PLoS ONE: Virkning af Sulindac Sulfid på Metallohydrolases i human coloncancer cellelinie HT-29

Abstrakt

Matrix metalloproteinase 7 (MMP7), en metallohydrolase involveret i udviklingen af ​​flere kræftformer, nedreguleres i

Apc

Min /+

tyktarmskræft musemodel efter sulindac behandling. For at afgøre, om denne virkning er relevant for den menneskelige tilstand, blev HT-29 humane kolon kræftceller behandles med sulindac og dets metabolitter, og sammenlignet med resultaterne fra

in vivo

musestudier. Udtrykket af

MMP7

blev overvåget. Resultaterne viste, at sulindac sulfid effektivt nedreguleret både

MMP7

udtryk og aktivitet. Desuden aktivitetsbaserede proteomics demonstreret, at sulindac sulfid faldet drastisk aktiviteten af ​​leukotrien A4 hydrolase i HT-29 celler som afspejles af et fald i niveauet af sit produkt, leukotrien B4. Denne undersøgelse viser, at effekten af ​​sulindac behandling i en musemodel for tyktarmskræft kan være relevant for den menneskelige modstykke og fremhæver effekten af ​​sulindac behandling på metallohydrolases

Henvisning:. Guillen-Ahlers H, Tan J, Castellino FJ, Ploplis VA (2011) Effekt af Sulindac sulfid på Metallohydrolases i human coloncancercellelinie HT-29. PLoS ONE 6 (10): e25725. doi: 10,1371 /journal.pone.0025725

Redaktør: Matthew Bogyo, Stanford University, USA

Modtaget: Februar 3, 2011; Accepteret: 9. september 2011; Udgivet: Oktober 3, 2011

Copyright: © 2011 Guillen-Ahlers et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (National Heart, Lung, og Blood Institute) tilskud PO1HL07375 (til FJC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID), såsom sulindac, er kemo-forebyggende reagenser mod tarmkræft [1], [2], [3]. Denne effekt er i overensstemmelse med observationer

in vitro

i humane colon cancerceller [4], samt

in vivo

i

Apc

Min /+

mus model, hvor et stort fald i tumorbyrde observeres [5]. De gastrointestinale komplikationer, der udvikles i NSAID-brugere er veldokumenterede [6], og udgør en hindring i brugen af ​​disse lægemidler som kemo-forebyggende midler. De pleiotrope virkninger af sulindac om forebyggelse tyktarmskræft er stadig uklart, og hindre udviklingen af ​​mere specifikke behandlinger med mindskede bivirkninger. Med hensyn til dette spørgsmål, er det blevet påvist, at sulindac behandling forårsager ændringer i ekstracellulære matrix remodeling begivenheder, herunder nedregulering af matrixmetalloproteinase 7 (

MMP7

) i tarm adenomer af

Apc

Min /+

mus [7].

MMP7 tilhører en gruppe af metal ion-afhængige proteaser. Ifølge MEROPS database (www.merops.sanger.uk), matrix-metalloproteaser (MMP’er), der består af 24 medlemmer, omfatter M10-underfamilien af ​​MA familien af ​​metallohydrolases klan M. MMP’er er blevet stærkt impliceret i udviklingen af ​​mange cancere. Sletning af

MMP2

MMP9

i mus har vist sig at reducere bugspytkirtlen tumorigenese ved at reducere angiogenese [8]. Relevante for denne undersøgelse,

MMP7

sletning i

Apc

Min /+

mus har vist sig kraftigt reducere tarm tumor byrde [9]. Disse observationer implicerer MMP7 som en levedygtig mål for udviklingen af ​​nye behandlingsregimer.

Den aktuelle undersøgelse bestemmes effekten af ​​sulindac behandling på MMP7 i den menneskelige coloncancercellelinie, HT-29, og udnyttes en global tilgang at opdage ændrede aktiviteter i andre metallohydrolases. Resultaterne af disse undersøgelser er beskrevet heri.

Materialer og Metoder

Cell kultur

HT-29-celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA) blev opretholdt i McCoys 5A-medium (Gibco, Grand Island, NY) med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en atmosfære af 95% luft /5% CO

2. Sulindac, sulindac sulfid, og sulindac sulfon blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Disse lægemidler blev fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO). DMSO blev tilsat til medierne til en slutkoncentration på 1%, og cellerne blev dyrket i 6-brønds plader. Når cellerne var 80% konfluente, blev de behandlet med forskellige koncentrationer af sulindac og dets metabolitter. Efter 24 timer blev cellerne trypsineret og levedygtige celler talt under anvendelse af trypanblåt-metode.

