulturer blev isoleret ved phenolekstraktion henhold til standard protokoller. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy mini kit som anbefalet af Qiagen (Holland). Oprenset RNA blev kvantificeret ved anvendelse NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies Inc., DE, USA). RNA kvalitet blev vurderet ved anvendelse 28S og 18S rRNA-båndene efter elektroforese i en 1% denaturerende agarosegel og analyseret ved anvendelse af en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, USA). Den manglende DNA-kontaminering blev kontrolleret ved semi-kvantitativ PCR med primere til den vigtigste histokompatibilitetskompleks I genet (

MHCI

, konstrueret ved hjælp Vector NTI, se S2 tabel). Alle RNA-prøver blev behandlet med RNase-fri DNase I (Fermentas, Litauen). RNA-prøver indeholdende mere end 0,1% DNA blev kasseret. CDNA’et blev syntetiseret ud fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af M-MuLV revers transkriptase og vilkårlige hexamerer, ifølge standarden fabrikantens protokol (Fermentas, Litauen).

bisulfit sekventering af promotoren CpG-ø

SEMA3B

gen

bisulfit DNA omdannelse blev udført som beskrevet i [31, 32] med anvendelse af 1-2 ug DNA (lunge og renal cellelinjer og tumorvæv /normalt væv). Det modificerede DNA blev oprenset under anvendelse af en JETquick PCR Purification Spin Kit (Genomed, Sverige). Modificeret DNA blev holdt ved -20 ° C og anvendt som template for PCR med de designede primere (anført i S2 tabel), hvis produkt blev sekventeret. Amplifikation af

SEMA3B

promoter CpG-ø-fragmentet blev udført i en reaktionsblanding 50 pi indeholdende PCR-puffer (67 mM Tris-HCI pH 8,8, 16,6 mM ammoniumsulfat, 0,01% Tween 20); 2,0 mM MgCl

2; 0,25 mM af hver dNTP; 25 pM af hver primer; 1 enhed Hot Start Taq-DNA-polymerase (SibEnzyme, Rusland); og 5-20 ng af modificeret DNA i en DNA Engine Dyad Cycler (Bio-Rad, USA) under anvendelse af følgende program: 95 ° C, 5 min; 35 cykler ved 95 ° C, 15 s; 62 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s og 72 ° C, 7 min. Det PCR amplificerede produkt blev oprenset under anvendelse af 1,5% agarosegelelektroforese og JETquick Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Sverige). Til sekventering, blev 5-10 ng af det oprensede DNA-fragment og 25 pM af én af primerne anvendes. Sekventering blev udført under anvendelse af en automatisk sekventering maskine (Beckman-Coulter).

Methylering specifik PCR (MSP)

bisulfit-behandlet DNA, opløst i dobbeltdestilleret vand, blev også anvendt som en skabelon for MFP. PCR-betingelserne og primere til den methylerede og ikke-methylerede allel af intron [17] og promotoren (designet af DNASTAR Lasergene 2000-programmet) CpG-øer er givet i S2 tabel. I tilfælde af promotoren CpG-ø blev 6 CpG-dinukleotider analyseres (2 ved den fremadrettede primer og 4 ved omvendt), og i tilfælde af den introniske-3 (1 ved den fremadrettede primer og 2 ved omvendt). PCR blev udført på en DNA Engine Dyad Cycler forstærker (Bio-Rad, USA) under anvendelse af følgende program: 95 ° C, 5 min; 35 cykler ved 95 ° C, 10 s; T

ann (se S2 tabel), 20 s; 72 ° C, 30 s og 72 ° C, 3 min. Fraværet af PCR-produkt på uomdannet DNA blev kontrolleret for hvert par af primere. DNA fra den humane fibroblastcellelinie L-68 fungerede som et ikke-methyleret allel kontrol; L-68 SSSI DNA fra L-68 fibroblaster behandlet med SSSI methyltransferase (SibEnzyme, Rusland) fungerede som en positiv kontrol for 100% methylering.

