Abstrakte
Forkhead box M1 (FOXM1) er en spredning-associeret transkriptionsfaktor afgørende for cellecyklusprogression. Talrige undersøgelser har dokumenteret, at FOXM1 har flere funktioner i tumorigenese og dens forhøjede niveauer er ofte forbundet med kræft progression. Her, kendetegnet vi rollen som ERK /FOXM1 signalering i mediering metastatiske potentiale ovariecancerceller. Immunhistokemisk (IHC), immunoblotting og semikvantitativ RT-PCR-analyser vist sig, at både phospho-ERK og FOXM1 ofte blev opreguleret i ovariecancere. Interessant, den overudtrykte phospho-ERK (
s
0,001) og FOXM1 (
s
0,001) var signifikant korreleret til high-grade tumorer i æggestokkene med aggressiv adfærd såsom metastaseret lymfeknude (5 ud af 6). Desuden udtryk for phospho-ERK og FOXM1 havde væsentligt positiv korrelation (
s
0,001). Funktionelt, ektopisk udtryk for FOXM1B bemærkelsesværdigt forbedret cellemigration /invasion, mens FOXM1C ikke kun øget celledeling, men også fremmet cellemigration /invasion. Omvendt hæmning af FOXM1 udtryk ved enten thiostrepton eller U0126 kunne væsentligt svækker FOXM1 medieret onkogene kapacitet. Men den nedregulering af FOXM1 ved enten thiostrepton eller U0126 kræves tilstedeværelsen af p53 i ovariecancerceller. Kollektivt, vores data tyder på, at overekspression af FOXM1 kunne stamme fra den konstitutivt aktive ERK som giver de metastatiske kapaciteter til æggestokkene cancerceller. Nedskrivningen af metastatisk potentiale af kræftceller ved FOXM1 hæmmere understreger dets behandlingsmæssige værdi i fremskredne ovarietumorer
Henvisning:. Lok GTM, Chan DW, Liu VWS, Hui WWY, Leung THY, Yao KM, et al. (2011) Afvigende Aktivering af ERK /FOXM1 Signaling Cascade Triggers Cell Migration /Invasion i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 6 (8): e23790. doi: 10,1371 /journal.pone.0023790
Redaktør: Maria G. Castro, University of Michigan, USA
Modtaget: 9. december 2010; Accepteret: 26 Juli 2011; Udgivet: 17 August, 2011
Copyright: © 2011 Lok et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Wong Cheuk Hun Charitable Foundation. Denne støtte er fra private donationer, og ingen bidragyder hjemmeside er tilgængelig. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i æggestokkene er en af de mest dødelige gynækologiske maligniteter verdensplan. På grund af de ikke-specifikke symptomer, de fleste af æggestokkene kræfttilfælde er præsenteret med fremskredent sygdom og omgås høj dødelighed [1]. I den avancerede ovariecancer, tumorceller er meget invasiv og den efterfølgende cancer metastase fører til døden [2]. Både cellemigration og invasion bidrager den metastatiske evne af tumorcellerne og den genetiske mekanisme, der regulerer metastase forbliver stort set ukendt. Derfor er det af afgørende betydning at identificere molekylære mediatorer der giver metastatisk potentiale til æggestokkene kræftceller, kan anvendes som tumormarkører forudsige risikoen for kræft i æggestokkene progression.
