PLoS ONE: miR-107 Aktiverer ATR /Chk1 Pathway og Undertryk livmoderhalskræft Invasion ved Målretning MCL1

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af enkeltstrengede, ikke-kodende RNA på ca. 22 nukleotider lange. Stigende beviser implicerer miRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere. Her viste vi, at miR-107 direkte målrettet MCL1 og aktiveret ATR /Chk1 vej til at hæmme proliferation, migration og invasivitet af livmoderhalskræft celler. Desuden fandt vi, at MCL1 var ofte opreguleret i livmoderhalskræft, og knockdown af MCL1 markant hæmmet kræft proliferation, migration og invasion, mens ektopisk udtryk for MCL1 markant forbedrer disse egenskaber. Genoprettelsen af ​​MCL1 ekspression kan modvirke virkningen af ​​MIR-107 på cancercellerne. Sammen MIR-107 er en ny regulator af MCL1, og begge MIR-107 og MCL1 spiller vigtige roller i patogenesen af ​​livmoderhalskræft. Vi har derfor identificeret en mekanisme til ATR /Chk1 vej, som indebærer en forøgelse af miR-107, der fører til et fald i MCL1. Tilsvarende vores resultater viste, at MIR-107 berørte ATR /Chk1 signalering og genekspression, og impliceret MIR-107 som et terapeutisk mål i human livmoderhalskræft. Vi viste også, at taxol svækket migration og invasion i cervicale cancerceller ved at aktivere MIR-107, hvori MIR-107 spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​MCL1. Belysning af dette opdagede MCL1 blev reguleret direkte af miR-107 vil øge vores forståelse af de mekanismer, der er ansvarlige for livmoderhalskræft og vil give en ekstra arm for udvikling af kræft behandlinger

Henvisning:. Zhou C, Li G Zhou J, Han N, Liu Z, Yin J (2014) miR-107 Aktiverer ATR /Chk1 Pathway og Undertryk livmoderhalskræft invasion ved Målretning MCL1. PLoS ONE 9 (11): e111860. doi: 10,1371 /journal.pone.0111860

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: 15 juli, 2014 Accepteret: 8 okt 2014; Udgivet: 11. november 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National High Technology Research and Development Program Kina (863-programmet) (2010AA023002) og National 12. Five-Year videnskabelig og teknisk støtte Program Kina (2012BAI02B02). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aberrant microRNA (miRNA) udtryk er et karakteristisk træk ved den menneskelige malignitet. Specifikke miRNA er blevet identificeret som initiativtagere eller undertrykkere af metastatisk progression [1], [2]. Livmoderhalskræft er også for nylig blevet vist at være associeret med en unormal miRNA ekspressionsprofil, hvilket antyder, at miRNA kan bidrage til udvikling af cancer [3]. Cervikal carcinom har stor betydning for kvinders sundhed i hele verden og rangerer som den næststørste dødsårsag kræft hos kvinder efter brystkræft i øjeblikket. Ca. 500.000 tilfælde af livmoderhalskræft er diagnosticeret årligt, med næsten 45% af dem med døden til følge [4], [5]. Cervikal cancer er en kompleks sygdom, der involverer den abnorme ekspression af mange onkogener og tumorsuppressorgener. Selvom fokus på kendte gener har givet væsentlige nye oplysninger, hidtil ukendte ikke-kodende RNA, såsom miRNA, også kan give indblik i biologi livmoderhalskræft.

En række miRNA er blevet identificeret til at regulere tumor metastase. Blandt dem, MIR-107, der tilhører miR-103/107 familie på grund af deres identiske frø sekvenser, er i stand til at inducere epitel-til-mesenchymal overgang mammae epitelceller og derved fremme invasive og metastatiske adfærd af cancere [6] – [8]. Myeloid celle-leukæmi-1 (MCL1) er et anti-apoptotisk medlem af Bcl-2-protein-familien, og har vist sig dets ekspression at blive induceret i celler på forskellige stadier af vækst og differentiering [9]. På grund af dets anti-apoptotiske egenskaber, MCL1 er en potentiel protoonkogen. Desuden er forstærket ekspression af MCL1 observeret i en lang række tumorer, herunder hepatocellulær carcinom, brystcancer, etc [10] – [13]. Voksende tyder på, at MCL1 ekspressionsniveauerne er forbundet med dårligere kliniske resultater i forskellige kræftformer. Selvom miR-107 anses for at spille en central rolle i fastlæggelsen tumor egenskaber, reguleringen af ​​MCL1 udtryk i livmoderhalskræft er stort set ukendt. Det fik os til yderligere at analysere relevansen af ​​MCL1 for livmoderhalskræft.