Semi-kvantitativ RT-PCR

For at styre revers transkription, primere til udskrift af beta2-mikroglobulin (

B2M

) genet blev anvendt [33]. Semikvantitative RT-PCR blev udført med lige mængder af cDNA under anvendelse af primere og betingelser i S2 tabel. Multiplex PCR med primere til

SEMA3B

[17] og

B2M

gener blev udført under betingelser, der er optimeret til

SEMA3B

primere, og koncentrationen af ​​

B2M

primere var 1,5 gange lavere. Produkterne fra RT-PCR blev adskilt på 2% agarosegeler, og bandet mønster blev analyseret under anvendelse GelImager software (DNA Technology, Rusland). En semi-kvantitativ kopiantal assay for markører af LUCA region blev anvendt som beskrevet andetsteds [14].

qPCR

Kvantitativ PCR blev udført med primerne og TaqMan prober anført i S2 bord med en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Hver reaktion blev gentaget tre gange. Nukleotidsekvenserne af amplikonerne blev verificeret ved sekventering i en 3730 DNA Analyzer automatisk sekventeringsapparat (Applied Biosystems, CA, USA). QPCR data blev analyseret ved hjælp af henvisningen gener

GAPDH

,

GUSB

og

RPN1

[34] og den relative kvantificering eller ΔΔCt-metoden som beskrevet tidligere [35]. Mindst 2 gange ændringer mRNA niveau blev anset som signifikant på grund af mRNA-niveau variabilitet af reference- gener.

Statistisk analyse

-parametrisk Wilcoxon test blev brugt til at sammenligne mRNA-ekspression forskelle i målet og referencepunkter gener i ccRCC og NSCLC prøver. Kruskal-Wallis og Mann-Whitney rank-sum test, Fishers eksakte test og χ

2 kriterier blev anvendt til analyse af mRNA niveau og methylering status ændringer i ccRCC og NSCLC grupper med forskellige patologiske og histologiske karakteristika. T-test blev anvendt til at sammenligne de opnåede data for grupper af replikater. P-værdier ≤ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Spearman rang korrelationskoefficient (

r

s

) blev anvendt til at afsløre sammenhænge.

Resultater

In vitro

vækst undertrykkelse af SCLC celler U2020 af

SEMA3B

småcellet carcinom cellelinje U2020 blev transficeret med PETE

/SEMA3B

eller PETE som kontrol. De transficerede celler blev dyrket i 15 dage. Vækstraten for U2020 celler, der udtrykker

SEMA3B

var lavere end kontrolgruppen (

P

0,01 siden den dag fem, se figur 1A). Den kolonidannelse assay viste, at antallet af kolonier af U2020-celler indeholdende Pete /

SEMA3B

var lavere efter fornyet ekspression af doxycyclin undertrykt

SEMA3B

gen i sammenligning med kontrolcellerne (890 ± 60 vs 190 ± 40,

P

0,01, figur 1B). Baseret på PI-FACS-analyse, den overflod af apoptotiske og nekrotiske celler, der udtrykker

SEMA3B

(uden doxycyclin) var signifikant forøget i sammenligning med

SEMA3B

-off celler (med doxycyclin): fra (7 ± 2) × 10

2 til (49 ± 5) × 10

2

P

0,01, se fig 1C. Tilsammen tyder disse data, at

SEMA3B

er hæmmer af væksten humane SCLC celler via induktion af apoptose

in vitro

A-Væksten i U2020 celler.: stiplet linje med firkanter-U7111 klon med PETE /

SEMA3B

, optrukken linje med cirkler-U2020 celler med PETE (kontrol); B-kolonidannelse assay; C-PI-FACS-analyse af celler med og uden udtryk for

SEMA3B

. Middelværdier ± standardafvigelser for 4 replikater er repræsenteret i hvert enkelt tilfælde.

Multi-gen inaktivering test i SCID-mus

Vi har tidligere rapporteret, at GIT teknik gør det muligt for en effektiv og kontrolleret induktion af forskellige gener i celler [29, 30]. For MGIT eksperimentet, brugte vi den SCLC cellelinje U2020 for den betingede udtryk for tre TSG-kandidater placeret i 3p21.3:

ZMYND10

(

BLU

),

TUSC2

(

FUS1

) og

SEMA3B

. Blandinger af cellekloner bærer forskellige gener blev inokuleret subkutant i seks uger gamle SCID-mus under anvendelse af en Matrigel (basalmembranmatrix) implantationsteknik i fravær af doxycyclin (generne var ON).

Et PCR-baseret sammenligning af SCID mus tumorer og primære celle kloner viste utvetydigt, at

SEMA3B

blev selektivt bankede ned i alle tre tumorer dyrket

in vivo

(se prøver 8-10 i figur 2), mens udtryk for

ZMYND10

og

TUSC2

gener ændrede ikke under disse betingelser. Disse to gener sandsynligvis ikke modvirke tumorvækst af U2020 celler i SCID-mus (vi forlader dette spørgsmål åbent, fordi søgningen efter mutation gennem tilbageholdte gener ikke var medtaget i MGIT). Disse data antyder, at SEMA3B er en vækstinhibitor af humane SCLC-celler

in vivo

.

elektroferogram af multiplex-PCR fra plasmider, kloner og SCID-mus tumorer af tre gener. M-markør, 1-PCR fra plasmid pete /

SEMA3B

, 2-PCR fra plasmid pete /

TUSC2

, 3-PCR fra plasmid pete /

ZMYND10

, 4 -PCR fra U7111 /

SEMA3B

celle-klon 1, 5-PCR fra U7111 /

TUSC2

celle-klon 3, 6-PCR fra U7111 /

ZMYND10

celle-klon 4, 7-blandede celle kloner, 8-PCR fra tumor 1, 9-PCR fra tumor 2, 10-PCR fra tumor 3, 11-negative kontrol.