Forkhead Box M1 (FOXM1) er en typisk transskription faktor, der hører til Forkhead Box familien [3]. FOXM1 er kendt for sin kritiske rolle i cellecyklusprogression ved at regulere G1 /S og G2 /M faser af cellecyklus overgang og sikre en korrekt gennemførelse af mitotisk celledeling [3], [4], [5]. Men stærke beviser understøtter en sammenhæng mellem afvigende ekspression af FOXM1 og humane carcinomer, såsom kræft i bugspytkirtlen, basalcellecarcinomer, glioblastomer og livmoderhalskræft [6], [7], [8], [9]. Vigtigere er det, forøget ekspression af FOXM1 har bemærkelsesværdig korrelation med de progressive faser af talrige humane cancere [6], [9], [10], [11], [12]. Derfor FOXM1 ikke kun fremmer tumorigenese ved at give proliferativ kapacitet og fører til ukontrolleret celledeling ved den tidlige periode med udvikling af kræft, men også forbedrer andre tumorigene adfærd i andre stadier af kræft udvikling [12], [13], [14]. Til dato er flere linjer af beviser vist, at FOXM1 kunne forbedre angiogenese i gliomceller [15], forankringsuafhængig vækst evne i cervicale cancerceller [6], tumorvækst evne gliomceller [7] og metastase af hepatocellulære carcinomer celler i nøgne mus [16], hvilket indebærer de forskellige roller FOXM1 i tumorigenese. For nylig har Cancer Genome Atlas Research Network brugte en probabilistisk grafisk model (paradigme) at bevise, at FOXM1 signalering er kritisk forbundet med serøs ovariecancer patofysiologi [17]. Men udtrykket status og funktionelle roller FOXM1 i kræft i æggestokkene, især i cellemigration /invasion er stort set spekulative. Dette fremhæver et presserende behov for at afgrænse den molekylære mekanisme, der ligger kræft progression således at forøge overlevelsesraten for patienter med ovariecancer.
Konstitutiv aktivering af ERK-signalering er normalt forbundet med neoplastisk transformation såsom ukontrolleret cellevækst ved stimulere celle overlevelse vej og øge celle motilitet [18], [19], [20], [21]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at ERK virker opstrøms for FOXM1 og phosphoryleringen af FOXM1 af ERK er nødvendige for kernen translokation og efterfølgende transaktivering [22]. Desuden har FOXM1 vist sig at være en af ERK effektorer i human hepatocellulært carcinom og brystcancer [23], [24]. Men funktionen af ERK /FOXM1 signaleringskaskade i regulering cellemigration /invasioner er endnu ikke klart belyst.
I denne undersøgelse har vi først analyseret ekspressionen status og klinisk-patologisk korrelation af FOXM1 i ovariecancer. Adskillige tumorigene analyser blev udført i æggestokkene kræft celle modeller med GAIN- og tab af funktion af FOXM1 gennem tvungen udtryk for FOXM1 eller hæmning af endogen FOXM1 ved thiostrepton eller U0126. Vi gav også de data, der viser vigtigheden af p53-status i brugen af FOXM1 inhibitorer. Desuden har vi forudsat den første
in vitro
beviser for ERK /FOXM1 signaleringskaskade at fremme celle migration /invasion i æggestokkene cancerceller. Dette giver et opmuntrende mål i bekæmpelsen fremskreden kræft i æggestokkene.
Resultater
FOXM1 er overudtrykt og korrelerer med pERK udtryk og høj kvalitet undertype af kræft i æggestokkene
At studere betydningen af FOXM1 ekspression i æggestokkene cancerudvikling, IHC-analyse på et kommercielt vævsarray af 97 ovariale vævsprøver, herunder 2 normal, 2 godartet, 1 borderline cystademoma og 96 maligne tumorprøver blev udført. Høj FOXM1 udtryk var signifikant korreleret med high-grade tumorer (grad 3) (
P
0,001), hvor 73,33% af grad 3 tumorer tilfælde udstillet overekspression af FOXM1 mens 68% af kvaliteter 1 og 2 tumorer tilfælde udviste lav ekspression af FOXM1 (tabel 1). Med hensyn til tumor undertype blev ekspressionen af FOXM1 stærkt korreleret med endometriod adenocarcinom (
P
0,05), hvor 74,07% af tilfældene viste overekspression af FOXM1 (tabel 1). Derudover 5 ud af 6 tilfælde med lymfeknudemetastaser viste overekspression af FOXM1 (data ikke vist). På trods af den begrænsede stikprøvestørrelse, kunne det være en reference for en sammenhæng mellem FOXM1 og fjernmetastaser. Desuden blev opdaget en bemærkelsesværdig sammenhæng mellem opregulering af både FOXM1 og pERK (
P
0,001) (Tabel 1). Svarende til FOXM1, blev registreret en signifikant sammenhæng mellem ekspression af pERK og high-grade tumorer (
P
0,001), hvor 66,67% af grad 3 tumorer viste høj ekspression af pERK (tabel 2). Overensstemmende svage til meget stærk farvning af pERK og FOXM1 blev også observeret fra borderline cystademoma til Grade 3 tumor, implicerer betydningen af de to proteiner i tumor progression af ovariecancer (fig. 1A).