I denne undersøgelse undersøgte vi den rolle, som miR-107, en miRNA forbundet med livmoderhalskræft og dens samspil med suppressor MCL1 spillet. Derfor har vi bestemt af QRT-PCR at MCL1 blev overudtrykt i livmoderhalskræft i forhold til tilstødende normale væv, og MCL1 blev identificeret som et direkte mål for miR-107. Knockdown af MCL1 undertrykt vækst og invasivitet af human cervikal cancer HeLa og SiHa-celler. Vores resultater viste, at MCL1 kan fungere som et onkogen og er en formidler af miR-107 i livmoderhalskræft. På trods af tilgængeligheden af ​​forskellige behandlingsmodaliteter, såsom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, 5-års overlevelsen er fortsat dårlig. Derfor er det absolut nødvendigt at undersøge stoffer, der kan forebygge og behandle livmoderhalskræft. Taxol har vist sig at have antitumorvirkninger på human lunge-adenocarcinom-cellelinje A549, human carcinom cellelinie hepatocellulær Bel-7402, human brystadenocarcinom MCF-7 og muse Lewis lungecarcinom-cellelinje

etc

[14] – [16]. Således i denne undersøgelse blev taxol forpligtet sig til at finde ud af, om taxol havde nogen virkning på proliferation, differentiering og apoptose af livmoderhalskræft celler, og at undersøge den mulige mekanisme på transskription niveau.

Eksperimentelle metoder

Etisk erklæring og emner

skriftlige informerede samtykke blev indhentet fra alle fag. Den eksperimentelle protokol blev revideret og godkendt af Etisk Komité Harbin Medical University (HMU-EF-10168) og blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

Plasmid Construction

Pri-mIR-107 blev amplificeret ved anvendelse af primerne og derefter klonet ind restriktionsstederne af pcDNA3. Den resulterende konstruktion pcDNA3 /PRI-MIR-107 blev bekræftet ved DNA-sekventering. En syntetiseret ASO-MIR-107 var som en inhibitor af MIR-107. 3′-UTR-fragmentet af MCL1 gen, der indeholder den forudsagte MIR-107 bindingssted blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primerne. PCR-produkter blev klonet ind i pcDNA3 /EGFP plasmid. Den resulterende vektor blev navngivet pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR. Desuden blev mutant fragment af MCL1 3′-UTR indeholdende et muteret MIR-107 bindingssted amplificeret under anvendelse af PCR site-directed mutagenese og klonet ind i pcDNA3 /EGFP plasmid mellem de samme steder. Alle indrykninger blev bekræftet ved sekventering. Til konstruktion af Sir-MCL1 vektoren, blev en 70-bp dobbeltstrenget fragment opnået via en annealing reaktion under anvendelse af to enkelte strenge. PcDNA3-vektoren blev anvendt til at generere en MCL1 overekspression plasmid. Fuldlængde humant MCL1 cDNA-sekvens blev amplificeret under anvendelse af PCR fra en cDNA-klon vektor og dernæst klonet ind restriktionsstederne anvendelse af primere.

Cellekultur

HeLa og SiHa cellelinjer blev opnået fra Cancer Research center i Harbin Medical University (Harbin, Kina). Hela-celler blev opretholdt i RPMI1640 (GIBCO) og SiHa-celler blev holdt i DMEM-medium, disse celler blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, Logan, UT), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

humant væv prøver

Tyve-seks par af kliniske prøver, herunder 26 menneske livmoderhalskræft vævssnit fra patienter med cervical cancer og tilsvarende hosliggende normalt væv, blev opnået fra First Affiliated Hospital, Harbin Medical University. Histologiske alle biopsier var pladecellekræft og stadier af kræft var fra III. De diagnoser af disse prøver blev kontrolleret af patologer.