Effekt af

SEMA3B

transgener på tumorvækst i SCID-mus og angiogenese

U2020 delaktionslinje med betingede

SEMA3B

udtryk under doxycyclin kontrol blev podet i SCID-mus subkutant. Fire mus fik doxycyclin i drikkevand (+ DOX-mus, kontrol) og fem blev ikke administreret doxycyclin (-dox mus). Starten af ​​solide tumorer aktivt udtrykker

SEMA3B

blev ikke observeret i 4 ud af 5 tilfælde (Fig 3, rød linje). I den femte-dox muse aktiv tumorvækst (figur 3, gul linje) begyndte en uge senere sammenlignet med kontrollen (figur 3, blå linie), til trods for tilstedeværelsen af ​​

SEMA3B

i konstruktionen. Imidlertid blev ekspressionen af ​​

SEMA3B

gen ikke påvist i denne tumor ifølge den Northern blot-analyse (data ikke vist), hvilket antyder tab af

SEMA3B

i disse celler. De tumorer (observeret i

SEMA3B

-OFF mus) havde områder med aktiv celleproliferation, i modsætning til vævene taget fra steder af celle injektioner (i

SEMA3B

-ON mus), hvor rigelige fiberholdige og dårligt differentierede cellulære stroma og nekrotiske områder blev observeret. Disse data viser muligheden for

SEMA3B

tumorsuppressionsaktivitet i SCID-mus

Væksten i U2020-celler (U7111 klon) i SCID-mus:. Blå linie-U2020 celler uden

SEMA3B

udtryk (+ doxycyclin, 4 mus), rød og gul line-U2020 celler med

SEMA3B

udtryk (- doxycyclin, 4 mus og en mus henholdsvis). * -no Ekspression af

SEMA3B

gen ifølge Northern blot (data ikke vist). One + DOX og én-DOX-mus blev trukket ud af undersøgelsen efter en måned

Væv fra to steder i U2020 celler podning blev analyseret ved hjælp af CD31 farvning og TUNEL analyse:. En SEMA3B-negative (fig 4A og 4B) og én SEMA3B-positive (fig 4C og 4D) mus. Anti-CD31 muse antistoffer blev anvendt til at farve blod mikrokar. blev fundet en meget få antal mikrokar i SEMA3B-positive væv. Et fragment indeholder et af de mikrokarrør-lignende genstande er vist ved fig 4C. Mikrokar signal (grøn kanal) blev co-lokaliseret med signalet fra erythrocytter (røde kanal) som følge til gulfarvede områder i fig 4A. Imidlertid SEMA3B-negative faste tumorer demonstrerede overflod af aflange, komprimerede blod kanaler med fluorescens typisk til epithel. Disse tumor kanaler blev også co-lokaliseret med erythrocytter (Fig 4A). Dette kunne støtte en rolle SEMA3B som inhibitor af angiogenese. Der er dog behov for yderligere eksperimenter på den udvidede prøveudtagning for at bevise dette forslag

(A, B) -.

SEMA3B

er OFF (mus fik doxycyclin i drikkevand). (C, D) –

SEMA3B

er ON (mus blev ikke administreret doxycyclin). (A, C) -staining med anti-CD31 til at overvåge blodkar (grøn signal). Når

SEMA3B

er OFF, områder fyldt med erythrocytter (røde signal) er set. Gul signal indikerer co-lokalisering af grønne og røde signaler. Blå signal svarer til DNA. (B, D) -TUNEL assay. Læg mærke til området med apoptotiske celler (grøn signal), hvor

SEMA3B

gen blev udtrykt.

Vi hypotese, at SEMA3B-positive celler i områder uden blodkar og erythrocytter undergår celledød. For at teste denne hypotese blev snit af samme vævsfragmenter analyseret ved en TUNEL assay en teknik muliggør påvisning af apoptotiske celler. (Fig 4B, 4D). Et stort område af apoptotiske celler blev observeret i SEMA3B-positive vævsprøve mens ingen apoptotisk område blev set i SEMA3B-negative tumorer. I dette tilfælde, antog vi, at ekspressionen af ​​

SEMA3B

undertrykte tumorvækst

in vivo

, sandsynligvis ved induktion af apoptose. Inhibition af angiogenese kunne foreslog også.