Genekspression

HT-29-celler, på tidspunktet for høst, blev trypsinbehandlet, centrifugeret, og den cellepellet anvendes til at udvinde RNA efter Qiagen-protokollen. Koncentration og kvalitet af prøverne blev vurderet ved anvendelse af den spektrale profil opnået fra NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Real-time reverse transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) blev udført som tidligere beskrevet [7]. Primere og prober specialiteter til human

MMP7

,

MMP25

,

Trypsin1

, og

RPL-19

er vist i tabel 1.

for RT-PCR undersøgelser, totalt RNA blev ekstraheret fra HT-29-celler, der er behandlet med DMSO eller 100 uM sulindac sulfid i 24 timer under anvendelse af Qiagen-protokollen. RT-PCR-reaktion indeholdt 2,5 x Hotmaster Mix (5 Primer Inc., Gaithersburg, MD), RNase Inhibitor, Multiscribe RT-enzym, passiv henvisning farvestof ROX, og Sybr Green. Totalt RNA (25 ng) blev revere-transkriberet i 30 pi reaktionsblanding ved 48 ° C i 30 minutter. De følgende betingelser blev anvendt til amplifikation: pre-denaturering i 5 minutter ved 95 ° C, 30 cykler af denaturering ved 95 ° C i 20 sekunder, annealing ved 59 ° C i 20 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 25 sek. PCR-produkter blev separeret ved elektroforese på en 3% agarosegel indeholdende ethidiumbromid. En 50 bp DNA-stige (Promega, Madison, WI) blev anvendt som molekylvægtmarkør.

Western blotting

proteomer blev ekstraheret fra HT-29-celler og derefter behandlet med sulindac sulfid (100 uM) i 24 timer ved 80% konfluens. Celler blev trypsinbehandlet, centrifugeret og derefter vasket i PBS. Cellepellets blev derefter Dounce homogeniseret og sonikeret. Den proteom blev centrifugeret ved 100.000 ×

g

at adskille cytosoliske og membran fraktioner. Det udskilte fraktion blev opnået ved centrifugering af cellen medier ved 100.000 ×

g

. Proteomet blev udfældet ved tilsætning af ammoniumsulfat. Prøver blev passeret over en PD-10 afsaltningskolonne (GE Healthcare, Piscataway, NJ) og proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Prøver var belastning på en 10% polyacrylamidgel, elektroforese, og derefter overført til en PVDF-membran. Membranerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med polyklonalt kanin-anti-humant MMP7 (Abcam, Cambridge MA), og polyklonalt kanin-antihuman aktive MMP7 (Abcam) ved 1 ug /ml i blokeringsbuffer (PBS, 3% fedtfri tørmælk , 0,1% Tween 20). For MMP25 og α-tubulin, kanin-anti-human MMP25 (Abcam) og muse-anti-humant α-tubulin (Santa Cruz Technology), henholdsvis blev anvendt. HRP-konjugeret anti-kanin IgG-antistof eller HRP-konjugeret-anti-muse-IgG (Cell Signaling Technology, Boston MA) i blokerende buffer blev anvendt som det sekundære antistof. Blots blev udviklet ved hjælp af LumiGLO reagenser (Protein Research Products, Gaithersburg, MA) eller den vestlige Lightning ECL Substrat (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA).

Aktivitet-baserede proteomics til identifikation af aktiverede metallohydrolases

proteomer blev justeret til en koncentration på 1 mg /ml i PBS. En cocktail af alkyn sonder målrettet det aktive site i metallohydrolases var en generøs gave af Benjamin F Cravatt (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA). Mærkning blev udført som tidligere beskrevet [10]. Kort beskrevet prober blev tilsat til en slutkoncentration på 1 uM og inkuberet under UV-lys i 1 time. Rhodamin azid blev derefter bundet til proberne under anvendelse click-kemi-[11]. Prøverne blev underkastet elektroforese på en 10% polyacrylamid gel og scannet ved hjælp af enten en Hitachi FMBio IIe flatbedscanner (MiraBio, Alameda, CA) eller KODAK In-vivo Multispektral System FX (Carestream Health, Rochester, NY).