Real-time RT-PCR analyse

Kvantitativ RT-PCR blev udført for at påvise de relative transkriptniveauer af miR-107. Kort beskrevet blev 3 pg små RNA ekstraheret og isoleret fra celler eller vævsprøver blev revers-transkriberet til cDNA med hårnåle-revers transkriptase-primer under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI). cDNA blev efterfølgende anvendt til amplifikation af MIR-107 og en endogen kontrol, U6 snRNA, via PCR. De MCL1 revers transkription (RT) -primer og qPCR primere blev syntetiseret af Sangon Biotech., Inc. (Shanghai, Kina). PCR-cykler var som følger: 94 ° C i 3 minutter efterfulgt af 40 cykler af 90 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s, og 74 ° C i 30 s. For at kvantificere MCL1 ekspression, 4 ug RNA ekstraheret fra celler eller vævsprøver blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af M-MLV revers transkriptase. PCR-cykler var som følger: 94 ° C i 3 minutter efterfulgt af 40 cykler af 96 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s, og 70 ° C i 30 s. SYBR green RCR blev udført tredobbelt under anvendelse af Bio-Rad Chromo 4 System Real-Time RCR detektor (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De relative genekspressionsniveauer blev beregnet. Alle primere blev indkøbt fra ABI.

Western Blotting

Western blotting blev udført for at bestemme MCL1 proteinekspression. Alle proteiner blev opløst på 10% SDS-denatureret polyacrylamidgel og blev derefter overført til en PVDF-membran. Membraner blev inkuberet med blokeringsbuffer i 80 minutter ved stuetemperatur og derefter inkuberet med et antistof mod MCL1 eller glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) med natten over ved 5 ° C. Membranerne blev vasket og inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof (AuGCT, Inc. (Beijing, Kina)). Proteinekspression blev vurderet ved forøget kemiluminescens og udsættelse for kemiluminescerende film. Lab Works Image Acquisition og Analysis Software (UVP) blev anvendt til at kvantificere band intensiteter.

Fluorescent Reporter Assay

HeLa og SiHa celler blev cotransficeret med PRI-miR-107 eller ASO-miR -107 i en 48-brønds plade efterfulgt af pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR reporter vektor eller pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR-mutant. En separat RFP ekspressionsvektor, pDsRed2-N1 (Clontech, Mountain View, CA) blev anvendt til normalisering. Cellerne blev lyseret 72 timer senere, og proteinerne blev høstet. De følgende vektorer blev cotransficeret ind i celler: dem, der indeholder EGFP reporter vektor alene, med pcDNA3 /primiR-107, eller bærer ASO-miR-107. PcDNA3 /EGFP, pcDNA3 eller ASO-NC blev brugt som kontrol vektorer. Intensiteten af ​​EGFP og RFP fluorescens blev detekteret med F-4500 Fluorescens spektrofotometer (Hitachi, Tokyo, Japan).

transfektionsassay

HeLa-celler (1 x 10

5 celler pr brønd) blev podet i 6-brønds kulturplader og dyrket natten over. Derefter celler blev transficeret med MIR-107 ekspressionsvektor (PRI-MIR-20a, 4 ug hver brønd) eller MIR-107 antisense-oligonukleotider (ASO-MIR-107). For SiHa-celler, 1 x 10

6 celler per brønd blev podet i 6-brønds kulturplader. 5 ug PRI-MIR-107 eller 500 pmol ASO-MIR-107 blev transficeret. Plasmidet pcDNA3 og det ikke-relative sekvens (ASO-NC) blev anvendt til negativ kontrol. Transfektion blev udført med lipofectamin 2000 Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Mediet blev udskiftet med nyt dyrkningsmedium 5h efter transfektion. 24 timer efter transfektion blev celler anvendt til cellelevedygtighed, celle kolonidannelse og in vitro migration og invasion-assays.