Methylering af promotoren og intron

SEMA3B

CpG-øer i lunge og renal cellelinjer og primære tumorer ved bisulfit sekventering og methylering-specifik PCR

SEMA3B

gen består af 18 exons og indeholder to CpG-øer: den ene er placeret i promotorregionen (1-st CpG-ø, hg38 /CHR3: 50,267,308-50,267,797, 22 CPG dinukleotider) og den anden i den første intron (2-nd CpG-ø, hg38 /CHR3: 50,268,972-50,269,271, 12 CpG-dinukleotider). Vi analyserede methylering profil 16 CpG-dinukleotider af promotor CpG-ø i 5 lunge cancer cellelinjer (3 SCLC og 2 NSCLC) og 12 NSCLC primære tumorer ved hjælp bisulfit sekventering (5 ADC og 7 SCC, se figur 5A). Tætte methylering ( 40% af de analyserede CpG’er var methylerede) af promotor CpG-ø i

SEMA3B

genet blev observeret i to af tre SCLC cellelinjer, men i ingen af ​​NSCLC cellelinjer (NCI -H157 og NCI-H647). Men i alle 7 SCC primære tumorer og i 2 af 5 ADC primære tumorer blev methylering opdaget, i 2-12 af CpG’er. Derudover undersøgte vi methylering profil i 9 renale cancercellelinier og 25 ccRCC primære tumorer (figur 5B). Tætte methylering af promotor CpG-ø blev observeret i 8 ud af 9 cellelinier og 11 af 25 ccRCC primære tumorer. Blandt matchede histologiske normale væv, blev påvist denatureret CpG’er kun i 2 ud af 25 ccRCC tilfælde og i ingen af ​​12 NSCLC sager (Fig 5A og 5B).

bisulfit sekventering data, 16 CpG-dinukleotider (2-17) af CpG-ø er givet. Grå firkanter viser methylerede CpG-dinukleotider, hvide firkanter-umethylerede. Antallet af primære tumorer svarer til dem i S1 tabellen. De dristige antal CpG-dinukleotider (3-4 og 9-12) angiver placeringen af ​​de primere, der blev brugt til MSP-metoden.

Næste, vi vurderet de methylering frekvenser af både CpG-øer af

SEMA3B

gen af ​​MSP-metoden ved hjælp af et repræsentativt sæt af primære tumorer. Methylering frekvens af promotoren CpG-øen var 44% (7/16) i ADC, 45% (10/22) i SCC og 52% (43/83) i ccRCC. Den intron CpG-ø methyleres lidt mindre end promotoren ø i begge histologiske typer af NSCLC (ADC -38%, 6/16; SCC -32%, 7/22), og i ccRCC (39%, 32/83; Table 2). De methylering frekvenser af begge øer var signifikant højere i tumorvæv end i parrede histologisk normale væv (

P

≤ 0,04, se tabel 2). Således methylering af både CpG-øer i

SEMA3B

gen er kendetegnende for lunge- og nyrekræft. Som forventet, methylering af hverken 1-st eller 2-nd

SEMA3B

CpG-ø blev detekteret i nogen DNA-prøver isoleret fra blodlymfocytter fra raske donorer (n = 15). De MSP-data var i overensstemmelse med de bisulfit sekventering resultater for hver type kræft undersøgt.

Anvendelse af et repræsentativt sæt primære tumorer tilladt os at afsløre mulige sammenhænge mellem methylering hyppigheden af ​​promotoren og introniske CpG-øer med de patologiske og histologiske parametre af tumorerne. Avanceret ccRCC og NSCLC tumorer havde en højere frekvens af CpG-ø methylering forhold til de tidlige stadier (Tabel 2 og 3). Den stærkeste korrelation blev vist for SCC (Spearman rang korrelationskoefficienter var lige 0,37,

P

= 0,09, og 0,60,

P

0,01, for 1-st og for de 2- nd CpG-ø, henholdsvis). En positiv korrelation blev observeret mellem tumor kvalitet og hyppigheden af ​​CpG-ø methylering for NSCLC og ccRCC (tabel 3). Denne korrelation var stærkere end korrelationen mellem tumor fase og hyppigheden af ​​CpG-ø methylering for begge histologiske typer af NSCLC og næsten lig med dem for ccRCC (tabel 3).