(A) repræsentant IHC viste immunoreaktiviteterne af FOXM1 og pERK i borderline, Grade 1, Grade 2 og Grade 3 tumor på en æggestokkene kræftvæv array (OVC1021) (x20). Øget farvning af både FOXM1 og pERK blev observeret sammen med udviklingen af kræft, som implicerer deres potentielle roller i tumorigenese. (B) Western blotting viste udtryk for pERK, ERK og FOXM1 i slanger og æggestokkene kræft cellelinjer. (C) Fast time qPCR-analyse afslørede udtryk for FOXM1 isoformer;
FOXM1B
FOXM1C
i slanger og æggestokkene kræft cellelinjer.
FOXM1A
blev forsømt i dette eksperiment, fordi det blev rapporteret som værende transkriptionelt inaktiv. Vejviser
For cellelinjer undersøgelse, udtryk for pERK og FOXM1 også demonstreret en god korrelation i et panel af ovariecancer og slanger cellelinier. Begge proteiner blev stærkt udtrykt i kræft cellelinjer, især i OVCAR3, SKOV3, OVCA429 og A2780cp, mens de viste lavere udtryk i SLANGE cellelinjer (fig. 1B). Ligeledes real time qPCR analyse ved hjælp af specifikke primere i henhold til tidligere rapport [12] viste, at både
FOXM1B
(27 til 250 gange) og
FOXM1C
(25-172 gange) var op -regulated i æggestokkene kræftceller sammenlignet med SLANGE cellelinjer (Fig.1C). Dette resultat var konsistent med resultaterne af western blot analyse og viste også, at der ikke var nogen forskel på de ekspressionsmønstre mellem to isoformer i æggestokkene kræftceller. Kollektivt, disse data tyder på, at både ERK aktivitet og FOXM1 udtryk er op-reguleret og positivt korreleret i ovariecancer, især i aggressive high-grade tumorer, der implicerer deling af en fælles vej i kræft i æggestokkene progression.
FOXM1 fremmer celledeling og cellemigration /invasion
i betragtning af at high-grade tumorer var yderst proliferativ og metastatisk, vi ræsonnerede, at FOXM1 spiller en vis rolle i reguleringen af celle motilitet og invasion. For at undersøge de onkogene roller FOXM1 i kræft i æggestokkene, vi vurderet de funktionelle effekter af to aktive FOXM1 isoformer, FOXM1B og FOXM1C, om A2780cp og OVCA433 celler (Fig. 2A). I overensstemmelse med tidligere rapporter [14], [25], kunne FOXM1C øge celledeling kapacitet i A2780cp (
P
0,005) og OVCA433 (
P
= 0,006) ovariecancerceller, mens FOXM1B bare viste svag øget effekt (fig. 2A). På den anden side kan ektopisk ekspression af FOXM1B og FOXM1C fremme hurtigere sårlukning i A2780cp og OVCA433 ovariecancerceller efter sårheling assay (fig. 2B). Ved Transwell migration /invasion analyser, indførelsen af FOXM1B og FOXM1C viste også en signifikant øget migration celle (
P
0,05 i A2780cp og
P
0,005 i OVCA433). (Fig 2C ) og celleinvasion (
P
0,05 i A2780cp og
P
. 0,01 i OVCA433) (fig 2D) evner i A2780cp og OVCA433 celler sammenlignet med vektor kontrol. Interessant, FOXM1B havde relativt stærkere indflydelse i at fremme celle migration og invasion i forhold til FOXM1C. Tilsammen disse data giver at FOXM1 isoformer forskelligt kunne fremme celleproliferation, migration /invasion i æggestokkene cancerceller.