Vurdering af cellelevedygtighed og proliferationsevne

For at bestemme cellelevedygtighed og proliferativ kapacitet blev cellerne undersøgt ved brug af MTT og kolonidannelse assays som tidligere [17] beskrevne. Celler blev podet i 96-brønds plader ved enten 1 x 10

5 celler /brønd (HeLa-celler) eller 1,5 × 10

5 celler /brønd (SiHa-celler) og testet under anvendelse af MTT-assayet på forskellige tidspunkter. For kolonidannelse assayet, blev bestemt af antallet af levedygtige cellekolonier efter 10 dage (HeLa-celler, SiHa-celler) efter podning med 200 celler /brønd in triplo i 12-brønds plader. Cellerne blev farvet med krystalviolet. Kolonidannelse blev kvantificeret ved hjælp kolonien dannelse nummer.

Cell Migration og Invasion Analyser

For Transwell migration assay, 1 × 10

5 HeLa-celler eller 1,3 × 10

5 SiHa-celler i 200 pi RPMI 1640 uden FBS blev podet i den øvre del af hver Transwell kammer (porestørrelse på 8 um, Corning) indeholdende en ikke-coatet membran. For invasionen assay, 1 × 10

5 HeLa-celler eller 1,3 × 10

5 SiHa celler blev placeret på den øverste kammer i hver indsats belagt med 50 pi 2 mg /ml Matrigel vækstfaktor, og 500 pi RPMI 1640 med 20% FBS blev tilsat til den nedre del af kammeret. Efter inkubering i adskillige timer blev kamrene adskilles, og membranerne blev farvet med en 2% krystalviolet opløsning i 15 minutter og anbragt på en glasplade. Derefter blev celler, der var migreret over membranen talt i fem tilfældige visuelle felter ved brug af et lysmikroskop. Alle assays blev udført tre uafhængige gange in triplo.

Immunhistokemi

Immunofluorescens-assay blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåder tidligere beskrevet [18]. Snittene blev forbehandlet med mikrobølgebestråling, blokeret og inkuberet under anvendelse af polyklonalt kanin-anti-human MCL1 (Saier Biotechnology). Farvningsintensitet blev vurderet blev målt som tidligere beskrevet [18].

Cell Cycle Assay

Celler blev udpladet og transficeret med pcDNA3-MIR-107 eller pcDNA3-NC på dag 0, derefter reseeded på dag 1, og høstet på dag 2. prøver blev fikseret, farvet, og målt med flowcytometri efter indberettede protokoller.

flow Aytometry Analyse

Apoptose blev vurderet ved at måle membran omfordeling af phosphatidylserin med en annexin V-propidiumiodid apoptose afsløring kit (Sigma, USA). Desuden blev de propidiumiodid-farvede LoVo celler analyseret på et EPICS ELITE ESP flowcytometer (Beckman Coulter, USA).

Taxol regulerer ekspression af MCL1 af opregulere MIR-107

celleproliferation blev udført som tidligere beskrevet med modifikationer. For migrationen assay cellerne (2 × 10

5 celler /brønd) blev behandlet med taxol (0, 25, 50 og 100 uM) i 48 timer, derefter trypsiniseret og resuspenderet i serum-frit medium og 5 × 10

4 celler blev placeret i det øverste kammer i godt indsætte med 8 um porestørrelse polycarbonat membranfilter (Millipore). DMEM indeholdende 20% føtalt bovint serum blev anbragt i det nedre kammer. For invasionen assay de eksperimentelle procedurer ligner migration assay som beskrevet ovenfor, bortset brønden insertet blev overtrukket med 10 pi Matrigel (5 mg /ml; BD Biosciences, Bedford, MA). Efter inkubation i 24 og 48 timer ved 37 ° C i migration eller invasion assay hhv. Real-Time PCR blev udført og se beskrevne metoder for mere information. Dette forsøg blev udført to gange uafhængigt af hinanden.

miRNA Target Forudsigelse og statistiske analyser

miRNA target sites blev forudsagt ved hjælp af softwaren RNA22 online (https://cm.jefferson.edu/rna22v1.0/), Targetscan integreret med gNET algoritmer. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. Statistisk signifikans blev vurderet ved anvendelse af Student t-test. P 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

miR-107 Direkte mål MCL1

Vi først brugt de integrerede beregningsmæssige algoritmer af gNET metode med Targetscan (se fig S1.. i File S1) for at identificere genet-miRNA par betydeligt reguleret i livmoderhalskræft. Vi anvendte denne algoritme programmer til at forudsige MIR-107 binding direkte til 3′-UTR af MCL1. Dernæst blev virkningen af ​​MIR-107 på MCL1 ekspression valideret af MIR-107 gevinst og tab af funktioner. I begge HeLa og SiHa celler blev QRT-PCR udført for at validere miR-107 overekspression konstruktion eller miR-107 ASO, med pcDNA3 eller ASO-NC at være de respektive kontroller (fig. 1