Identifikation af aktivitetsbaserede mærkede proteiner

Real-size gel scan prints blev brugt som skabelon til at udtrække de ønskede bands og scannet bagefter for at sikre korrekt udskæring af gelen. Hver gel plug blev reduceret med 10 mM dithiothreitol i ammoniumbicarbonat og alkyleret med 55 mM iodacetamid. Prøver blev fordøjet med 0,1 ug trypsin (Promega, Madison, WI) i 100 pi 10 mM ammoniumbicarbonat og inkuberet natten over ved 37 ° C. Tryptiske peptider blev ekstraheret fra gel stikpropper med 50% acetonitril /49,9% H

2O /0,1% trifluoreddikesyre efterfulgt af 100% acetonitril og til slut med 0,1% trifluoreddikesyre.

tryptiske peptider blev kromatograferet på en 100 um × 10 cm C18-søjle (partikelstørrelse: 5 um) og elueret under anvendelse af en lineær gradient på 3 til 45% acetonitril i H

2O over 70 minutter ved stuetemperatur, ved en strømningshastighed på 500 nl /min. Eluenten var elektro-sprøjtet ind i lineære kvadrupol ion trap (LTQ) massespektrometer (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA). SEQUEST og X! Tandem algoritmer blev anvendt til at søge i databasen udnytte den internationale protein indeks (IPI) muse-database.

leukotrien B4 enzymimmunassay

Ved 80% sammenløb, HT-29-celler blev inkuberet med enten sulindac sulfid eller DMSO i 24 timer. Det udskilte proteom opnået og koncentreres ved vakuum centrifugering. Proteomer blev justeret til 5 mg /ml og LTB4 kvantificeret med et enzymatisk immunassay kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).

Resultater Salg

Den reducerede metabolit af sulindac, sulindac sulfid, selektivt forøger celledød af HT-29-celler

HT-29-celler blev behandlet med sulindac, sulindac sulfid, og sulindac sulfon ved koncentrationer fra 10 til 1000 pm (figur 1). Starter ved 250 uM, sulindac sulfid signifikant øget celledød og nåede 100% celledød ved 500 uM. I modsætning hertil sulindac og sulindac sulfon ikke kunnet øge celledød, selv når lægemidlerne hvor der er tilsat på mM koncentrationer.

80% konfluens, blev celler behandlet med stigende koncentrationer af sulindac (grå), sulindac sulfid ( hvid), og sulindac sulfon (sort).

sulindac sulfid reducerer

MMP7

på mRNA, protein og aktivitetsniveau

det blev rapporteret, at to dage af sulindac behandling er tilstrækkelig til at nedregulere MMP7 i tumorer i

Apc

Min /+ Salg mus [7]. For at afgøre hvilken metabolit faktisk formindskes MMP7, blev HT-29-celler behandlet med sulindac og dets metabolitter ved 100 uM, en fusion ikke toksisk for cellerne som påvist i figur 1, i 24 timer. Udtrykket profil

MMP7

blev sammenlignet med resultaterne tidligere opnåede i musestudier (figur 2A). Kun den aktive metabolit, sulindac sulfid, var i stand til væsentligt at reducere udtryk for

MMP7.

En titreringskurve ved hjælp af forskellige koncentrationer af sulindac sulfid afslørede, at selv ved 50 uM,

MMP7

viste en lille (14%), men statistisk signifikant nedregulering af ekspression (p = 0,044) (figur 2B). Ved 100 uM blev et fald på 65% observeret (p = 0,000001). Forskellen mellem 100 pM og 200 pM var mindre dramatisk (11%), men var stadig signifikant forskellig mellem disse to koncentrationer (p = 0,017).

(A) Real time RT-PCR af RNA fra HT 29 celler efter 24 timers behandling med DMSO, sulindac (S), sulindac sulfid (Sd) og sulindac sulfon (SN). Resultaterne blev opnået ved hjælp af den ΔΔCt metoden med

hRPL-19

som husholdning genet. C

T værdier mellem 20.10 og 20.56 på tværs af alle prøverne viser konstante niveauer af

hRPL-19

udtryk. (B) Udtrykket af

hMMP7

efter 24 timers sulindac behandling. Den nedregulering af

hMMP7

var signifikant ved alle koncentrationer. Resultaterne blev opnået ved hjælp af den ΔΔCt metoden med

hRPL-19

som husholdning genet. C

T værdier mellem 23,22 og 23,56 på tværs af alle prøverne viser konstante niveauer af

hRPL-19

udtryk. (C) Cytosolisk, membran og udskilte proteomanalyse fraktioner ekstraheret fra DMSO og sulindac sulfid-behandlet HT-29-celler blev underkastet western blot-analyse under anvendelse af et antistof, som ikke skelner mellem aktiv og inaktiv MMP7 (top), og et antistof, der kun genkender det aktive sted (nederst). Den forventede bånd for MMP7 vises ved 28 kDa, men et bånd ved 45 kDa er ofte rapporteret, muligvis en dimer. Cyto betegner cytosoliske fraktion; Mem, membranfraktion, secr, secerneret fraktion, og aMMP7, aktiv MMP7.