(A) XTT celleproliferationsassay viste, at FOXM1C bemærkelsesværdigt kunne øge celle spredning af i A2780cp (*
P
0,005) og OVCA433 (**
P
= 0,006) ovariecancerceller, mens FOXM1B lige havde lidt virkning. Western blotting viste udtryk for FOXM1B (1B) og FOXM1C (1C) i A2780cp og OVCA433 celler ved hjælp af anti-FOXM1 (K19). Den tomme vektor blev anvendt som negativ kontrol (V). (B) sårheling assay viste hurtigere sårlukning på FOXM1B eller FOXM1C ektopisk udtrykker A2780cp (*
P
0,05) og OVCA433 (**
P
0,01) celler sammenlignet med vektor kontrol (*
P
0,05). (C) Transwell migration assay og søjlediagram viste højere vandrende sats i FOXM1B og FOXM1C ektopiske udtrykkende celler af A2780cp (*
P
0,05) og OVCA433 (*
P
0,005 ) sammenlignet med deres vektor kontrol (V). (D) Transwell invasion celle assay og søjlediagram viste højere invasion sats gennem Matrigel-coatede membran i FOXM1B og FOXM1C ektopisk udtrykkende celler af A2780cp (*
P
0,05) og OVCA433 (*
P
0,01) sammenlignet med deres vektor kontrol (V). blev udført De ovennævnte eksperimenter tre gange uafhængigt, og resultatet blev plottet.
Effektiv hæmning af FOXM1 udtryk ved thiostrepton kræver p53
thiazol antibiotiske thiostrepton kan specifikt inhibere ekspressionen af FOXM1 på gen promotor niveau i brystcancercellelinier [26], og det blev derfor anvendt til at depletere ekspressionen af FOXM1 i ovariecancerceller. Ved thiostrepton behandling, vi observerede forskellige reaktioner af FOXM1 i æggestokkene kræft cellelinjer der bærer forskellige p53 genotypiske status: OVCA433 (p53 vildtype), A2780cp (p53 mutant) og SKOV3 (p53 slettet). OVCA433 og A2780cp celler viste en udtalt dråbe FOXM1 ekspression i en tids- og dosering-afhængig måde, såvel som en forøget ekspression af p53 ved højere dosis (20 uM) af thiostrepton (fig. 3A). På den anden side, SKOV3 var resistent over for thiostrepton og FOXM1 ekspression opretholdt ved 10, 30 og 50 uM. Disse resultater antyder, at p53 kan være involveret i thiostrepton virkende mekanisme. I betragtning af de meget modsatrettede roller p53 og FOXM1 i cellecyklus regulering og den negative virkning af p53 på FOXM1 udtryk vist i tidligere microarray resultat [5], [27], [28], [29], [30], vi vurderede ekspressionen af FOXM1 der efter ændring af p53-ekspression i ovariecancerceller. Transient transfektion af p53 bemærkelsesværdigt reduceret FOXM1 ikke kun i proteinniveau (fig. 3B), men også i mRNA-niveau (fig. 3C) i OVCA433, A2780cp og SKOV3. Disse resultater indikerer, at p53 negativt regulerer både mRNA og protein niveauer af FOXM1 og p53 er afgørende for thiostrepton at udøve inhibering på FOXM1 ekspression i ovariecancerceller.
(A) Western blotting afslørede nedregulering af FOXM1 og opregulering af p53 i æggestokkene cancercellelinier; OVCA433 og A2780cp, men ikke i SKOV3 ved behandling af thiostrepton under forskellige doser og tidsintervaller. (B) Western blotting viste, at forbigående transfektion med p53 kunne undertrykke FOXM1 udtryk i æggestokkene cancerceller (OVCA433, A2780cp og SKOV3). (C) Real time PCR angivet nedregulering af
FOXM1
udskrifter upon forbigående transfektion af p53.
nedregulering af FOXM1 svækker cellemigration /invasion
Vi hypotese, at thiostrepton kan undertrykke den kræft i æggestokkene cellemigration /invasion ved at hæmme ekspression af FOXM1. Da thiostrepton kunne inducere apoptotisk virkning på cancerceller [26], XTT assays blev udført tre gange for at udelukke faktor reduceret cellelevedygtighed, som kan påvirke nøjagtigheden af anvendelse af sårlukning tid til evaluering cellemigrering. Faktisk cellelevedygtigheden af de ovennævnte cellelinier viste ingen signifikante ændringer efter behandling af dosisområdet fra 0 til 10 pM thiostrepton (fig. S1). Ved behandling med thiostrepton, viste OVCA433 celler en indlysende undertrykkelse af cellemigrering, med -50% reduktion af sårlukning i sammenligning med den ubehandlede kontrol i sårheling assay (
P
0,05). (Fig 4A ). blev observeret lignende inhiberende virkning på cellemigrering i A2780cp celler (data ikke vist). Men behandling på SKOV3 viste ingen signifikant indflydelse på celle vandrende inhibering (fig. S2). Desuden behandling af 10 uM thiostrepton på OVCA433 også dramatisk reduceret ca. 37% celle migration (
P
0,05), og 75% celleinvasion (
P
0,05) evner i forhold med kontrol i Matrigel assay (fig. 4B). Taget sammen antyder disse data at FOXM1 væsentligt regulerer celleproliferation og cellemigrering /invasion i ovariecancerceller.