A

). HeLa-celler blev co-transficeret med pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR rapport vektor og PRI-MIR-107 eller ASO-MIR-107. Som vist i fig. 1

B

, intensiteten af ​​EGFP fluorescens i PRI-MIR-107-gruppen var signifikant reduceret, mens der i ASO-MIR-107 forøgedes signifikant ved 48 timer efter transfektion. For at bestemme funktionen af ​​MIR-107 bindingssted konstruerede vi en yderligere EGFP reporter vektor indeholdende MCL1 3′-UTR med en mutant MIR-107 bindingssted. Som følge heraf hverken overekspression eller blokering af MIR-107 havde nogen indvirkning på intensiteten af ​​EGFP fluorescens i celler transficeret med 3′-UTR mutant vektor (fig. 1

C

). Tilsammen viste disse resultater, at MIR-107 binder direkte til 3′-UTR af MCL1 at undertrykke genekspression. Desuden har vi fastslået, om miR-107 undertrykker også endogene MCL1 udtryk på post-transkriptionel niveau, vi analyserede effekten af ​​miR-107 på endogene MCL1 mRNA og protein niveauer ved hjælp af QRT-PCR-analyse og Western blotting, hhv. I HeLa-celler, overekspression af MIR-107 resulterede i ca. 70% fald i MCL1 mRNA-niveauer (fig. 1

D

) og ca. 50% fald i proteinekspression (fig. 1

E

). Endvidere MCL1 mRNA og protein niveauer øgedes ca. 3 og 2 gange i henholdsvis HeLa-celler transficeret med ASO-MIR-107. Vi observerede lignende resultater i SiHa cellelinje (fig. 1,

D

og

E

). Disse data viste, at miR-107 negativt regulerer endogen MCL1 proteinekspression gennem mRNA nedbrydning og translationel undertrykkelse.

A, blev udtrykket niveau af miR-107 i HeLa og SiHa celler væsentligt ændret efter transfektion med enten pri-miR -107 eller ASO-mIR-107 ekspressionskonstruktioner som bestemt ved QRT-PCR under anvendelse af U6 snRNA til normalisering. B, blev intensiteten af ​​EGFP fluorescens i HeLa-celler transficeret med PRI-MIR-107 faldt efter 48 timer og øget efter transfektion med ASO-MIR-107. C, PRI-MIR-107 og ASO-MIR-107 havde ingen virkning på intensiteten af ​​EGFP fluorescens i celler transficeret med 3′-UTR mutant vektor. MRNA’et (D) eller protein (E) niveauer af MCL1 i HeLa og SiHa-celler nedsat eller øget sammenlignet med kontrolgruppen, når PRI-MIR-107 blev overudtrykt eller blokeret, henholdsvis (*,

s Restaurant 0,005)

miR-107 inhiberer migration og invasion

Vi udførte MTT, kolonidannelse, celle migration, og invasivitet assays under anvendelse HeLa og SiHa-celler transficeret med enten PRI-mIR-107 eller ASO-mIR-107 plasmider at bestemme virkningerne af mIR-107-ekspression

in vitro

. MTT og kolonidannelse assays viste en statistisk signifikant reduktion i cellelevedygtighed og proliferation af PRI-MIR-107-transficerede celler i forhold til kontrolgruppen, hvorimod ASO-MIR-107 tydeligvis øget disse egenskaber i HeLa-celler (fig. 2

A, B

og fig. S2A i File S1). Transwell assay uden Matrigel (fig. 2

C

og

fig. S2B i File S1) viste, at MIR-107 overekspression reduceret migration i HeLa-celler med 60%, og transfektion af ASO-miR -107 øget migration ved cirka to gange sammenlignet med kontrol- celler. Endvidere overekspression af MIR-107 resulterede i en signifikant reduktion i den invasive potentiale af HeLa-celler i sammenligning med kontrolceller i Transwell assay med Matrigel, og celler transficeret med ASO-MIR-107 havde en signifikant stigning i deres invasive potentiale (fig. 2