Western blotting af MMP7, samt det aktive sted i MMP7, blev udført på cytosoliske, membran og udskilte fraktioner af HT-29 proteomer efter 24 timers af sulindac sulfid behandling ved 100 uM (Figur 2C). I begge tilfælde blev MMP7 kun fundet i de udskilte fraktioner af proteom. Sulindac sulfid behandling viste en klar reduktion af MMP7 i det secernerede fraktion ved en 100 uM koncentration. Western blot-analyse målretning det aktive sted i MMP7 afslørede en fuldstændig forsvinden af ​​påviselige aktive MMP7 efter sulindac sulfid behandling.

For at bestemme om andre MMP’er, Andre klasser af proteaser og husholdning gen, RPL-19, påvirket af sulindac i HT-29-celler, RT-PCR (hele celleekstrakter) og Western blot (udskilt, cytosoliske, og fraktioner) analyser blev udført. mRNA for MMP25, trypsin1, og RPL-19 blev ikke ændret efter sulindac sulfid behandling (figur 3A, B). Western blot analyse af membranfraktionen af ​​disse celler bekræftede RT-PCR resultater for MMP25 (figur 3C).

(A) PCR-produkt af RT-PCR af RNA fra HT-29-celler efter 24 timers behandling med DMSO eller sulindac sulfid. Bane 1, 50 bp DNA-stige; bane 2,

MMP25

efter sulindac sulfid behandling; bane 3,

MMP25

efter DMSO behandling; bane 4,

Trypsin1

efter sulindac sulfid behandling; bane 5,

Trypsin1

efter DMSO behandling; bane 6,

MMP7

efter sulindac sulfid behandling; bane 7,

MMP7

efter DMSO behandling; bane 8

RPL-19

efter sulindac sulfid behandling; bane 9,

RPL-19

efter DMSO behandling. Resultaterne viser, at kun

MMP7

udtryk påvirkes af sulindac sulfid behandling. (B) Kvantitativ RT-PCR af

MMP25

,

Trypsin1

, og

MMP7

efter DMSO eller sulindac sulfid behandling. Resultaterne blev opnået ved hjælp af den ΔΔCt metoden med

hRPL-19

som husholdning genet. Resultaterne indikerer kvantitative forskelle i

MMP7

udtryk efter sulindac sulfid behandling i forhold til DMSO behandling. (C) Western blot af udskilt brøkdel af HT-29 celler, der viser, at protein niveauer af MMP25 i membranfraktionen er ens mellem sulindac sulfid og DMSO behandlede celler.

Aktivitetsbaseret protein profilering målretning metallohydrolases afslører en formindskelse i LTA4H aktivitet

proteomer ekstraheret fra HT-29-celler efter 24 timer af behandlingen med sulindac sulfid eller DMSO blev mærket med en probe cocktail målretning metallohydrolase superfamilien og kørt på en 1D gel. Et stærkt bånd mellem 60 og 65 kDa blev observeret i HT-29-celler behandlet med DMSO. Sulindac sulfid-behandlede celler viste et svagt bånd af tilsvarende molekylvægt. Båndene blev udskåret og analyseret ved massespektrometri. Prøverne blev kørt ved lineær kvadrupol MS /MS (figur 4), og resultaterne matcher med MEROPS database for metallohydrolases. Der var to peptider (LTYTAEVSVPK og LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK) opdaget i -70 kDa band, der matchede leukotrien A4 hydrolase (LTA4H). Den forudsagte molekylvægt LTA4H er 69 kDa. LTA4H har tidligere vist sig at være et mål for denne metalloprotease probe cocktail (10). Salg

Metallohydrolase aktivitetsbaseret mærkning af HT-29-celler secernerede proteomer. MMP2 og MMP7 standarder blev tilsat til celle- proteomer (pile). Bandet viser et kraftigt fald (*) efter sulindac sulfid behandling blev ekstraheret og analyseret ved massespektrometri. MS /MS spektre af LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK og LTYTAEVSVPK peptider svarede til aminosyrerne 366-386 og 155-165, henholdsvis, af LTA4H proteinet. Proteinindhold tværs af alle prøverne blev justeret til 1 mg /ml, og svarer til 15 ug proteom blev tilsat per bane. MW betegner molekylvægt; Kønssygdomme, standarder, Sd, sulindac sulfid-behandlede og D, DMSO-behandlet.

For at validere reduktionen i LTA4H aktivitet, blev en enzymatisk immunassay bruges til at måle leukotrien B4 (LTB4) niveauer efter sulindac behandling (figur 5). Sulindac sulfid-behandlede celler viste stærkt reducerede niveauer af LTB4 i forhold til DMSO-behandlede celler.