(A) sårheling assay viste lavere sårlukning på thiostrepton-behandlede OVCA433 celler i sammenligning med ubehandlet kontrol (*
P
0,05). (B) Transwell migration assay og søjlediagram viste signifikant lavere antal migrerende celler gennem Matrigel-coatede membran i FOXM1-udtømte OVCA433 celler end kontrolgruppen (*
P
0,05) (
øvre
). Transwell celle invasion assay og søjlediagram viste lavere invasion sats i FOXM1-udtømte OVCA433 celler efter thiostrepton behandling, når sammenlignet med kontrolgruppen (*
P
0,05) (
lavere
). (C) Western blotting afslørede nedregulering af FOXM1 i æggestokkene kræft cellelinier (OVCA433 og OV2008) efter behandling med U0126 til forskellige tidsintervaller. (D) sårheling assay viste lavere sår lukning på U0126-behandlede OVCA433 celler i forhold til ubehandlede kontrol (*
P
0,05). Tre uafhængige forsøg blev udført, og resultatet blev plottet.
ERK aktivitet regulerer celle migration medieret af FOXM1 i ovariecancerceller
Som ovennævnte undersøgelse stiltiende den plausible sammenslutning af ERK aktivitet og FOXM1 ekspression (fig. 1A og 1B), er det interessant at undersøge den underliggende molekylære mekanisme. OVCA433 og OV2008-celler blev behandlet med MEK-inhibitor U0126 og niveauerne af pERK og FOXM1 blev evalueret på forskellige tidspunkter ved Western blot analyse. En bemærkelsesværdig nedgang i pERK niveau blev observeret i begge cellelinier så tidligt som 30 minutter, og der var en ledsagende reduktion af FOXM1 ekspression (fig. 4C). Desuden, inhibering af FOXM1 ekspression opretholdt så længe ERK aktivitet forblev undertrykt (fig. 4C). Da ERK ligger op-strøm af FOXM1 [23], [24], vi ræsonnerede, at hæmning af ERK aktivitet bør ophæve celle migration af kræft i æggestokkene celler gennem nedregulere FOXM1. Faktisk ved anvendelse af sårheling assay OVCA433 celler behandlet med U0126 viste en betydelig stigning af sårlukning tid (2 gange mere) sammenlignet med kontrollen (
P
0,05) (. Figur 4D). På den anden side var der ingen reduktion af FOXM1 ekspression og cellemotilitet i SKOV3-celler (p53 udgår) ved behandling af U0126 (fig. S3), hvilket indikerer, at tilstedeværelsen af p53 er påkrævet for U0126 eller thiostrepton medieret FOXM1 inhibering. Tilsammen disse resultater understøtter en vigtig rolle FOXM1 i mediere effekten af ERK på celle migration i æggestokkene cancerceller.
MMP-9 og uPAR er FOXM1 downstream mål regulerer celle migration /invasion
Ekstracellulære proteaser som metalloprotease-9 (MMP-9) og urokinase receptor (uPAR) er markører for erhvervelse af den metastatiske kapacitet [2]. Derfor undersøgte vi niveauet af
MMP-9
og
uPAR
at bekræfte effekten af FOXM1 på celle motilitet og invasion. Ved at undertrykke FOXM1 udtryk med 5 og 10 uM thiostrepton i OVCA433, niveauerne af både
MMP-9
og
uPAR
blev reduceret med omkring 20 til 30% (Fig. 5). Omvendt forbigående overekspression af FOXM1 steget
MMP-9
og
uPAR
niveauer ved ~1.7 gange og ~2.4 gange, henholdsvis (fig. 5). Disse data tyder på, at FOXM1 regulerer cellemigration /invasion gennem transkriptionelt opregulering udtrykkene for
MMP-9
og
uPAR
.