D

og fig. S2C i File S1). Lignende resultater blev opnået med SiHa cellelinje (Fig.2,

A

–

D

). Disse data tyder på, at miR-107 hæmmer celledeling, migration, og invasivitet i HeLa og SiHa celler

in vitro

.

livmoderhalskræft celler blev transficeret med enten pri-miR-107 eller ASO- mIR-107. Cellelevedygtighed blev bestemt ved 24, 48 og 72 timer efter podning i 96-brønds plader ved anvendelse af MTT-assayet.

En

, histogrammet viser data på det tidspunkt på 48 t. Alle tre datapunkter viste en signifikant forskel.

B

livmoderhalskræft celler blev transficeret med PRI-MIR-107 eller ASO-MIR-107 og derefter podet i plader med 12 brønde. For kolonidannelse assayet blev cellerne farvet med 2% krystalviolet opløsning og et repræsentativt billede vises.

C

D

, migration og invasion blev udført med HeLa og SiHa celler transficeret med enten pri-miR-107 eller ASO-miR-107. Repræsentative billeder og tilfældigt udvalgte felter er vist. Knockdown af MCL1 undertrykker proliferation, migration, og invasivitet af livmoderhalskræft celler.

E

, MCL1 proteinniveau blev målt ved Western blotting 48 timer efter transfektion af SIR-MCL1 ind i HeLa og SiHa celler. GAPDH blev brugt som læsning /overførsel kontrol (

Ctrl

) og for normalisering af værdier.

F

og

G

, virkningerne af MCL1 knockdown på cellernes levedygtighed (

F

) blev bestemt ved hjælp af MTT-analysen, og celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af koloni dannelse assay (

G

).

H

jeg

, ændringer i celle migration og invasionsevne induceret af SIR-MCL1 blev bestemt ved migration og invasion assays. (*, P 0,05, **, p 0,005).

Knockdown af MCL1 Forhindrer spredning, migration og invasion

Funktionen af ​​MCL1 i HeLa og SiHa celler var undersøgt under anvendelse RNA-interferens. HeLa og SiHa-celler blev transficeret med siRNA målretning MCL1. Western blotting blev brugt til at evaluere effekten af ​​siRNA på MCL1 protein inhibering. Som vist i fig. 2

E

, Sir-MCL1 forårsagede en statistisk signifikant reduktion af MCL1 protein niveauer, op til ca. 60% i HeLa-celler og 50% i SiHa celler. Hæmning af MCL1 udtryk faldt levedygtighed (fig. 2

F

) og kolonidannelse (fig. 2

G

) af livmoderhalskræft celler sammenlignet med kontrol celler. Desuden knockdown af MCL1 udtryk resulterede i et signifikant fald i antallet af celle migration (fig. 2

H

) og invasion (fig. 2

jeg

). Disse resultater viste effekten af ​​MCL1 knockdown på celleproliferation, migration og invasion, som er i overensstemmelse med den virkning, miR-107 overekspression i både HeLa og SiHa celler.

Restaurering af MCL1 modvirker Effekter af miR-107 Expression

for at bekræfte, at virkningerne af miR-107 på proliferation, migration, og invasivitet af HeLa og SiHa celler medieres gennem MCL1, vi konstrueret en pcDNA3 /MCL1 vektoren indeholdende MCL1 ORF uden 3′ UTR at undgå indflydelse af miRNA. Transfektion af HeLa og SiHa celler med dette MCL1 ORF udtryk konstruktion vendt de negative virkninger af miR-107 på MCL1 protein niveauer (fig. 3

A

). Hæmningen af ​​celleproliferation (fig. 3

B

), kolonidannelse (fig. 3

C

og fig. S3A i File S1), migration (fig.3

D

og fig. S3B i File S1), og invasivitet (fig. 3

E

og fig. S3C i File S1) forårsaget af PRI-mIR-107 blev ophævet i celler co-transficeret med pcDNA3 /MCL1 vektor. Over-ekspressionen af ​​MCL1 imødegås effekten af ​​miR-107 på celleproliferation, migration og invasivitet af HeLa og SiHa celler.