Udskilte proteomer DMSO-behandlede og sulindac sulfid-behandlede celler blev analyseret for LTB4 niveauer ved hjælp af en enzymatisk immunassay.

diskussion

Den foreliggende undersøgelse viste, at sulindac sulfid er i stand til at reducere RNA og protein niveauer af MMP7, hvilket er i overensstemmelse med, hvad der blev observeret i mus undersøgelser [7]. Gennem aktivitetsbaseret protein profilering, blev det påvist, at sulindac sulfid drastisk reducerer aktiviteten af ​​LTA4H. Dette resultat blev bekræftet af nedsatte niveauer af LTB4.

Inddragelsen af ​​metalloproteaser i tyktarmskræft er tidligere blevet identificeret, men udviklingen af ​​behandlingsstrategier målrettet disse enzymer har tabt sagen [12]. Et problem er den lave specificitet metalloproteaseinhibitorer, der har gjort det til kliniske forsøg. MMP7 har imidlertid konsekvent vist sig at være relevant i tyktarmskræft og dens dyremodeller [9], [13]. Den foreliggende undersøgelse viste, at sulindac sulfid er i stand til at reducere ekspressionen af ​​

MMP7

i den menneskelige coloncancercellelinie HT-29, som også blev observeret,

in vivo

, i

Apc

Min /+

mus [7]. For at afgøre, om andre MMP’er eller andre klasser af proteaser blev også ændret, MMP25, en membran-associeret MMP der er stærkt udtrykt i cancerceller [14], og trypsin1 blev analyseret og viste sig at være upåvirket af sulindac sulfid behandling. Derudover husholdning gen RPL-19 blev heller ikke påvirket af denne NSAID. Nobiletin, en anden agent med anticancer egenskaber, er også blevet vist at nedregulere

MMP7

[15] i HT-29-celler. Adskillige mekanismer er blevet foreslået, hvorved MMP7 fremmer tumorvækst. Flere af disse undersøgelser link MMP7 med et afbrudt Fas-medieret apoptotisk respons [16], [17], [18], og er blevet foreslået inflammation-relaterede lettelse af tumorvækst at være forårsaget af MMP7 spaltning af Fas-ligand [19].

Zink metallopeptidaser består af 12 medlemmer og hører til familien af ​​metallohydrolases. Disse proteaser har været impliceret i flere kræftformer, herunder aminopeptidase N i tyktarmskræft [20], cystinyl aminopeptidase i nyrekræft [21], og LTA4H i lunge- og colon adenokarcinomer [22]. Dette er den første undersøgelse, der forbinder sulindac at regulere LTA4H. Den nedregulering af aktiviteten af ​​LTA4H, og fald i tumor byrde, efter sulindac behandling understøtter undersøgelser, hvor det er blevet vist at være opreguleret i tyktarmskræft. Endvidere [6] -gingerol, en naturlig bestanddel med antitumorigenic egenskaber, har vist, at undertrykke cancervækst ved LTA4H inhibering [23]. Faldet i LTA4H aktivitet blev valideret af den iagttagelse, at lavere LTB4 niveauer blev fundet efter sulindac behandling. LTB4 er et velkendt eicosanoid med kemotaktiske egenskaber og har vist sig at stimulere proliferation,

in vitro

, HT-29 coloncancer-celler [24].

Der er ikke andre rapporter af inddragelse af sulindac eller andre NSAID, om MMP7 eller LTA4H udtryk. Men i indledende undersøgelser, har vi vist, at sulindac er ikke den eneste NSAID i stand til at nedregulere

MMP7

, dvs. aspirin (data ikke vist), hvilket tyder på, at

MMP7

nedreguleres af en delt NSAID mekanisme [7], [25] og ikke en unik egenskab af sulindac.

sammenfattende nærværende undersøgelse identificeret to kandidater, der tidligere er rapporteret til at være yderst relevante i tumor udvikling, der er ændret efter sulindac behandling . Nye behandlingsmetoder selektivt at målrette MMP7 og LTA4H, enkeltvis eller i kombination, giver nye terapeutiske metoder, der udnytter fordelene ved sulindac behandling, men potentielt uden de negative bivirkninger af dette stof.

Tak

forfatterne takker Benjamin Cravatt (Scripps Research Institute, La Jolla CA) for alkyn sonder målrettet det aktive site i metallohydrolases og Sherry Niessen og Eranthie Weerapana (Scripps Research Institute, La Jolla CA) til teknisk bistand med proteomics eksperimenter.