Semi-kvantitativ RT-PCR viste at hæmning af FOXM1 udtryk ved thiostrepton (5 og 10 uM) i OVCA433 forårsagede et fald på
MMP-9
og
uPAR
udtryk (
venstre
), mens forbigående transfektion med FOXM1 ekspressionsplasmid (1 og 2 mg) i OVCA433 viste en stigning på
MMP-9
og
uPAR
udtryk (
rigtige
). Den numeriske værdi under hvert panel henvist til mRNA-ekspression niveau i forhold til kontrollen.
Diskussion
I denne undersøgelse har vi vist, at FOXM1 var afvigende opreguleret i kræft i æggestokkene , især i high-grade undertype. Tilsvarende blev forøget phospho-ERK i samtidig med FOXM1 signifikant associeret med høj kvalitet kræft i æggestokkene. Vi foreslog derfor, at FOXM1 overekspression kunne stamme fra konstitutivt aktiveret ERK-signalering, der bidrager til den metastatiske kapacitet i kræftceller. Vores undersøgelse indikerer, at ERK /FOXM1 signaleringskaskade kan være et lovende mål for terapeutisk intervention i ovariecancer.
Vi og andre grupper har tidligere rapporteret, at FOXM1 ofte dereguleres i en række forskellige humane cancere [31]. Vigtigt er det, blev den forøgede FOXM1 ekspression forbundet med tumorudvikling af humane cancere [6], [9], [10], [11], [12]. Men de funktionelle roller FOXM1 i kræft i æggestokkene forblive stort set uudforsket. Her viste vi, at både mRNA og protein niveauer af FOXM1 opreguleret i ovariecancer væv og cellelinier. FOXM1 overekspression var signifikant korreleret med high-grade ovarietumorer, hvilket indikerer, at FOXM1 kan spille en onkogen rolle i ovariecancer, især i high-grade subtype. Vi udforskede derfor effekten af FOXM1 i celle migration /invasion, som er et fælles tumorigen scenarie observeret i aggressive high-grade tumorer
Begge transkriptionelt aktive splejsningsvarianter af FOXM1.;
FOXM1B
FOXM1C
har vist sig at være forhøjet i adskillige menneskelige kræftformer. Især blev FOXM1B påvist at fremme angiogenese, tumorvækst af gliomaceller og metastase af HCC i fravær af ARF mens FOXM1C viste sig at forbedre cellevækst og forankringsuafhængig evne cervicale cancerceller [6], [7], [15 ], [16]. Her tvungen udtryk for enten FOXM1B eller FOXM1C kunne fremme celleproliferation, migration og invasion i æggestokkene cancerceller. Selvom vores resultater viste, at FOXM1C fortrinsvis øget celleproliferation mens FOXM1B fremmes cellemigration /invasion, samtidig reduktion af både FOXM1 isoformer under anvendelse thiostrepton ført til lignende virkninger i både celleproliferation samt cellemigration /invasion. Effekten af FOXM1 blev yderligere bekræftet ved at undersøge de udtryk for kendte markører i celle migration /invasion,
MMP-9
og
uPAR
, som er i overensstemmelse med den metastatiske rolle FOXM1 rapporteret i andre menneskelige kræftformer [9], [16], [32], [33]. Hvorvidt FOXM1 direkte regulere disse markører eller andre nedstrømseffektorer kræver yderligere undersøgelser. Ikke desto mindre er alle disse observationer tyder på, at afvigende opregulering af FOXM1 attributter de tumorgene egenskaber i høj kvalitet kræft i æggestokkene.