(A)

, celler blev cotransficeret med pcDNA3 /MCL1 vektor, som ikke indeholdt 3′-UTR af MCL1, med eller uden PRI-mIR-107 vektor. (

B

–

D)

, ved 48 timer efter transfektion blev MCL1 proteinniveauet målt ved Western blotting. MTT assay (

B

), kolonidannelse assay (

C

), transwell analyser uden Matrigel (

D

), eller Transwell assays med Matrigel (

E

) blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed, vækst kapacitet og potentiale for cellemigrering og invasion hhv. (

F

) ATR og ATM mRNA niveauer blev overvåget af QRT-PC R på de angivne tidspunkter efter miR-107transfection. GADPH blev anvendt til normalisering. Data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse (SE) fra tre uafhængige forsøg. (

G

) Western blot-assay viste, at efter MIR-107 overekspression blev ATR opreguleret, derefter phosphorylering af Chk1 blev forøget, men phosphorylering af Chk2 var ingen forskel. (H, I og J) blev cellecyklusfordeling evalueret i celler transficeret med negativ kontrol, MIR-107 eller MCL1 ved propidiumiodid-farvning og flowcytometri 24 timer efter transfektion.

N

O

, den relative ekspression af miR-107 (

K

) og MCL1 (

L

) i de 15 par, herunder livmoderhalskræft cancer væv og matchede normale væv, blev bestemt under anvendelse QRT-PCR.

M

, udtryk for MCL1 i livmoderhalskræft væv og normale væv ved immunhistokemi (

n

= 12).

N

, skematiske repræsenterer miR-107-medieret regulering af MCL1 udtryk under kræft progression. Model af modificeret ATR /Chk1 pathway, i hvilken MIR-107 og MCL1 er involveret. Data repræsenterer middelværdier ± SE fra tre uafhængige forsøg. Signifikans blev bestemt ved t-test:. * P 0,05, ** p 0,005

miR-107 Aktiverer ATR /Chk1 Pathway

For at verificere, at uanset om miR-107 kunne aktivere DNA skader veje, vi overvågede mRNA niveau af ATR og ATM (fig. 3

F

). Gain af pri-miR-107 massivt inducerede ekspression af ATR, men ikke ATM på mRNA-niveau. Lignende resultater blev observeret ved proteinniveau (fig.3

G

). Sammenlignet med kontrol, blev ATR protein øges, når primiR-107 blev overudtrykt. Vi overvåges også aktiveringen af ​​Chk1 og Chk2, en nedstrøms gen af ​​ATR og ATM. Som vist i fig. 3

G

, Chk1 blev dramatisk phosphoryleret efter pri-miR-107 overekspression, men der var ingen signifikant ændring i fosforylering af Chk2. Da aktivering af Chk1 normalt resulterer i G1 anholdelse, vi testede cellecyklus profil med flowcytometri (fig. 3

H

,

jeg

og

J

). Tilsvarende blev cellerne i S-fase faldt sammen med MIR-107 overekspression hvorimod der var ingen signifikant ændring i G2 /M-fasen. Alle disse data tyder på at øget miR-107 inducerer G1 anholdelse ved at aktivere ATR /Chk1 vej.

Angivelse af miR-107 og MCL1 i livmoderhalskræft og normalt væv

At påvise ekspressionen af ​​miR -107 i humane livmoderhalskræft væv, blev QRT-PCR assay udført på femten parrede prøver af livmoderhalskræft og tilstødende normale væv. miR-107 blev udtrykt på et lavere niveau (fig. 3

K

), mens MCL1 blev udtrykt på et væsentligt højere niveau i tumorvæv sammenlignet med de tilsvarende normale væv (Fig. 3

L

). I denne indstilling, vi udnyttet en immunhistokemisk analyse for yderligere at detektere MCL1 ekspressionsniveauet i humane livmoderhalskræft væv og tilstødende normale væv. Som vist i fig. 3

M

, ekspressionsniveauerne af MCL1 var væsentligt højere end i tilstødende normale væv, hvilket yderligere understøtter, at miR-107 negativt regulerer MCL1. Den arbejder model af MIR-107-MCL1 interaktion under cancer progression blev vist i fig. 3

N

. Denne opdagelse giver indsigt i, hvordan MCL1 ekspression reguleres, og foreslår terapeutiske mål til redning funktion MCL1 protein oftest forbundet med human livmoderhalskræft.