ERK er en af en afgørende mediator i Raf /ERK /MAPK signalering akse opretholde forskellige cellulære funktion, herunder celleproliferation, apoptose samt migration [34]. Tidligere har ERK blevet vist at være konstitutivt aktiv i ovariecancer og vores identifikation af højt ekspressionsniveau af pERK i histologiske high-grade ovariecancer og cellelinier indikerer dets centrale rolle i at forårsage aggressiv tumorigenese [35]. Interessant nok fandt vi, Perk og FOXM1 niveauer tæt korreleret under cancer progression, især i high-grade ovariecancer. Vi spekuleret på, at forhøjet FOXM1 ekspression udløses af den konstitutive aktivering af ERK, hvilket fører til forøget cellemotilitet i ovariecancer. Som forventet blev deres forhold bekræftet ved manipulering af aktiviteten af ERK, hvilket resulterede i parallelle ændringer i FOXM1 ekspression. I en anden undersøgelse har motiver, der ligner den ERK målsekvensen blevet fundet i FOXM1 og aktivering af ERK-aktivitet blev demonstreret at inducere transaktiverende evne FOXM1C [22]. Således ville undertrykke ERK aktivitet ved U0126 reducere FOXM1 fosforylering, som endelig fører til hæmning af FOXM1 udtryk ved at afbryde sin egen positiv spiral [36]. Selv om det gav os et fingerpeg, at transaktivering af FOXM1 afhænger fosforylering af ERK på post-transkriptionel niveau, der er mangel på rapporter om de funktionelle egenskaber af aktiverede ERK /FOXM1 signalering akse i kræft i æggestokkene. I sårhelende undersøgelsen, faktisk faldet i sårlukning sats grundet inhiberet ERK aktivitet og reduktion af FOXM1 ekspression ved U0126 behandling antyder stærkt, at FOXM er en af de store nedstrøms effektorer af ERK-signalering. Desuden thiostrepton og U0126 undertrykt cellemigration i et tilsvarende omfang (40% sammenlignet med 50%). Samlet set mener vi, at opreguleret ERK aktivitet og den efterfølgende stigning i FOXM1 udtryk bidrage yderligere induktion af onkogene adfærd, støtte, at ERK /FOXM1 signalering akse letter celle migration i kræft i æggestokkene.
Tidligere undersøgelser har vist, at lovende effekt af thiostrepton i at ændre de tumorgene adfærd medieret af FOXM1 [26], [37], [38]. Givet det differentielle følsomhed FOXM1 til nedregulering af thiostrepton behandling i cellelinier med forskellige status af p53, er det fristende at spekulere vigtigheden af p53 for virkningen af thiostrepton. Baseret på det faktum, at tabet af p53-funktion er en almindelig hændelse i tumorer og FOXM1 reguleres negativt af p53, vi spekuleret på, at miste p53-ekspression kan forårsage en deregulering af FOXM1 og derved forårsager cellulær katastrofe og endog kræft. Her, p53 udgår cellelinjen SKOV3 viste ingen reaktion FOXM1 til forskellige doser af thiostrepton samt MEK-inhibitor, U0126, mens FOXM1 kunne let undertrykkes ved multiple doser i OVCA433 og A2780cp som bærer vildtype og muterede p53-gener hhv. Tidligere undersøgelser har vist, at thiostrepton kan fremkalde apoptotisk virkning på cancerceller ved at stabilisere p53-ekspression [39] og opregulering af p53 ved højere dosis kan yderligere hjælpe undertrykkelse af FOXM1. Interessant, thiostrepton eller U0126 havde ingen indflydelse på SKOV3 bærer slettet p53-gen, hvorimod ektopisk udtryk for p53 afskaffet udtryk for FOXM1 på både RNA og protein niveau, i overensstemmelse med andre undersøgelser [28], [30]. Dette afdækker den nødvendige rolle af p53 i mediering den undertrykkende virkning af thiostrepton på FOXM1 ekspression. Bortset fra at forringe cellemigration /invasion evne, en anden gruppe viste også, at anvendelsen af thiostrepton også kunne øge apoptose og proliferativ standsning i humane cancerceller, som yderligere understreger den terapeutiske værdi af thiostrepton [26], [37], [38], [39], [40]. Kollektivt, vores undersøgelse understøtter, at thiostrepton funktioner ved at undertrykke FOXM1 udtryk via p53 til efterfølgende afhjælpe tumorigenicitet og up-regulerende p53 til at fremkalde celledød.
Som konklusion, vores undersøgelse viste en sammenhæng mellem ERK /FOXM1 signalering akse og den metastatiske adfærd ovariecancerceller. Desuden afslørede vi en kritisk rolle af p53 i mediering af virkningen af thiostrepton. Derfor både U0126 og thiostrepton repræsenterer lovende udgangspunkter for at etablere anti-cancer terapi i kræft i æggestokkene gennem undertrykkelse af FOXM1.