Taxol blænder Migration og Invasion af livmoderhalskræft

i denne undersøgelse undersøgte vi cytotoksiciteten af ​​taxol ved behandling af livmoderhalskræft celler med forskellige koncentrationer af taxol i 24 eller 48 timer. Resultater fra MTT assay viste, at taxol ikke var signifikant toksisk for HeLa og SiHa (fig. 4

A

) celler i koncentrationer op til 100 uM i 24 til 48 timer. Denne serie af koncentrationer blev derfor anvendt i alle efterfølgende forsøg. Tumorceller løsnes fra naboceller ved at frigive deres intercellulære junctions under metastase, og den ekstracellulære matrix er proteolytisk nedbrudt til at tillade migration og invasion af cancerceller. At undersøge effekten af ​​taxol på malignitet af cervikale cancerceller, migrationen og invasion evner af HeLa og SiHa-celler blev bestemt. I cellemigrationsassay, HeLa-celler behandlet med 50 og 100 uM taxol viste et signifikant fald i motilitet henholdsvis og lignende resultat blev også observeret i SiHa-celler med inhibering (fig. 4

B

). I celleinvasion assayet blev taxol vist at reducere celleinvasion i en koncentrationsafhængig måde. Ved 50 pM blev invasion reduceret med 46,12% og 61,24%, og ved 100 uM, blev invasion reduceret med 50,04% og 80,11% i HeLa og SiHa-celler, (fig. 4

C

). Disse resultater viste, at taxol signifikant inhiberede migration og invasion af livmoderhalskræft celler under ikke-toksiske koncentrationer.

(

A

) Den kemiske struktur af taxol. (

B

) HeLa-celler og SiHa-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af taxol i 24 og 48 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. Plottet viser relative cellelevedygtighed sammenlignet med ubehandlede (0 uM) celler. HeLa og SiHa-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af taxol i 48 timer. Efterfølgende vandrende (

C

) og invasive (

D

) evne til celler efter hver behandling blev bestemt som beskrevet i materialer og metoder. De nederste afbildninger var de relative celleantal sammenligne som hos ubehandlede (0 uM) celler. Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af taxol i 48 timer. (

E

) det konditionerede medium fra hver behandling blev opsamlet, og MCL1 aktivitet blev bestemt ved kaseinzymografi. (

F

) Cellelysat blev anvendt til at bestemme proteinniveauer af MCL1 ved Western blotting. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. (

G

) Apoptose analysen viste, at taxol undertrykt celle apoptose og G1 anholdelse. (

H

) den relative ekspression af miR-107, (

jeg

) arbejderklassen model af Taxol regulerer ekspressionen af ​​MCL1 ved at nedregulere miR-107. Barer viser værdien som middelværdi ± S.E. fra tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P. 0,005, sammenlignet med de ubehandlede celler

Taxol Hæmmer Angivelse af MCL1

For at undersøge den mulige underliggende anti-metastatisk effekt af Taxol, udtryk for MCL1 i livmoderhalskræft celler behandlet med forskellige koncentrationer af taxol blev undersøgt. Som vist i den caseinolytiske aktivitet assay MCL1 aktivitet faldt på en dosis-afhængig måde efter behandling med taxol. Kvantificering analyse angav at MCL1 aktivitet faldt med 20,2%, 60,1% og 85,4% i HeLa-celler, og ved 40,5%, 70,8% og 84,2% i SiHa-celler, når celler blev behandlet med 25, 50 og 100 uM af taxol, (fig. 4

D

). Western blot-analyse blev udført for at undersøge protein ekspression af MCL1 i cervicale cancerceller. Sammenlignet med kontrolgruppen i begge to livmoderhalskræft linjer testede, taxol inhiberede protein ekspression af MCL1 på en dosisafhængig måde (fig. 4

E

). Som vist i fig. Fig. Fig. Fig.