Materialer og metoder
cellelinjer og cellekultur
Fem udødeliggjort menneskelige æggestokkene overflade epitelceller blev anvendt: HOSE10-2, HOSE11-12, HOSE17-1, HOSE20-3 og HOSE21-3 (fra professor George Tsao, The University of Hong Kong). Ni æggestokkene cancer cellelinjer blev anvendt: A2780s A2780cp, OV2008, C13 (fra professor Benjamin Tsang, The University of Ottawa), OV420, OV429, OV433, OVCAR3 og SKOV3 (American Type Culture Collection, Rockville). Alle cellelinier blev inkuberet ved 37 ° C i 5% CO
2 i enten minimum essential medium eller Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Gibco-BRL, Gaithersburg) med 10% føtalt bovint serum (Gibco) og 1% penicillin-streptomycin ( Gibco).
plasmider og transfektion
De lentivirale pCDH-FOXM1B og pCDH-FOXM1C plasmider blev genereret af subkloning FOXM1B og FOXM1C cDNA’erne fra pcDNA3-FOXM1B og pcDNA3-FOXM1C plasmider i pCDH-MSCV- MCS-EF1-GFP-Puro lentiviral plasmid (SBI, Mountain View, CA) hhv. Den pRcCMV-p53 plasmid var fra professor Randy YC Poon (Afdeling for Biokemi og Cellebiologi, Hongkong Universitet for Videnskab og Teknologi, Hong Kong). LipofectAMINE ™ 2000 transfektionsreagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) blev anvendt til celletransfektion ifølge producenternes instruktioner. De pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP-Puro og pcDNA3.0 tomme vektorer blev anvendt som negative kontroller. At etablere FOXM1B og FOXM1C stabilt udtrykker celler, blev lentivirale inficerede celler udvælges ved 2 ug /ml puromycin (Sigma) i 2 uger og verificeret ved Western blot-analyse.
Semi-kvantitative (SQ-PCR) og kvantitative ( QPCR) revers transkriptase-polymerasekædereaktion
Totalt RNA blev isoleret ved TRIzol (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Komplementært DNA blev syntetiseret under anvendelse af revers transkription reagens kittet (Applied Biosystems, Foster City). Efterfølgende blev cDNA bruges til at udføre PCR med specifikke gener primere af
FOXM1B
(fremad, 5′-TTGCCCCCAAGGTGCTGCTA-3 ‘og omvendt, 5’GGAGATTGGGACGAATCCTC-3’),
FOXM1C
( frem, 5′-CACCCATCACCAGCTTGTTT3 «og omvendt, 5′-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3 ‘),
MMP9
(fremad, 5’CATCGTCATCCAGTTTGGTG og omvendt, 5′-GCCTTGGAAGATGAATGGAA-3′) og
uPAR
(fremad, 5′-GCCTTACCGAGGTTGTGTGT-3 ‘og revers, 5’GGCAGATTTTCAAGCTCCAG 3’) på betingelse af 94 ° C (5 min), efterfulgt af 30-35 cyklusser af 95 ° C (30 sek), 57 ° C (30 sek) og 72 ° C (30 sek), derefter endelig 72 ° C (10 min) og 4 ° C. Den relative mængde af genet blev normaliseret mod GAPDH mRNA.
Q-PCR blev udført ved TaqMan® genekspression assays og SYBR Green Gene Expression Assay. For at validere udtryk for
FOXM1
isoformer, specifikke primere målrettet mod
FOXM1B
FOXM1C
blev udformet i henhold til Kalin
et al
[11], og købt fra Applied Biosystems. For at undersøge ekspressionen af p53, specifikke TaqMan prober (Applied Biosystems) inkluderet i PCR-blanding blev underkastet PCR under betingelser med 95 ° C i 2 minutter, 40 ° C cyklusser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut. Relativ mængde RNA i hver prøve blev bestemt ved komparativ CT metode med 7500 System SDS-software (version 1.3.1), hvorfra fold forskel blev sammenlignet med den interne kontrol
18S
og
TBP
og den relative fold forskel var derefter normaliseret til kalibratoren. Den relative ekspression niveauet af target-genet blev fortolket som ganges forskel til det endogene kontrol.
Western blotting og immunhistokemisk (IHC) analyser
Totalt protein blev fremstillet ved tilsætning passende mængde 1x lysepuffer til cellepelleten.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.